用于口腔护理产品的酶促过酸生产

摘要

本文所公开的是使用基于过酸的有益剂处理口腔表面的组合物和方法。所述过酸有益剂可用于口腔表面的漂白、美白、消毒、脱色、除臭、减少或除去生物膜、以及它们的组合。使用具有过水解活性的CE-7糖酯酶(过水解酶)，在过氧源存在的情况下从羧酸酯底物中酶促制备所述过酸。融合蛋白包含直接地或通过任选的接头联接到对口腔表面具有亲和力的肽组分上的过水解酶，它可用于靶向所述过水解活性到所述口腔表面上。

说明书

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求2010年12月20日提交的美国临时专利申请 61/424,903的权益，该专利全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及包含至少一种用作口腔护理有益剂的过酸的个人护理产品 领域。过酸在至少一种适宜的羧酸酯底物和过氧源存在的情况下酶促产生。 具体地，具有过水解活性的酶催化剂用于制备过酸有益剂，其用于口腔护理 产品。过水解酶可为经工程化以包含至少一个肽组分的融合蛋白(“靶向过 水解酶”)形式，所述肽组分具有对口腔表面的亲和力，使得在期望表面上 或接近期望表面处产生酶促产生的过酸。

背景技术

过氧羧酸(“过酸”)是有效的抗微生物剂。针对不希望有的微生物 生长，对硬质表面、食物产品、活植物组织、和医疗设备进行清洁、消毒、 和/或卫生处理的方法已有所描述(如美国专利公开6,545,047；美国专利公 开6,183,807；美国专利公开6,518,307；美国专利公开5,683,724和美国专利 公开6,635,286)。过酸可用于制备衣物洗涤剂所用的漂白组合物也有所报 道(如美国专利公开3,974,082；美国专利公开5,296,161；以及美国专利公 开5,364,554)。

也已经公开了包含过酸的口腔护理组合物。授予Viscio，D.的美国专利 公开5,302,375公开了用于美白牙齿的口腔护理组合物，其包含溶解在载体 中的过乙酸，其中所述过乙酸通过混合水、乙酰水杨酸、和水溶性碱金属过 碳酸盐在载体中原位产生。授予Church等人的美国专利公开5,279,816公开 了包含过乙酸的组合物用于美白色斑或变色牙齿的用途。授予 Montgomery，R.的美国专利公开6,221,341和7,189,385公开了适用于美白牙 齿方法的过氧酸牙齿增白组合物。更具体地，通过混合过氧化氢前体、乙酸 甘油酯、和水产生过乙酸组合物，用于经由化学过水解产生过乙酸。未描述 酶促过水解。

授予Concar等人的美国专利公开申请公布2009-0311198公开了包含具 有过水解活性的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)酶以漂白牙齿的口腔组合 物。未公开CE-7过水解酶用于产生过酸有益剂的用途。Concar等人也未描 述口腔护理组合物中靶向过水解酶的用途。

在身体护理产品中包括具有过水解活性的特定枯草菌溶素(subtilisin  Carlsberg)蛋白酶变体在授予Wieland等人的美国专利公开7,510,859中公 开。除特定蛋白酶变体之外的过水解酶未被描述，也没有任何有效的例子展 示酶促产生过酸作为个人护理有益剂。

授予DiCosimo等人的美国专利公开申请公布2008-0176783A1；2008- 0176299A1；2009-0005590A1；和2010-0041752A1公开了结构上归类为糖 酯酶CE-7家族的成员的酶(即，先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖 酯酶[AXE])，它们特征在于将羧酸酯底物(在合适的过氧来源如过氧化氢 的存在下)转化成浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂的过氧羧酸的显著过水 解活性。已证实，糖酯酶CE-7家族的一些成员具有足够的过水解活性，一 旦将反应组分混合后，能在1分钟内由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成 4000至5000ppm的过乙酸，并在5分钟至30分钟内生成高达9000ppm的过 乙酸(DiCosimo等人，美国专利2009-0005590A1)。美国专利公开申请公 布2010-0087529A1描述了具有改善过水解活性的CE-7酶变体。虽然CE-7 过水解酶具有优异的过水解活性，尚未公开它们在个人护理产品中的用途。 同样地，需解决的一个问题是提供个人护理组合物和包括使用至少一种CE- 7过水解酶以生产过酸有益剂的方法。

过酸是强氧化剂，它可与多种物质发生反应，包括不是靶向期望益处 的物质。同样地，某些个人护理应用可得益于通过在期望的靶向身体表面上 或其附近的局部过酸生产将过酸有益剂靶向/集中在期望身体表面的能力。 酶促过酸生产可通过将过水解酶定向于身体表面产生益处。附加益处可通过 将过水解酶定向于递送材料以限制酶浓度并暴露于使用者来获得。

已经报道了口腔护理组合物和/或用联接于口腔材料的酶处理口腔护理 表面的方法。授予Simonson等人的美国专利公开4,138,476公开了处理牙斑 的方法，所述方法包括使用经由复合试剂共价偶联到磷酸盐载体基团上的葡 聚糖-降解酶，所述磷酸盐载体基团具有对牙齿表面的亲和力。据报道葡聚 糖沉积物的酶促降解促进牙斑材料的溶解和分散。

授予Budny等人的美国专利公开申请公布2005-0158253、美国专利公 开6,830,745公开了一种双组分组合物，其包含用于酶促降解生物膜结构的 锚定酶复合物和能够直接作用于细菌的第二锚定酶组分。生物膜降解酶是那 些直接降解表多糖主链结构的酶。

授予Budny，J.的美国专利公开5,871,714公开了用于控制细菌生长/定 植(例如减少牙斑)的组合物，其包含降解联接到锚定分子上的牙斑基质的 酶。未公开靶向过水解酶的用途。

授予Beggs等人的美国专利公开5,490,988和EP0479,600B1公开了用 作结合到目标位点的手段的抗体片段的用途，其中治疗剂通过附连于抗体片 段的附加肽连接以将治疗剂附接于目标位点。公开了口腔护理产品，其包含 具有对牙斑中细菌抗原组分的亲和力的改性抗体片段，用于递送治疗剂。治 疗剂可为由酶或组合酶产生的细胞毒类药物，例如氧化酶与过氧化物酶组合 形成的氧化卤。未描述靶向过水解酶用于生产过酸有益剂的用途。

授予Beggs等人的EP0450,800B1公开了利用两种不同的酶一起用于 杀灭口腔微生物区系中存在的菌种。第一种酶产生中间产物，其用作第二种 酶的底物以产生对口腔内目标的活性剂。将每种酶附接到具有对口腔内目标 表面的亲和力的抗体或抗体片段上，从而将应用的酶联接到彼此接近的目标 位点。例示的是葡萄糖氧化酶的组合，其用于制备过氧化氢，然后过氧化氢 可被过氧化物酶在卤离子或硫氰酸盐存在的情况下转化以分别产生次氯酸盐 或亚硫氰酸盐。未描述靶向过水解酶用于生产过酸有益剂的用途。

授予Beggs等人的EP0451,972B1描述了包含两种酶的产物，所述产 物包含产生目标活性剂的第一种酶和产生中间产物的第二种酶，所述中间产 物是第一种酶的底物；所述产物还包括附接或可附接到两种酶上以将所述酶 联接在一起，从而形成结合到靶向细胞上的复合物的联接方法(即，抗体或 抗体片段)。例示的是联接到过氧化物酶上的氧化酶(能够产生过氧化 氢)，其催化次氯酸盐或亚硫氰酸盐活性剂的形成。

授予Beggs等人的EP0453,097B1描述了使用多个抗体或抗体片段将 活性剂递送到目标位点，所述抗体或抗体片段能够自组装以形成在活性剂和 目标位点之间的桥接。活性剂是葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶和过氧化物酶 的组合。未描述靶向过水解酶用于生产过酸有益剂的用途。

由于它们的尺寸和成本，抗体、抗体片段(F_ab)、单链融合可变区抗 体(scFc)、骆驼科(Camelidae)抗体、和作为肽亲和材料的大支架展示 蛋白的用途可能不适于一些个人护理应用。同样地，在某些低成本的化妆品 应用中需要使用较短的、较便宜的肽亲和材料以定向递送有益剂。

具有对身体表面强亲和力以将化妆品有益剂定向于身体表面的较短 的、生物淘选的肽的用途已经有所描述(美国专利公开7,220,405； 7,309,482；7,285,264和7,807,141；美国专利公开申请公布2005-0226839 A1；2007-0196305A1；2006-0199206A1；2007-0065387A1；2008-0107614 A1；2007-0110686A1；2006-0073111A1；2010-0158846；2010-0158847； 和2010-0247589；以及公布的PCT专利申请WO2008/054746； WO2004/048399、和WO2008/073368)。授予Huang等人的美国专利公开 7,807,141公开了肽基口腔护理表面试剂，其适于将口腔护理有益剂联接到 牙齿表面。对口腔表面具有亲和力以联接活性CE-7过水解酶(即，“靶向 过水解酶”)用于生产过酸有益剂的肽材料的用途尚未有所描述。

同样地，需解决的一个附加问题是提供适于将酶促过酸生产定向于口 腔表面的组合物和方法。

发明内容

本发明提供了方法和组合物，所述组合物包括酶促生产并递送基于过 酸的有益剂到口腔表面的组分。

在一个实施例中，提供了口腔护理组合物和方法，所述方法使用CE-7 过水解酶酶促生产过酸有益剂用于口腔护理用途，例如口腔表面漂白、牙齿 美白、消毒、脱色、除臭、治疗龋齿、预防龋齿、减少与龋齿相关联的口腔 细菌、以及治疗或除去口腔生物膜(例如牙斑)。

在一个实施例中，提供了方法，所述方法包括：

1)提供一组反应组分，所述反应组分包括：

a)至少一种选自下列的底物：

i)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链、支化或环状烃基部分，其中对于R₆＝C2-C7，R₆任选 地包含一个或多个醚键；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃 基部分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部 分；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基， 或不超过一个酯基或羧酸基；其中R₅任选地包含一个或 多个醚键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解 度；

ii)具有下列结构的甘油酯：

其中R₁＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1- C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

iii)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1- C7直链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷 基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳 基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至 10；和

iv)选自下列的乙酰化糖：乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化 多糖；

b)过氧源；和

c)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有使用 CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基序 的酶，所述特征基序包括：

i)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ 基序；

ii)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的 GXSQG基序；和

iii)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基 序；和

2)在适宜的反应条件下混合(1)的反应组分，从而酶促产生至少一 种过酸；和

3)使口腔表面与所述至少一种过酸接触，从而所述口腔表面收到基于 过酸的益处，所述益处选自漂白、牙齿美白、消毒、脱色、除臭、 减少或除去生物膜、以及它们的组合。

在一个实施例中，所述口腔表面是牙釉、牙膜、口腔内的软组织(例 如牙龈、舌头)、或口腔生物膜(例如口腔牙斑)。

在另一个实施例中，提供了组合物和方法，它们包括使用融合蛋白 (即，“靶向过水解酶”)，其包含过水解酶和对口腔表面具有亲和力的肽 组分，其中所述两种组分可任选地被肽间隔区分开。

在一个实施例中，提供了方法，所述方法包括：

1)提供一组反应组分，所述反应组分包括：

a)至少一种选自下列的底物：

i)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链、支化或环状烃基部分，其中对于R₆＝C2-C7，R₆任选 地包含一个或多个醚键；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃 基部分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部 分；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或 不超过一个酯基或羧酸基；其中R₅任选地包含一个或多 个醚键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解 度；

ii)具有下列结构的甘油酯：

其中R₁＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1- C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

iii)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1- C7直链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷 基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳 基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至 10；和

iv)选自下列的乙酰化糖：乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化 多糖；

b)过氧源；和

c)具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含融合蛋 白，所述融合蛋白具有下列通式结构：

PAH-[L]_y-OCBD

或

OCBD-[L]_y-PAH

其中

PAH为具有过水解活性的酶；

OCBD为对口腔表面具有亲和力的肽组分；并且

L为任选的长度在1至100个氨基酸的范围内的肽接头；

并且

y为0或1；

2)在适宜的反应条件下混合(1)的反应组分，从而酶促产生至少一 种过酸；以及

3)使口腔表面与所述至少一种过酸接触，从而所述口腔表面收到基于 过酸的益处，所述益处选自漂白、牙齿美白、消毒、脱色、除臭、 减少或除去生物膜、以及它们的组合。

所述融合蛋白可包含过水解酶，其选自脂肪酶、蛋白酶、酯酶、酰基 转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合。

在一个实施例中，融合蛋白包含来自耻垢分枝杆菌的过水解芳基酯酶 (ArE)。在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有与 S54V耻垢分枝杆菌芳基酯酶SEQ ID NO：460具有至少95％的同一性的氨基 酸序列。

在一个实施例中，所述融合蛋白包含来自荧光假单胞菌(Pseudomonas  fluorescens)的过水解酯酶。在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解 酶，其具有与荧光假单胞菌芳基酯酶SEQ ID NO：477具有至少95％的同一 性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有选自SEQ ID  NO：424、425、426、427、428、429、430、437、438、439、440、441、 442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、 455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、 476、477、478和479的氨基酸序列。

在另一个实施例中，所述融合蛋白包含CE-7过水解酶，其具有使用 CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基序，所述特征基 序包括：

i)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ基序；

ii)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的GXSQG基 序；和

iii)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基序。

在另一个实施例中，对口腔表面具有亲和力的肽组分优选地为单链 肽，其包含至少一种口腔表面结合肽。在另一个实施例中，口腔表面结合肽 为对牙釉、牙膜、或牙釉和牙膜二者具有亲和力的肽。

在另一个实施例中，提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含下列通式结 构：

PAH-[L]_y-OCBD

或

OCBD-[L]_y-PAH

其中

1)PAH为具有过水解活性的酶；

2)OCBD为对口腔表面具有亲和力的肽组分；

3)L为任选的长度在1至100个氨基酸的范围内的肽接头；并且

4)y为0或1。

在另一个实施例中，提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含下列通式结 构：

PAH-[L]_y-OCBD

或

OCBD-[L]_y-PAH

其中

a)PAH为具有过水解活性的CE-7糖酯酶；所述PAH具有使用 CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基 序，所述特征基序包括：

i)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ 基序；

ii)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的 GXSQG基序；和

iii)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基 序；并且

b)OCBD为对口腔表面具有亲和力的肽组分；

c)L为任选的长度在1至100个氨基酸的范围内的肽接头；并且

d)y为0或1。

在另一个实施例中，提供了口腔护理产品，所述口腔护理产品包括：

1)包含任何上述过水解融合蛋白的酶催化剂；

2)至少一种选自下列的底物：

a)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支 化或环状烃基部分，其中对于R6＝C2-C7，R₆任选地包含一个 或多个醚键；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部 分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部分；其中 R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基，或不超过一个酯 基或羧酸基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

b)具有下列结构的甘油酯：

其中R₁＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

c)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔 基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；和

d)选自下列的乙酰化糖：乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多 糖；

3)过氧源；和

4)口腔上可接受的载体介质。

在另一个实施例中，提供了口腔护理产品，所述口腔护理产品包括：

1)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有使用 CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基序的 酶，所述特征基序包括：

a)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ基 序；

b)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的GXSQG基 序；和

c)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基序；

和

2)至少一种选自下列的底物：

a)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支 化或环状烃基部分，其中对于R6＝C2-C7，R₆任选地包含一个 或多个醚键；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部 分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部分；其中 R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基 或羧酸基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

b)具有下列结构的甘油酯：

其中R₁＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

c)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔 基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；和

d)选自下列的乙酰化糖：乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多 糖；

3)过氧源；和

4)口腔上可接受的载体介质。

在另一个实施例中，提供了分离的对口腔表面具有亲和力的多肽，所 述多肽具有选自SEQ ID NO：399、400、401、402、403、404、405、406、 407、408、409、410、412、413、414、415、416、417、418、419、420、 421和422的氨基酸序列。

在另一个实施例中，也提供了在口腔护理产品中使用具有过水解活性 的CE-7糖酯酶以产生有效浓度的至少一种过酸，用于漂白、美白、消毒、 脱色、除臭或从口腔材料/表面除去生物膜的方法。

在另一个实施例中，提供了过酸生成组合物的用途，所述过酸生成组 合物用于治疗或预防龋齿、齿龈炎、口腔念珠菌病、或牙周炎，所述过酸生 成组合物包括：

a)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有使用 CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特征基序的 酶，所述特征基序包括：

i)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ基 序；

ii)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的GXSQG 基序；和

iii)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基序；

和

b)至少一种选自下列的底物：

1)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支 化或环状烃基部分，其中对于R6＝C2-C7，R₆任选地包含一个 或多个醚键；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部 分或五元环状杂芳族或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R₅ 中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基或 羧酸基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

2)具有下列结构的甘油酯：

其中R₁＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

3)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔 基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；和

d)选自下列的乙酰化糖：乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖；和

c)过氧源；

从而在混合时同时形成过酸或以逐步方式(但是不以特定顺序)，通过 (a)、(b)、和(c)形成过酸。

在另一个实施例中，提供了在口腔产品中使用包含下列通式结构的融 合蛋白的方法，其包括：

PAH-[L]_y-OCBD

或

OCBD-[L]_y-PAH

其中

1)PAH为具有过水解活性的酶，其具有与SEQ ID NO：460具有至少 95％的氨基酸同一性的氨基酸序列；

2)OCBD为对口腔表面具有亲和力的肽组分；

3)L为长度在1至100个氨基酸的范围内的肽接头；并且

4)y为0或1。

本文所述的多个酯底物(表20)当与过氧化氢反应以产生过乙酸时， 尤其易受化学过水解的影响。在另一个实施例中，提供了个人护理产品，其 包括过酸前体，所述过酸前体选自1，2，3，5-四-O-乙酰基-呋喃核糖；1，2，3，4- 四-O-乙酰基-吡喃核糖；2-乙酰氨基-2-脱氧-1，3，4，6-四乙酰-β-D-吡喃葡萄 糖；β-D-吡喃葡萄糖；1，2，3，4-四乙酸酯；2，3，4，6-四乙酰-β-D-吡喃葡萄糖； 1，3，4，6-四-O-乙酰基-吡喃甘露糖；和α-D-五乙酸甘露糖酯。在一个优选的实 施例中，个人护理产品是口腔护理产品。

在另一个实施例中，也提供了方法，其包括：

a)提供一组反应组分，所述反应组分包括：

i)过酸前体，其选自1，2，3，5-四-O-乙酰基-呋喃核糖；1，2，3，4-四- O-乙酰基-吡喃核糖；2-乙酰氨基-2-脱氧-1，3，4，6-四乙酰-β-D-吡 喃葡萄糖；β-D-吡喃葡萄糖，1，2，3，4-四乙酸酯；2，3，4，6-四乙酰- β-D-吡喃葡萄糖；1，3，4，6-四-O-乙酰基-吡喃甘露糖；和α-D-五 乙酸甘露糖酯；和

ii)过氧源；

b)使身体表面与有效量的过乙酸接触，所述过乙酸通过在水存在的情 况下混合所述反应组分组产生；从而所述过乙酸向所述身体表面提 供益处。

在一个优选的方面，在上述方法中的身体表面是口腔组织，例如牙齿 和/或牙龈。

生物序列简述

下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨 基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for Patent  Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence  Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World  Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(2009)以及 European Patent Convention(EPC)和Patent Cooperation Treaty(PCT)的序 列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative  Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和 格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

SEQ ID NO：1是编码来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)31954^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：2是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)31954^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是编码来自枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis  subsp.subtilis)菌株168的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：4是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp. subtilis)菌株168的先锋霉素C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是编码来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)6633^TM的 先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：6是来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)6633^TM的先锋 霉素C脱乙酰酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是编码来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)14580^TM的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：8是来自地衣芽孢杆菌14580^TM的先锋霉素C脱乙 酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是编码来自短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213的乙酰木 聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：10是来自短小芽孢杆菌PS213的乙酰木聚糖酯酶的推导氨 基酸序列。

SEQ ID NO：11是编码来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum) 27405^TM的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：12是来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum) 27405^TM的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是编码来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga  neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：14是来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的 乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是编码来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8 的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：16是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的乙 酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是编码来自热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium  sp.)JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：18是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL  YS485乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先 锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。应该指出的是，编码来自芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列在 登录号ZP_01168674中据报告似乎会编码在N端增加的15个氨 基酸，根据与其他先锋霉素C脱乙酰酶的序列比对，以及根据报告长度 (340个氨基酸)与其他CAH酶的观测长度(通常为318至325个氨基 酸；参见美国专利公开申请公布US-2010-0087528-A1；其以引用方式并入 本文)，这可能是不正确的。同样地，本文报告的核酸序列编码来自芽孢杆 菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先锋霉素C脱乙酰酶的序列，该序列 无以登录号ZP_01168674报告的N-末端的15个氨基酸。

SEQ ID NO：20是来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911的先 锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列，其由核酸序列SEQ ID NO：19编码。

SEQ ID NO：21是编码来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125 的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：22是来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125的先 锋菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：23是编码来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM- K16的先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列。

SEQ ID NO：24是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16的 先锋菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：25是编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)29233^TM的先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)的核酸序列。

SEQ ID NO：26是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)29233^TM先锋 菌素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：27是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木 聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布 2010-0087529(其全文以引用方式并入本文)，其中在位置277的Xaa残基 是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：28是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚 糖酯酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布2010- 0087529，其中在位置277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：29是莱廷格热袍菌(Thermotoga lettingae)乙酰木聚糖酯 酶变体的推导氨基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布2010- 0087529，其中在位置277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：30是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨 基酸序列，所述变体来自美国专利公开申请公布2010-0087529，其中在位 置277的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：31是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶 变体的推导氨基酸序列，所述变体来源于“RQ2(a)”，其来自美国专利 公开申请公布2010-0087529，其中在位置277的Xaa残基是Ala、Val、 Ser、或Thr。

SEQ ID NO：32是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶 变体的推导氨基酸序列，所述变体来源于“RQ2(b)”，其来自美国专利 公开申请公布2010-0087529，其中在位置278的Xaa残基是Ala、Val、 Ser、或Thr。

SEQ ID NO：33是莱廷格热袍菌(Thermotoga lettingae)乙酰木聚糖酯 酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：34是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸 序列。

SEQ ID NO：35是来自栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2(本文称为 “RQ2(a)”)的第一乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：36是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2第二乙酰木聚糖 酯酶(本文称为“RQ2(b)”)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：37是编码解糖热厌氧杆菌(Thermoanearobacterium  saccharolyticum)先锋霉素C脱乙酰酶的经密码子优化的核酸序列。

SEQ ID NO：38是解糖热厌氧杆菌(Thermoanearobacterium  saccharolyticum)先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：39是编码来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) (登录号EU255910)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：40是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(登录号ABX75634.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：41是编码来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti) (登录号NC_002678.2)的乙酰木聚糖酯酶的核酸序列。

SEQ ID NO：42是来自百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti) (登录号BAB53179.1)的乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43是编码来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus  stearothermophilus)(登录号AF038547.2)的乙酰木聚糖酯酶 的核酸序列。

SEQ ID NO：44是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus  stearothermophilus)(登录号AAF70202.1)的乙酰木聚糖酯酶 的氨基酸序列。

SEQ ID NO：45是编码乙酰木聚糖酯酶变体(变体“A3”)的核酸序 列，所述变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖 酯酶氨基酸序列具有下列取代： (F24I/S35T/Q179L/N275D/C277S/S308G/F317S)。

SEQ ID NO：46是“A3”乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：47是编码N275D/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序 列。

SEQ ID NO：48是N275D/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：49是编码C277S/F317S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序列。

SEQ ID NO：50是C277S/F317S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：51是编码S35T/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序列。

SEQ ID NO：52是S35T/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：53是编码Q179L/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的核酸序列。

SEQ ID NO：54是Q179L/C277S乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：55是编码乙酰木聚糖酯酶变体843H9的核酸序列，所述变 体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸 序列具有下列取代：(L8R/L125Q/Q176L/V183D/F247I/C277S/P292L)。

SEQ ID NO：56是843H9乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：57是编码乙酰木聚糖酯酶变体843F12的核酸序列，所述 变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基 酸序列具有下列取代：K77E/A266E/C277S。

SEQ ID NO：58是843F12乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59是编码乙酰木聚糖酯酶变体843C12的核酸序列，所述 变体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基 酸序列具有下列取代：F27Y/I149V/A266V/C277S/I295T/N302S。

SEQ ID NO：60是843C12乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61是编码乙酰木聚糖酯酶变体842H3的核酸序列，所述变 体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸 序列具有下列取代：L195Q/C277S。

SEQ ID NO：62是842H3乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：63是编码乙酰木聚糖酯酶变体841A7的核酸序列，所述变 体相对于野生型海栖热袍菌(Thermotoga maritima)乙酰木聚糖酯酶氨基酸 序列具有下列取代：Y110F/C277S。

SEQ ID NO：64是841A7乙酰木聚糖酯酶变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65-221、271、和368是对毛发具有亲和力的肽的氨基酸序 列的非限制性列表。

SEQ ID NO：217-269是对皮肤具有亲和力的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：270-271是对指/趾甲具有亲和力的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：272-382是对口腔表面具有亲和力的肽的氨基酸序列。SEQ  ID NO：272-291和312-382对牙膜具有亲和力。SEQ ID NO：292-311对牙釉 具有亲和力。

SEQ ID NO：383-396是肽接头/间隔区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：397是表达质粒pLD001的核酸序列。

SEQ ID NO：398是测序引物的核酸序列。

SEQ ID NO：399-410是实例2的牙釉结合和牙膜结合肽的氨基酸序 列。

SEQ ID NO：411是具有如表4所示的C-末端赖氨酸的牙齿结合肽 DenP03的氨基酸序列。

SEQ ID NO：412-422是具有如表4所示的C-末端赖氨酸的牙釉结合肽 和牙膜结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：423是肽HC263的氨基酸序列。

SEQ ID NO：424是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)变体C277S的 氨基酸序列，在本专利申请中所述变体也称为酶“EZ-1”。

SEQ ID NO：425-430和437-467以及479是如表5和/或表6所公开的多 个过水解酶构建体的氨基酸序列。

SEQ ID NO：431-436和468-475是实例4所公开的多个靶序列的氨基酸 序列。

SEQ ID NO：476是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)变体HTS-007- D5的氨基酸序列，其具有下列取代：C277T/R296P。

SEQ ID NO：477是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)酯酶的氨 基酸序列，所述酯酶具有过水解活性(美国专利公开7,384,787；“L29P” 变体。注意取代编号按照不包括初始甲硫氨酸残基的引用专利。SEQ ID NO： 477包括在残基位置编号30的L29P取代，因为在该序列中包括初始甲硫氨 酸)。

SEQ ID NO：478是野生型耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) 芳基酯酶的氨基酸序列(美国专利公开7,754,460)。

具体实施方式

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。除非另外特别说明，下述定 义适用。

如本文所用，涉及元素或组分实例(即出现的事物)的数目在本发明 元素或组分前的冠词“一个”、“一种”及“所述”旨在是非限制性的。因 此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并 且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整 数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步 骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由... 组成”和“由...组成”涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由...组成”旨 在包括由术语“由...组成”涵盖的实施例。

如本文所用，修饰成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过 例如下列方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩 物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差； 通过用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异等等。 术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条 件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同 量。

当存在时，所有范围是包括端值在内的和可以组合的。例如，当列出 范围“1至5”时，所列范围应被视为包括范围“1至4”、“1至3”、 “1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等等。

如本文所用，“接触”是指使组合物与目标身体表面接触一段足以达 到期望结果(结合目标表面、基于过酸的效应等)的时间。在一个实施例 中，“接触”可以指使包含(或能够制备)有效浓度过酸的组合物与目标身 体表面接触一段足以达到期望结果的时间。在另一个实施例中，“接触”也 可以指使个人护理组合物的至少一种组分如一种或多种反应组分(用于酶促 过水解)与目标身体表面接触。接触包括通过喷洒、处理、浸入、冲洗、倾 注、混合、组合、涂抹、涂覆、施加、粘附以及其他方式，使包含有效浓度 的过酸的过酸溶液或组合物、形成有效浓度过酸的溶液或组合物或形成有效 浓度过酸的组合物组分与身体表面相连。

如本文所用，术语“底物”、“适用底物”和“羧酸酯底物”可互换 地具体指：

(a)一种或多种具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基；

R₆为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支化 或环状烃基部分，其中对于R₆＝C2-C7，R₆任选地包含一个或多个 醚键；

R₅为任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部分 或五元环状杂芳族或六元环状芳族或杂芳族部分；其中R₅中的每 个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基，并且其中 R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数，

在25℃下，所述一种或多种酯具有至少5ppm的水中溶解 度；或

(b)一种或多种具有下列结构的甘油酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或 支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或

(c)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链 或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔基、 芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；或

(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或

(e)(a)至(d)的任何组合。

如本文所用，术语“过酸(peracid)”与过氧酸(peroxyacid)、过氧 羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸 (percarboxylic acid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并与过氧乙酸、乙过 氧酸以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯 和甘油单醋酸酯同义。

如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯、甘油二醋酸 酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯、三醋酸甘油 酯、甘油三醋酸酯、1，2，3-三乙酰氧基丙烷；1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS 登记号102-76-1的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯 和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基 酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基 甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯 和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基 酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油 酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酰化糖(acetylated sugar/acetylated  saccharide)”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。例子包括但 不限于葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片 段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛；和三-O-乙酰 基-葡萄烯糖。

如本文所用，术语“烃基”和“烃基部分”指直链、支化或环状碳原 子排列，碳原子通过碳-碳单键、双键或三键和/或醚键连接，并且相应的被 氢原子取代。此类烃基可以是脂族的和/或芳族的。烃基基团的例子包括甲 基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊 基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优选的实施 例中，烃基部分为直链、支化或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳 单键和/或醚键连接且氢原子被相应取代。

如本文所用，术语1，2-乙二醇；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇； 1，3-丁二醇；2，3-丁二醇；1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，5-戊二 醇；1，6-戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇；以及它们的混合物 的“单酯”和“二酯”是指：所述化合物包含由式RC(O)O表示的至少一个 酯基，其中R为C1-C7直链的烃基部分。在一个实施例中，羧酸酯底物选 自丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二醋酸酯(EDGA)、以及它们的混 合物。

如本文所用，术语“丙二醇二乙酸酯(propylene glycol diacetate)”与 1，2-丙二醇二乙酸酯(1，2-diacetoxypropane)、丙二醇二乙酸酯(propylene  diacetate)、1，2-丙二醇二乙酸酯(1，2-propanediol diacetate)、以及CAS登 记号623-84-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙二醇二醋酸酯(ethylene glycol diacetate)”与 1，2-乙二醇二醋酸酯(1，2-diacetoxyethane)、乙二醇二乙酸酯(ethylene  diacetate)、乙二醇二乙酸酯(glycol diacetate)、以及CAS登记号111-55- 7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位产生过酸 的组分”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”、“反应混合 物”和“产生过酸的组分”是指反应物和过水解酶催化剂在其中发生接触的 材料和水。产生过酸的组分将至少包括具有过水解活性的酶，优选地其中所 述过水解酶为至少一种CE-7过水解酶(任选地为靶向身体表面的融合蛋白 形式)、至少一种适宜的羧酸酯底物、过氧源、和水(包含过氧源例如过氧 化氢的水溶液)。在一个实施例中，任何不属于CE-7类糖酯酶(前提条 件)的过水解酶以具有至少一种肽组分的融合蛋白形式使用，所述肽组分具 有对目标表面，优选口腔表面的亲和力。

如本文所用，术语“过水解”定义为所选底物与过氧化物的形成过酸 的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过氧 羧酸。如本文所用，术语“化学过水解”包括其中底物(过氧羧酸前体)与 过氧化氢源组合的过水解反应，其中过氧羧酸在不存在酶催化剂的情况下形 成。如本文所用，术语“酶促过水解”包括过水解反应，其中羧酸酯底物 (过酸前体)与过氧化氢源和水反应，从而酶催化剂催化过酸的形成。

如本文所用，术语“过水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)的 蛋白、细胞干重或固定化催化剂重量所具有的催化剂活性。

如本文所用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义 为，在指定温度每分钟产生1μmol过氧羧酸产物所需的过水解酶活性的量。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有 过水解活性的酶的催化剂，并且可以是完整微生物细胞、透化的微生物细 胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的 形式。酶催化剂也可被化学改性(如通过聚乙二醇化作用或与交联试剂反 应)。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将过水解酶催化剂固定到可溶 性或不溶性支持体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells； Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。在一 个实施例中，可将过水解酶催化剂非共价地或共价地固定在口腔护理贴(例 如美白牙贴)或牙托的内部或上面。固定化酶可直接联接到聚合物载体和/ 或在口腔护理贴或牙托内的组分(例如二氧化钛、羟基磷灰石、口服可接受 的粘合剂、聚乙烯、聚丙烯等)上。在另一个实施例中，非共价地固定到所 述口腔护理贴或牙托上可通过使用对口腔护理贴或牙托内部或上面的材料具 有强亲和力的肽结合域(例如包括通过任选的肽间隔区联接到肽结合域的过 水解酶的融合蛋白)完成。在另一个实施例中，牙托是可变形的牙托。在另 一个实施例中，在形成牙印模后将过水解酶催化剂固定化在可变形牙托的内 部或上面。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰木聚糖以及其他乙酰 化糖的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXEs)。如本文所述，提供了具有 显著过水解活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的几种酶。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰水解 酶”是指催化先锋霉素如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸的脱乙酰作用的酶 (E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，(1995)，Appl.Env.Microbiol.61 (6)：2224-2229)。本文提供了具有显著过水解活性的多个先锋霉素C脱 乙酰酶的氨基酸序列。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌31954^TM”是指保藏于美国典 型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞，其国际保藏登录号为31954^TM。如本文所描述，来自枯草芽孢杆菌31954^TM的具有显著过水 解酶活性的酶为SEQ ID NO：2(参见美国专利公开申请公布2010- 0041752)。

如本文所用，术语“海栖热袍菌MSB8”是指，据报道称其具有乙酰木 聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(NP_227893.1；参见美国专利 公开申请公布2008-0176299)。来自海栖热袍菌MSB8并具有过水解酶活 性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：16提供。

如本文所用，“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”和“分离的 核酸片段”将可以互换使用，并指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任 选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离 型核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构 成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使 用下列缩写来表示具体的氨基酸：

例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸 但不影响编码蛋白的功能性质的基因改变是常见的。出于本发明的目的，将 替换定义为下列五组之一中的互换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala、Ser、Thr(Pro、 Gly)；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gin；

3.极性的、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及

5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。

因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一种疏水 性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或 异亮氨酸)的密码子替换。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个 带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或一个带正电荷的残基替换 为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产 生功能上等价的产物。导致蛋白质分子的N末端和C末端部分改变的核苷 酸变化也将预计不会改变该蛋白质的活性。所提出的修饰中的每一种均完全 在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。

如本文所用，术语“特征基序”和“诊断基序”指具有给定活性的酶 家族中共有的保守结构。可使用特征基序定义和/或鉴定对给定底物家族具 有相似酶活性的结构相关的酶家族。特征基序可为单个邻接氨基酸序列或不 邻接的保守基序的集合，它们一起形成特征基序。通常，保守基序以氨基酸 序列表示。在一个实施例中，过水解酶包含CE-7糖酯酶特征基序。

如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核 酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变 核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体典型的密码子使用情 况。

如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化 学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些构件进行连接并退火以形成基 因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。当涉及 DNA序列时，“化学合成的”是指体外装配组分核苷酸。可以采用完善建 立的方法来完成DNA的手工化学合成或可使用许多种可商业获得的机器的 其中一种来完成自动化学合成。因此，基于核苷酸序列的优化以反映宿主细 胞的密码子偏好性，可以定制基因用以优化基因表达。如果密码子使用偏向 于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优 选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得) 的检测。

如本文所用，“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸分子，其包括 编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编 码序列)。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。 “嵌合基因”指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调 控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码 序列，或包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编 码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。 “外来基因”是指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移 导入宿主生物内。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌 合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。 “合适的调节序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游 (3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工 或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位 点、效应子结合位点和茎-环结构。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上的核酸序列 的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如， 当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控 制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反 义的取向可操作地连接至调控序列。

如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸分子的有义RNA (mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多 肽。

如本文所用，“转化”是指将核酸分子转移至宿主生物的基因组内， 导致基因稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外 (如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”、“重 组”或“转化”生物。

如本文所用，术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序 列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开 发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin  Package Version9.0，Accelrys Software Corp.，San Diego，CA)、 BLASTP、BLASTN、BLASTX(A1tschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410 (1990))、和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI 53715USA)、CLUSTALW(例如1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids  Research，22(22)：4673-4680(1994))、以及包含Smith-Waterman算 法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int. Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20，编辑：Suhai，Sandor， Publisher：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda， MD)和Sequencher v.4.05。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列 分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外 指明。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最 初加载的任何值或参数集。

术语“身体表面”是指可用作有益剂如过酸有益剂目标的任何人体表 面。本发明方法和组合物涉及口腔护理用途和产品。同样地，身体表面包括 口腔材料/表面。在一个实施例中，口腔材料包括牙釉、牙膜、软组织如 颊、舌头、和牙龈，以及口腔生物膜(例如口腔牙斑)。

如本文所用，术语“生物污染物”是指一种或多种不想要的和/或病原 性的生物实体，包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混 合物。在一个实施例中，提供了一种方法用于酶促产生有效浓度的至少一种 过酸，其用于减少和/或消除存在的生物污染物。

如本文所用，术语“消毒”指破坏或防止生物污染物生长的方法。如 本文所用，术语“消毒剂”是指通过破坏、中和、或抑制生物污染物生长来 进行消毒的制剂，其可包括在人口腔内的生物污染物，例如与龋齿、齿龈 炎、口腔念珠菌病、或牙周炎相关联的微生物。如本文所用，术语“消毒” 指消毒的行为或过程。如本文所用，术语“防腐剂”是指抑制带病微生物生 长的化学试剂。在一个方面，生物污染物是病原微生物。

如本文所用，术语“卫生”指或涉及通常通过移除、阻止或控制可能 危害健康的剂来恢复或保持健康。如本文所用，术语“卫生处理”指采取卫 生措施保持卫生。如本文所用，术语“杀菌消毒剂”指消毒剂。如本文所 用，术语“卫生处理”指卫生处理的行为或过程。

如本文所用，术语“生物杀灭剂”是指灭活或破坏微生物的通常为广 谱的化学试剂。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂称为具有“生物 杀灭”活性。过酸可具有生物杀灭活性。典型的备选生物杀灭剂可包括例如 氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯化酚醛树 脂、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。

如本文所用，短语“最低生物杀灭浓度”指生物杀灭剂在特定接触时 间内的最低浓度，其将产生期望的杀灭效果，不可逆的减少目标微生物的活 体数量。效力可通过处理后活体微生物1og₁₀的减少来度量。在一个方面， 处理后活体微生物的目标减少为至少3-log₁₀的减少，更优选至少4-log₁₀的 减少，最优选至少5-log₁₀的减少。在另一方面，最低生物杀灭浓度为减少 活体微生物细胞至少6-log₁₀。

如本文所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”是指发现用于从牙齿上 除去非期望的化合物的组合物(漱口水、牙膏等)。术语涵盖选择用于期望 特定类型清洁组合物的任何材料/化合物和产物形式(例如液体、糊料、凝 胶、乳液、颗粒、或喷雾组合物)，只要所述组合物与所述组合物中使用的 过水解酶和其他酶相容即可。

如本文所用，“口腔清洁组合物”是指牙粉、牙膏、牙胶、牙粉、漱 口水、口喷剂、口胶、咀嚼式口香糖、锭剂、小药囊、片剂、生物凝胶、预 防糊料、牙齿治疗溶液等。与本发明的过水解酶联合使用的口腔护理组合物 是本领域熟知的(参见例如美国专利公开5,601,750；6,379,653；和 5,989,526,这些专利均全文以引用方式并入本文)。

如本文所用，“药用的”是指术语描述的药、药物和/或惰性成分适于 与人和其他动物的身体组织接触，无不适当的毒性、不相容性、不稳定性、 过敏、变应性应答等，具有适当的合理效/险比。

如本文所用，“个人护理产品”是指在毛发、皮肤、头皮、和牙齿的 清洁、漂白和/或消毒中使用的产品，包括但不限于洗发剂、爽身水、沐浴 凝胶、局部保湿剂、牙膏、牙胶、漱口剂、漱口水、抗牙斑漱口液、和/或 其他局部清洁剂。在一些尤其优选的实施例中，这些产品用于人体，而在其 它实施例中，这些产品用于除人之外的动物(例如兽医方面的用途)。

如本文所用，术语“牙齿美白”和“牙齿漂白”互换使用，是指改善 牙齿的亮白程度(例如美白)。所述术语意在涵盖任何适于美白牙齿的方法 (包括本发明)、以及化学处理、弱酸处理、牙齿打磨美白、和激光牙齿美 白。在尤其优选的实施例中，本发明提供了适于美白牙齿的过水解酶和包含 过水解酶的组合物。

如本文所用，牙齿中的“内源性色斑”是指由在釉质和下面的牙质内 的生色原引起的颜色。人牙齿的内源性颜色随着年龄增长趋于变得更黄，这 是由于釉质变薄和下面的泛黄牙质颜色变深。除去内源性色斑通常需要使用 过氧化物或其他氧化化学物质，它们透过釉质并使内部的生色原脱色。

与内源性色斑相比，“外源性色斑”当外源生色原物质结合到釉质上 时在牙齿表面上形成，通常在天然涂覆牙齿的薄膜内。大多数人随时间在他 们的牙齿上积累某些程度的不美观内源性色斑。这一牙齿变色过程受到一些 因素的促进，它们是：(1)摄取包含单宁酸的食品和饮料如咖啡、茶、或 红酒；(2)使用烟草产品；和/或(3)暴露于某些阳离子物质(例如锡、 铁、和洗必太)。这些物质趋于附着在釉质的羟基磷灰石结构上，其导致牙 齿变色并同时降低牙齿洁白度。经过多年时间，外源性色斑可透过釉质层并 导致内源性色斑。

如本文所用，术语“脱臭”是指消除或预防难闻的气味。

如本文所用，术语“脱色”或“褪色”是指从口腔表面除去色斑的过 程。所述色斑可为内源性色斑、外源性色斑、或它们的组合。

如本文所用，将在包含过水解酶的组合物中“增强的性能”定义为与 其他组合物相比对漂白敏感性色斑提高的清洁性能，这在牙科领域中使用标 准方法进行测定。在特定实施例中，本发明的过水解酶在氧化和色斑去除方 面提供了增强的性能。在其他实施例中，本发明的过水解酶在色斑去除和/ 或脱色方面提供了增强的性能。

如本文所用，“有效量的过水解酶”是指达到具体应用所需的酶活性 必需的过水解酶量。此类有效量由本领域的普通技术人员容易地确定，并且 其取决于多种因素，例如使用的特定酶变体、清洁用途、清洁组合物的具体 组合物、以及是否需要液体或非液体(例如乳液)组合物等。

如本文所用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时 能够提供约1mM或更高浓度过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、 过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐、以 及过碳酸盐。如本文所述，在将反应组分组合后，通过含水反应制剂中的过 氧化合物提供的过氧化氢初始浓度为至少0.1mM或更高。在一个实施例 中，在含水反应制剂中的过氧化氢浓度为至少0.5mM。在一个实施例中， 在含水反应制剂中的过氧化氢浓度为至少1mM。在另一个实施例中，含水 反应制剂中过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施例中，在含水反应制 剂中的过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施例中，在含水反应制剂 中的过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施例中，在含水反应制剂中 的过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施例中，在含水反应制剂中 的过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应制剂中过氧化氢与酶底物 (如甘油三酯)的摩尔比(H₂O₂：底物)可从约0.002至20、优选从约0.1 至10、以及最优选从约0.5至5。

如本文所用，术语“低聚糖”是指包含通过糖苷键连接的2至至少24 个单糖单位的化合物。术语“单糖”是指具有经验式(CH₂O)_n的化合物，其 中n≥3，碳骨架无支化，除了一个碳原子外每个都包含羟基，而剩余的那个 碳原子则为1号碳并形成醛或酮。术语“单糖”也指细胞内的环状半缩醛或 半缩酮形式。

如本文所用，术语“赋形剂”是指制剂中用作活性成分载体的非活性 物质。赋形剂可用于稳定制剂中的活性成分，例如活性成分的贮存稳定性。 赋形剂有时也用于为含活性成分的制剂增量(bulk up)。如本文所述，“活 性成分”可为具有过水解活性的酶、由过水解酶在适宜反应条件下产生的过 酸、或它们的组合。

术语“基本上不含水”将指制剂中的水浓度不会对存在于羧酸酯中的 酶或酶粉的贮存稳定性产生不利影响。羧酸酯可包含极低浓度的水，例如， 甘油三乙酸酯通常具有介于180ppm和300ppm之间的水。在一个实施例 中，将过水解酶贮存在基本上不含水的羧酸酯底物中。在另一个实施例中， “基本上不含水”可指包含酶(或酶粉)和羧酸酯的制剂中水含量低于 2000ppm、优选地低于1000ppm、更优选地低于500ppm、甚至更优选地低 于250ppm。在一个实施例中，可将过水解酶贮存在水溶液中，如果设计制 备体系使得所述酶在水溶液(例如不含显著浓度羧酸酯底物的溶液，所述底 物能够在储存期间被所述酶水解)中稳定。在一个实施例中，可将过水解酶 贮存在包含羧酸酯底物的混合物中，所述底物基本上不含水和一种或多种缓 冲剂(例如碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基膦酸 盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、和马来酸盐的钠和/或 钾盐)。

具有过水解活性的酶

具有过水解活性的酶可包括一些归类为脂肪酶、蛋白酶、酯酶、酰基 转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合的酶，只要所述酶对一种或多 种本发明底物具有过水解活性即可。例子可包括但不限于过水解蛋白酶(枯 草菌溶素(subtilisin Carlsberg)变体；美国专利公开7,510,859)、过水解芳 基酯酶(荧光假单胞菌；SEQ ID NO：477；美国专利公开7,384,787)、来 自耻垢分枝杆菌的过水解芳基酯酶/酰基转移酶(SEQ ID NO：460和478； 美国专利公开7,754,460；WO2005/056782；和EP1689859B1)、和过水解 糖酯酶。在一个优选的方面，过水解糖酯酶是CE-7糖酯酶。

在一个实施例中，适宜的过水解酶可包括包含与本文报道的任何氨基 酸序列具有至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性 的酶，条件是非CE-7过水解酶受限于靶向过水解酶应用(即，不属于CE-7 糖酯酶家族的过水解酶以融合蛋白形式使用，其包含至少一个肽靶向区 域)。

在另一个实施例中，适宜的过水解酶可包括包含与SEQ ID NO：460、 477、和478具有至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸 同一性的酶，条件是非CE-7过水解酶受限于靶向过水解酶应用(即，不属 于CE-7糖酯酶家族的过水解酶以融合蛋白形式使用，其包含至少一个肽靶 向区域)。应当理解，用于鉴定基本上类似的过水解酶的百分比同一性比较 和序列比对针对包括所述过水解酶的融合蛋白部分进行(即，不包括靶向区 域和接头)。

在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有与S54V耻垢 分枝杆菌芳基酯酶SEQ ID NO：460具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

在一个实施例中，所述融合蛋白包含来自荧光假单胞菌的过水解酯 酶。在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有与荧光假单胞 菌芳基酯酶SEQ ID NO：477具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有选自SEQ ID NO：424、425、426、427、428、429、430、437、438、439、440、441、 442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、 455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、 476、477、478、和479的氨基酸序列。

在另一个实施例中，基本上类似的过水解酶可包括由多核苷酸序列编 码的那些，所述序列在高严格杂交条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃并 用2X SSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1X SSC，0.1％SDS在65℃下最后洗 涤)杂交到编码任何本发明过水解酶的多核苷酸序列上，条件是非CE-7过 水解酶受限于靶向过水解酶应用(即，不属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶 以融合蛋白形式使用，其包含至少一个肽靶向区域)。

CF-7过水解酶

在一个优选的实施例中，口腔护理组合物和方法包括具有过水解活性 的酶，其结构上归类为糖酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho， P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database  approach”，Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering，H.J.Gilbert、G. Davies、B.Henrissat和B.Svensson编辑，(1999)The Royal Society of  Chemistry，Cambridge，第3-12页)。当与过氧源组合时，已证实酶的CE- 7家族尤其能有效地由多种羧酸酯底物制备过氧羧酸(授予DiCosimo等人 的美国专利公开7,794,378；7,951,566；7,723,083；和7,964,378以及美国专 利公开申请公布2008-0176299、2010-0087529、2011-0081693、和2011- 0236335；它们每个均以引用方式并入本文)。

CE-7家族的成员包括先锋霉素C脱乙酰酶(CAH，E.C.3.1.1.41)和乙 酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共享保守的特 征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。包含CE-7 特征基序(“CE-7过水解酶”)和/或基本上类似结构的过水解酶适用于本 文所述的组合物和方法。用于鉴定基本上类似的生物分子的装置在本领域为 人们所熟知(如序列比对方案、核酸杂交和/或保守特征基序的存在)。在 一个方面，过水解酶包括包含CE-7特征基序的酶，并与本文提供的序列之 一具有至少20％、优选至少30％、更优选至少33％、更优选至少40％、甚 至更优选至少42％、甚至更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少 70％、更优选至少80％、更优选至少90％、以及最优选至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性。

如本文所用，短语“酶在结构上归类为CE-7”、“CE-7过水解酶”、 或“在结构上归类为糖酯酶家族7的酶”将用于指代具有过水解活性并在结 构上归类为CE-7糖酯酶的酶。该酶家族可通过特征基序的存在而定义 (Vincent等人，同上)。CE-7酯酶的特征基序包括三个保守基序(相对于 参考序列SEQ ID NO：2的残基位置编号；所述CE-7过水解酶来自枯草芽孢 杆菌31954^TM)：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；以及

c)His298-Glu299。

通常，第180氨基酸残基位置的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色 氨酸或苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的其中两个以粗体表 示。在一个实施例中，第180氨基酸残基位置的Xaa选自：甘氨酸、丙氨 酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中的保守基序的进一步分析指示存在附加的保守基 序(在SEQ ID NO：2的氨基酸位置267-269的LXD)，这可用于进一步确 定属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶。在另一个实施例中，上文定义的特征 基序可包括附加的(第四)保守基序，其定义为：Leu267-Xaa268-Asp269。

在氨基酸残基位置268的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨 酸。第四基序包括属于催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸残 基(粗体)。

CE-7过水解酶可为融合蛋白形式，其具有至少一个对至少一个身体表 面具有亲和力的肽组分。在一个实施例中，用于确定靶向过水解酶(融合蛋 白)是否包含CE-7特征基序的所有比对将基于所述过水解酶的氨基酸序列 进行，所述过水解酶无具有对身体表面的亲和力的肽组分。

许多熟知的全局比对算法(即序列分析软件)可用于比对两个或更多 个代表具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列，以确定酶是否包含本发明的特 征基序。比对序列与参考序列(SEQ ID NO：2)进行比较以确定特征基序的 存在。在一个实施例中，将利用参考氨基酸序列(如本文所用的得自枯草芽 孢杆菌31954^TM的过水解酶序列(SEQ ID NO：2))的CLUSTAL比 对(例如CLUSTALW)用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过水解酶。保守氨 基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号，用以说明在比对序列 中的小插入或缺失(例如通常少于五个氨基酸)。

可用于鉴定包含本发明特征基序(当与参考序列进行比较时)的序列 的其他合适算法的例子包括但不限于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol. 48，443-453(1970)；一种全局比对工具)和Smith-Waterman(J.Mol. Biol.147：195-197(1981)；一种局部比对工具)。在一个实施例中，采用 默认参数进行Smith-Waterman比对。合适的默认参数的例子包括使用 BLOSUM62计分矩阵，其中GAP open penalty＝10、以及GAP extension  penalty＝0.5。

过水解酶之间的整体百分比同一性比较表明与SEQ ID NO：2具有低至 33％的氨基酸同一性的酶(同时保留特征基序)表现出显著的过水解酶活性 并且结构上归类为CE-7糖酯酶。在一个实施例中，适用的过水解酶包括包 含CE-7特征基序并与SEQ ID NO：2具有至少20％，优选至少30％、33％、 40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性的酶。

具有过水解活性的适用CE-7糖酯酶的例子包括但不限于具有氨基酸序 列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、 50、52、54、56、58、60、62、64、424、437、和476的酶。在一个实施例 中，所述酶包含选自14、16、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、424、437、和476的氨基 酸序列。

如本文所用，术语“CE-7变体”、“过水解酶变体”或“变体”将指 具有基因修饰的CE-7过水解酶，在与变体来源的对应酶(通常野生型酶) 进行比较时所述修饰引起至少一个氨基酸的添加、缺失、和/或取代；只要 保留了CE-7特征基序和相关联的过水解活性即可。CE-7过水解酶变体也可 在本发明组合物和方法中使用。CE-7变体的例子以SEQ ID NO：27、28、 29、30、31、32、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、424、437、 和476提供。在一个实施例中，所述变体可包括SEQ ID NO：27、28、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、424、437、和476。

技术人员认识到基本上类似的CE-7过水解酶序列(保留特征基序)也 可用于本发明的组合物和方法。在一个实施例中，基本上类似的序列通过它 们在高严格条件下杂交到与本文例示的序列相关联的核酸分子上的能力进行 定义。在另一个实施例中，可基于与本文提供的DNA或氨基酸序列的百分 比同一性，使用序列对比算法定义基本上类似的酶。

如本文所用，核酸分子可与另一个核酸分子(例如cDNA、基因组 DNA、或RNA)杂交是指在适当的温度和溶液离子强度条件下，第一分子 的单链可与其他分子退火。杂交和洗涤条件是熟知的并且例示于 Sambrook，J.和Russell，D.，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual， 第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)。 温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。可调整严格条件来筛选中度类 似的分子，例如来自远缘生物的同源序列；与高度类似的分子，例如来自近 缘生物的复制功能酶的基因。杂交后洗涤通常决定了严格条件。一组优选的 条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分 钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、 0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用 更高的温度，其中洗涤步骤与上述步骤相同，不同的是将最后两次用0.2X SSC、0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到了60℃。另一组优选的高严 格杂交条件为：用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下处理，然后用2X SSC、 0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间 可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补 的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源 性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相 对稳定性(对应较高的Tm)按下列顺序依次降低：RNA：RNA、 DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导 出了用于计算Tm的公式(Sambrook和Russell，上文)。对于较短核酸 (即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定 了其特异性(Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长 度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核 苷酸，更优选地为至少约20个核苷酸，甚至更优选地为至少30个核苷酸， 甚至更优选地为至少300个核苷酸，最优选地为至少800个核苷酸。此外， 技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗 涤溶液的盐浓度。

如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或 两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。 在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度， 根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和 “相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于下列 文献中所描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑) Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing：Informatics andGenome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic Press，NY(1993)； Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G. 编辑)Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Mole1ular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis  Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton Press，NY(1991)。 确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列 比对和百分比同一性计算可通过LASERGENE生物信息学计算套件中的 Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0 (Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite  (EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics16，(6)：276-277 (2000))进行。序列的多重比对可通过CLUSTAL比对法(例如 CLUSTALW；如1.83版)使用默认参数进行(Higgins和Sharp，CABIOS， 5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680 (1994)；以及Chenna等人，NucleicAcids Res31(13)：3497-500 (2003))，可通过European Bioinformatics Institute得自European  Molecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAP  Existence penalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(例如 Gonnet250)、Protein ENDGAP＝-1、Protein GAPDIST＝4、以及 KTUPLE＝1。在一个实施例中，使用默认设置进行快速或慢速比对，其中优 选慢速比对。作为另外一种选择，可将使用CLUSTALW法(例如1.83版) 的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAP extension＝1、 matrix＝BLOSUM(如BLOSUM64)、WINDOW＝5、以及TOP DIAGONALSSAVED＝5。

在一个方面，合适的分离型核酸分子编码下述多肽，其具有的氨基酸 序列与本文报道的氨基酸序列至少约20％，优选至少30％、33％、40％、 50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、或99％相同。在另一方面，合适的分离型核酸分子编码 下述多肽，其具有的氨基酸序列与本文报道的氨基酸序列至少约20％，优 选至少30％、33％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同；条件是所述多肽 保留CE-7特征基序。合适核酸分子不仅具有上述同源性，而且通常编码长 度为约210个至340个氨基酸，约300个至约340个氨基酸，优选地约310 个至约330个氨基酸，并且最优选地约318至约325个氨基酸的多肽，其中 每个多肽特征在于具有过水解活性。

靶向过水解酶

如本文所用，术语“靶向过水解酶”和“具有过水解活性的靶向酶” 将指包括至少一种融合到/联接到至少一个肽组分上的过水解酶(野生型或 其变体)的融合蛋白，所述肽组分对目标表面，优选靶向身体表面具有亲和 力。在靶向过水解酶内的过水解酶可为任何过水解酶并且可包括脂肪酶、蛋 白酶、酯酶、酰基转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合，只要所述 酶对一种或多种本发明底物具有过水解活性即可。例子可包括但不限于过水 解蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶变体；美国专利公开7,510,859)、过水解 酯酶(例如荧光假单胞菌；美国专利公开7,384,787；SEQ ID NO：477)、 和过水解芳基酯酶(例如耻垢分枝杆菌；美国专利公开7,754,460； WO2005/056782；和EPl689859B1；SEQ ID NO：460[S54V变体]与478[野 生型])。

在一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有与S54V耻垢分 枝杆菌芳基酯酶SEQ ID NO：460具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

在一个实施例中，所述融合蛋白包含来自荧光假单胞菌的过水解酯 酶。在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有与荧光假单胞 菌芳基酯酶SEQ ID NO：477具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，所述融合蛋白包含过水解酶，其具有选自SEQ ID  NO：424、425、426、427、428、429、430、437、438、439、440、441、 442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、 455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、 476、477、478、和479的氨基酸序列。

如本文所用，术语“肽组分”、“对口腔表面具有亲和力的肽组 分”、和“OCBD”将指融合蛋白组分，其不是包括通过肽键接合的两种或 更多种氨基酸的至少一种聚合物的过水解酶部分；其中所述组分对目标口腔 表面具有亲和力。

在一个实施例中，对身体表面具有亲和力的肽组分可为抗体、Fab抗体 片段、单链可变片段(scFv)抗体、骆驼科(Camelidae)抗体 (Muyldermans，S.，Rev.Mol.Biotechnol.，(2001)74：277-302)、非抗 体支架展示蛋白(Hosse等人，Prot.Sci.(2006)15(1)：14-27和Binz， H.等人(2005)Nature Biotechnology23，1257-1268，多种支架辅助方法回 顾)或缺乏免疫球蛋白折叠的单链多肽。在另一方面，对身体表面具有亲和 力的肽组分是缺乏免疫球蛋白折叠单链肽(即，身体表面结合肽或包括至少 一个对口腔表面具有亲和力的身体表面结合肽的身体表面结合域)。在一个 优选的实施例中，所述肽组分是单链肽，其包括一种或多种对口腔表面具有 亲和力的身体表面结合肽。

对口腔表面具有亲和力的肽组分可通过任选的肽接头分离自过水解 酶。某些肽接头/间隔区的长度为1至100或1至50个氨基酸。在一些实施 例中，肽间隔区的长度为约1至约25个、3至约40个、或3至约30个氨基 酸。在其它实施例中，间隔区的长度为约5至约20个氨基酸。可使用多发 性的肽接头。在一个实施例中，存在至少一个肽接头并且它可重复至多10 次。

以前鉴定为对一个身体表面具有亲和力的肽也可对口腔护理表面具有 亲和力。同样地，融合肽可包括至少一个以前报道对另一个身体表面如毛发 (SEQ ID NO：65-221、271、和368)；皮肤(SEQ ID NO：217-269)；或 指/趾甲(SEQ ID NO：270-271)具有亲和力的肽。在一个实施例中，融合 肽包括至少一个口腔表面结合肽，其来自SEQ ID NO：272-382和399-422。 在一个实施例中，融合肽包括至少一个口腔表面结合肽，其选自SEQ ID  NO：272-382、399-410、和412-422；其中SEQ ID NO：272-291和312-382 对牙膜具有亲和力；SEQ ID NO：292-311对牙釉具有亲和力；并且SEQ ID  NO：399-410和412-422对牙釉或牙膜具有亲和力。一些身体表面结合肽可 对多于一种身体表面具有强亲和力，并且同样地可用于靶向不同身体表面的 过水解酶。在另一个实施例中，融合肽可包括设计对目标身体表面具有静电 吸引的任何身体表面结合肽(例如经工程化以静电结合到目标身体表面上的 身体表面结合肽)。

在另一个实施例中，目标表面是包装部分和/或递送于口腔的方法的材 料。选择对应用的一种或多种材料如聚合物、塑料和膜具有亲和力的肽组 分。靶向过水解酶融合蛋白设计通过将过水解酶保持在可移除装置(例如但 不限于牙托或口腔贴)上，允许进行受控的递送以及从使用者中除去过水解 酶。

靶向CE-7过水解酶

在一个优选的实施例中，“靶向过水解酶”是具有过水解活性的靶向 CE-7糖酯酶。如本文所用，术语“靶向CE-7过水解酶”和“靶向CE-7糖 酯酶”将指包括至少一种融合到/联接到至少一个肽组分上的CE-7过水解酶 (野生型过水解酶或其变体)的融合蛋白，所述肽组分对目标表面，优选目 标身体表面具有亲和力。对身体表面具有亲和力的肽组分可为上述那些肽组 分中的任何一种。在一个优选的方面，在靶向CE-7过水解酶中的肽组分是 缺乏免疫球蛋白折叠单链肽(即，身体表面结合肽或包括至少一个对口腔表 面具有亲和力的身体表面结合肽的身体表面结合域)。在一个优选的实施例 中，所述肽组分是单链肽，其包括一种或多种对口腔表面具有亲和力的身体 表面结合肽。

对口腔表面具有亲和力的肽组分可通过任选的肽接头分离自CE-7过水 解酶。某些肽接头/间隔区的长度为1至100或1至50个氨基酸。在一些实 施例中，肽间隔区的长度为约1至约25个、3至约40个、或3至约30个氨 基酸。在其它实施例中间隔区的长度为约5至约20个氨基酸。可使用多发 性的肽接头。

同样地，靶向CE-7过水解酶的例子可包括但不限于具有选自SEQ ID  NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、 56、58、60、62、64、424、437、和476的氨基酸序列的任何CE-7过水解 酶，所述氨基酸序列联接到对口腔表面具有亲和力的肽组分上。在一个优选 的实施例中，靶向过水解酶的例子可包括但不限于具有选自SEQ ID NO： 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、 58、60、62、64、424、437、和476的氨基酸序列的任何CE-7过水解酶， 所述氨基酸序列联接到对口腔表面具有亲和力的一个或多个身体表面结合肽 上(任选地通过肽间隔区)。

在另一个实施例中，靶向CE-7过水解酶可包括以前鉴定为对一个身体 表面具有亲和力的肽，其也可对口腔护理表面具有亲和力。同样地，融合肽 可包括至少一个以前报道对另一个身体表面如毛发(SEQ ID NO：65-221、 271、和368)；皮肤(SEQ ID NO：217-269)；或指/趾甲(SEQ ID NO： 270-271)。在一个实施例中，融合肽包括至少一个口腔表面结合肽，其来 自SEQ ID NO：272-382和399-422。在一个实施例中，CE-7过水解酶融合 肽包括至少一个口腔表面结合肽，其选自SEQ ID NO：272-382、399-410、 和412-422；其中SEQ ID NO：272-291和312-382对牙膜具有亲和力；SEQ ID NO：292-311对牙釉具有亲和力；并且SEQ ID NO：399-410和412-422对 牙釉或牙膜具有亲和力。一些身体表面结合肽可对多于一种身体表面具有强 亲和力，并且同样地可用于靶向不同身体表面的过水解酶。在另一个实施例 中，CE-7过水解酶融合肽可包括设计对目标身体表面具有静电吸引的任何 身体表面结合肽(例如经工程化以静电结合到目标身体表面上的身体表面结 合肽)。

在另一个实施例中，目标表面是包装部分和/或递送于口腔的方法的材 料。选择对应用的一种或多种材料如聚合物、塑料和膜具有亲和力的肽组 分。靶向CE-7过水解酶融合蛋白设计通过将过水解酶保持在可移除装置 (例如牙托或口腔贴)上，允许进行受控的递送以及从使用者中除去过水解 酶。

对身体表面具有亲和力的肽

缺乏免疫球蛋白折叠的单链肽能够结合到口腔表面上，它称为“口腔 表面结合肽”(OCBP)并且可包括例如结合到牙齿表面上的肽(牙齿结合 肽)、对软组织如牙龈具有亲和力的肽、或对口服可接受的材料(其在口腔 中使用是安全的)具有亲和力的肽。牙齿结合肽可包括对牙釉具有亲和力的 肽(“牙釉结合肽”)和对牙膜具有亲和力的肽(“牙膜结合肽”)。

本文提供了对至少一个身体表面具有亲和力的肽的非限制性列表，其 包括那些对毛发具有亲和力的肽(毛发结合肽，其具有选自SEQ ID NO：65- 221、271、和368的氨基酸序列)、对皮肤具有亲和力的肽(皮肤结合肽， 其包含选自SEQ ID NO：217-269的氨基酸序列)、和对指/趾甲具有亲和力 的肽(指/趾甲结合肽，其包含选自SEQ ID NO：270-271的氨基酸序列)。 对口腔表面具有亲和力的肽(口腔结合肽)的例子包括选自SEQ ID NO： 272-382和399-422的氨基酸序列。在一个优选的方面，对口腔表面具有亲 和力的肽选自SEQ ID NO：272-382、399-410、和412-422；其中SEQ ID  NO：272-291和312-382对牙膜具有亲和力；SEQ ID NO：292-311对牙釉具 有亲和力；并且SEQ ID NO：399-410和412-422对牙釉或牙膜具有亲和力。

在一个实施例中，也可对口腔表面具有亲和力的肽可包括SEQ ID NO. 65-382、399-410、和412-422中的一个或多个。优选地，在本发明组合物和 方法中使用的肽选自SEQ ID NO：272-382、399-410、和412-422。在另一个 实施例中，口腔表面结合肽可包括口腔某些表面的皮肤结合肽(例如牙 龈)。在另一个实施例中，融合肽可包括设计对目标身体表面具有静电吸引 的任何身体表面结合肽(例如经工程化以静电结合到目标身体表面上的身体 表面结合肽)。

在另一个实施例中，本发明的组合物和方法包括至少一个口腔表面结 合肽，其具有选自SEQ ID NO：399-410和412-422的氨基酸序列。

在一些实施例中，口腔表面结合域由口腔表面结合肽构成，其长度为 至多约60个氨基酸。在一个实施例中，口腔表面结合肽的长度为5至60个 氨基酸。在其它实施例中，表面结合肽的长度为7至50个氨基酸或7至30 个氨基酸。在其他实施例中，那些口腔表面结合肽的长度为7至27个氨基 酸。

虽然包括口腔表面结合肽的融合肽是本发明的某些实施例，在本发明 的其它实施例中，使用多个口腔表面结合肽可为有利的。包括多个，即，两 个或更多个口腔表面结合肽能够提供例如比包括单个口腔表面结合肽的那些 结合元件甚至更持久的肽组分。在一些实施例中，口腔表面结合域(即，多 个，即，两个或更多个口腔表面结合肽)包括2个至约50个或2个至约25 个口腔表面结合肽。其他实施例包括那些包括2个至约10个或2个至5个 口腔表面结合肽的口腔表面结合域。

多个结合元件(即，口腔表面结合肽或口腔表面结合域)可直接连接 在一起、或它们能够使用肽间隔区连接在一起。某些肽接头/间隔区的长度 为1至100或1至50个氨基酸。在一些实施例中，肽间隔区的长度为约1 至约25个、3至约40个、或3至约30个氨基酸。在其它实施例中间隔区的 长度为约1至约20或约5至约20个氨基酸。

口腔表面结合域和构成它们的较短的口腔表面结合肽能够使用本领域 技术人员已知的任意数量的方法进行鉴定，包括例如任何已知的生物淘选技 术如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示、以及 它们的组合。通常随机或基本上随机(在事件中存在偏差)的肽库对目标身 体表面进行生物淘选以鉴定库中对目标身体表面具有亲和力的肽。

生成肽随机库的方法是熟知的并且可通过多种技术完成，包括细菌展 示(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(7)：4520-4524(1981)， 和Helfman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1)：31-35，(1983))， 酵母展示(Chien等人，Proc Natl Acad Sci USA88(21)：9578-82 (1991))、联合固相肽合成(美国专利公开5,449,754、美国专利公开 5,480,971、美国专利公开5,585,275、美国专利公开5,639,603)、和噬菌体 展示技术(美国专利公开5,223,409、美国专利公开5,403,484、美国专利公 开5,571,698、美国专利公开5,837,500)；核糖体展示(美国专利公开 5,643,768；美国专利5,658,754；和美国专利公开7,074,557)、以及mRNA 展示技术(PROFUSION^TM；参见美国专利公开6,258,558；6,518,018； 6,281,344；6,214,553；6,261,804；6,207,446；6,846,655；6,312,927； 6,602,685；6,416,950；6,429,300；7,078,197；和6,436,665)。

结合亲和力

对口腔表面具有亲和力的肽组分包括10^-5摩尔(M)或更小的口腔表面 结合亲和力。在某些实施例中，肽组分是一个或多个口腔表面结合肽和/或 结合域，它们对人的毛发、皮肤、指/趾甲或口腔具有10^-5摩尔(M)或更 小的结合亲和力。在一些实施例中，结合肽或域在至少约50-500mM盐存在 的情况下将具有10^-5M或更小的结合亲和力值。术语“结合亲和力”是指结 合肽与它的相应底物相互作用的强度，在这种情况下为人的口腔表面(牙 龈、牙齿等)。结合亲和力可根据结合肽的解离常数(“K_D”)、或 “MB₅₀”进行定义或测量。

“K_D”对应于目标上的一半结合位点被占据时的肽浓度，即，此时具 有肽结合(结合目标材料)的目标浓度等于无肽结合的目标浓度。解离常数 越小，肽结合得越牢固。例如，具有纳摩尔(nM)解离常数的肽比具有微 摩尔(μM)解离常数的肽结合得更牢。本发明的某些实施例将具有的K_D值 为10^-5或更小。

“MB₅₀”指结合肽的浓度提供的信号为在基于ELISA的结合测定法中 获得的最大信号的50％。参见例如美国专利公开申请公布2005/022683的实 例3；其以引用方式并入本文。MB₅₀指示络合物组分的结合相互作用或亲 和力的强度。MB₅₀值越低，肽与其对应底物的相互作用越强，即，“越 好”。例如，具有纳摩尔(nM)MB50的肽比具有微摩尔(μM)MB50的 肽结合得更牢。本发明的某些实施例将具有的MB50值为10^-5M或更小。

在一些实施例中，对口腔表面具有亲和力的肽组分可具有结合亲和 力，其通过K_D或MB₅₀值进行测量，该值小于或等于约10^-5M、小于或等于 约10^-6M、小于或等于约10^-7M、小于或等于约10^-8M、小于或等于约10^-9M、或小于或等于约10^-10M。

在一些实施例中，口腔表面结合肽和/或口腔表面结合域可具有结合亲 和力，其通过K_D或MB₅₀值进行测量，该值小于或等于约10^-5M、小于或等 于约10^-6M、小于或等于约10^-7M、小于或等于约10^-8M、小于或等于约10^-9M、或小于或等于约10^-10M。

如本文所用，术语“强亲和力”将指具有的K_D或MB₅₀值小于或等于 约10^-5M、优选地小于或等于约10^-6M、更优选地小于或等于约10^-7M、更 优选地小于或等于约10^-8M、小于或等于约10^-9M、或最优选地小于或等于 约10^-10M的结合亲和力。

多组分过氢羧酸生成系统

用于使多种活性组分分开与混合的系统和装置的设计是本领域已知 的，并且一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多重活性流体(液 体-液体)系统一般使用多室分配瓶或二相系统(例如美国专利公开申请公 布2005/0139608；美国专利公开5,398,846；美国专利公开5,624,634；美国 专利公开6,391,840；欧洲专利公开0807156B1；美国专利公开申请公布 2005/0008526；以及PCT公开WO00/61713)，例如在其中期望的漂白剂在 混合反应性流体时产生的某些漂白应用中发现的。用于产生过氧羧酸的其他 形式的多成分系统可以包括但不限于设计用于一种或多种固体成分或固体液 体成分组合的那些，例如粉剂(例如美国专利5，116,575)、多层片(例如 美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(例如美国专利 6,995,125)和在水添加后反应的固体凝聚物(例如美国专利6,319,888)。

在另一个实施例中，第一组分中的羧酸酯选自：甘油一乙酸酯、甘油 二乙酸酯、甘油三乙酸酯以及它们的组合。在另一个实施例中，第一组分中 的羧酸酯为乙酰化糖。在另一个实施例中，在第一组分中的酶催化剂可为微 粒固体、液体或凝胶。在另一个实施例中，第一反应组分可为固体片或粉 末。

过氧羧酸反应性极强，其浓度通常会随着时间降低。尤其是市售的预 先形成的过氧羧酸组合物更是如此，其通常缺乏长期稳定性。预先形成的过 氧羧酸水溶液还可能存在处理和/或运输方面的困难，尤其是长距离运输大 型容器和/或高浓度过氧羧酸溶液时。此外，预先形成的过氧羧酸溶液可能 无法提供特定目标应用所需的过氧羧酸浓度。因此，非常有必要将各种反应 组分分开，尤其是液体制剂。

通过将两种或更多种组分相结合来制备所需的过氧羧酸的多组分过氧 羧酸生成系统已有所报道。各组分应操作安全并长期稳定(即，用混合后制 备的过氧羧酸的浓度进行衡量)。在一个实施例中，多组分酶催化法过氧羧 酸生成系统的贮存稳定性可以用酶催化剂的稳定性衡量。

本文提供包含多组分过氧羧酸生成制剂的个人护理产品，其使用酶催 化剂以快速制备具有期望过氧羧酸浓度的过酸水溶液。可以在临近使用前和 /或在应用场所(原位)进行混合。在一个实施例中，个人护理产品制剂将 由至少两种组分构成，它们在使用前保持分离。通过混合各组分将快速地形 成过酸水溶液。设计每种组分使得所得过酸水溶液包含适于预期最终用途的 有效过酸浓度。各组分的组成应被设计为：(1)可提供长期的贮存稳定 性，和/或(2)能够促进由过氧羧酸构成的合适含水反应制剂的形成。

该多组分制剂可由至少两种基本上为液体的组分构成。在一个实施例 中，该多组分制剂可为包含第一液体组分和第二液体组分的双组分制剂。术 语“第一”或“第二”液体组分的使用是相对而言的，前提条件是包含指定 成分的两种不同液体组分在使用前保持分离。至少，多组分过氧羧酸制剂包 含(1)至少一种具有过水解活性的酶催化剂，其中所述至少一种酶优选地 在结构上归类为CE-7酯酶，(2)羧酸酯底物，以及(3)过氧源和水，其 中当将组分混合后所述制剂酶促产生期望的过酸。

应仔细选择和平衡在双组分制剂中使用的不同成分的类型和量以提供 (1)每种组分的贮存稳定性，尤其是酶催化剂的过水解活性，和(2)提高 溶解度的物理特性和/或有效形成期望过氧羧酸水溶液的能力(例如，提高 酯底物在含水反应混合物中的溶解度的成分和/或改变至少一种液体组分的 粘度和/浓度的成分[即，至少一种助溶剂，其不对酶的过水解活性具有显著 的不利影响])。

已经公开了用于改善酶促过酸生产体系的性能和/或催化剂稳定性的多 种方法。美国专利公开申请公布2010-0048448A1描述了使用至少一种助溶 剂提高溶解度和/或某些酯底物的混合特性。本发明的个人护理组合物和方 法也可使用助溶剂。在一个实施例中，包含羧酸酯底物和过水解酶催化剂的 组分包含Log P值小于约2的有机溶剂，其中将Log P定义为物质在辛醇与 水之间的分配系数的对数，表示为P＝[溶质]_辛醇/[溶质]_水。描述了对酶活性无 显著不良影响的log P值为2或更小的若干种共溶剂。在另一个实施例中， 共溶剂在包含羧酸酯底物和酶的反应组分中的含量为约20重量％至约70重 量％。包含羧酸酯底物和酶的反应组分可任选地包含一种或多种缓冲剂(例 如，碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基膦酸盐、琥珀 酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、和马来酸盐的钠和/或钾盐)。

美国专利公开申请公布2010-0086534A1描述了双组分体系的使用，其 中所述第一组分包含液体羧酸酯和固体酶粉的制剂；其中所述酶粉包含如下 物质的制剂：(a)具有过水解活性的至少一个CE-7酯酶，和(b)至少一 个低聚糖赋形剂；以及第二组分包含具有过氧源和过氧化氢稳定剂的水。本 发明的个人护理组合物和方法可使用双组分制剂，它类似于在US2010- 0086534A1中描述的体系。同样地，可使用低聚糖赋形剂以辅助稳定酶活 性。在一个实施例中，其中所述寡聚糖赋形剂可具有至少约1250的数均分 子量和至少约9000的重均分子量。在另一个实施例中，其中所述寡聚糖赋 形剂具有至少约1700的数均分子量和至少约15000的重均分子量。在另一 个实施例中，低聚糖是麦芽糖糊精。

美国专利公开申请公布2010-0086535-Al也描述了一种双组分体系，其 中第一组分包含液体羧酸酯和固体酶粉的制剂，所述制剂包含：(a)包含 至少一种具有过水解活性的CE-7酯酶的酶粉和至少一种低聚糖赋形剂，以 及至少一种表面活性剂；和(b)至少一种缓冲剂，其中在优选的实施例 中，缓冲剂作为单独的(即与酶粉分开的)不溶性组分添加到羧酸酯底物 中；并且第二组分包含具有过氧源和过氧化氢稳定剂的水。本发明的个人护 理组合物和方法可使用双组分制剂，它类似于在US2010-0086535A1中描 述的体系。在一个实施例中，所述赋形剂可为具有至少约1250的数均分子 量和至少约9000的重均分子量的寡聚糖赋形剂。在另一个实施例中，其中 所述寡聚糖赋形剂可具有至少约1700的数均分子量和至少约15000的重均 分子量。在另一个实施例中，低聚糖是麦芽糖糊精。在另一个实施例中，任 选的pH缓冲剂为碳酸氢盐缓冲剂。在另一个实施例中，过氧化氢稳定剂为 SL。

酶粉

在一些实施例中，个人护理组合物可使用酶催化剂，其形式为稳定的 酶粉。制备和稳定包含酶粉的制剂的方法在美国专利公开申请公布2010- 0086534和2010-0086535中有所描述。

在一个实施例中，按酶粉干重计，酶在酶粉中的含量可在约5重量％至 约75重量％的范围内。在酶粉/喷雾干燥混合物中，酶的优选重量百分比范 围为约10重量％至50重量％，更优选的重量百分比范围为约20重量％至 33重量％。

在一个实施例中，酶粉还可包含赋形剂。在一个方面，按酶粉的干重 计，赋形剂的含量在约95重量％至约25重量％的范围内。酶粉中赋形剂的 优选重量％范围为约90重量％至50重量％，更优选的重量％范围为约80重 量％至67重量％。

在一个实施例中，用于制备酶粉的赋形剂可为低聚糖赋形剂。在一个 实施例中，其中所述寡聚糖赋形剂具有至少约1250的数均分子量和至少约 9000的重均分子量。在一些实施例中，所述寡聚糖赋形剂具有至少约1700 的数均分子量和至少约15000的重均分子量。具体的低聚糖可包括但不限于 麦芽糖糊精、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖、脱乙酰壳多 糖、棉子糖、水苏(四)糖、果胶、胰岛素、果聚糖、graminan型果聚糖、 支链淀粉、蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、黑曲霉三 糖、麦芽三糖、松三糖、麦芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、以及它们的混合 物。在一个优选的实施例中，低聚糖赋形剂为麦芽糖糊精。寡聚糖类赋形剂 也可包括但不限于水溶性非离子型纤维素醚，如羟甲基纤维素和羟丙基甲基 纤维素、以及它们的混合物。在另一个实施例中，赋形剂可选自但不限于下 列化合物中的一种或多种：海藻糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨醇、葡萄 糖、纤维二糖、α-环糊精、和羧甲基纤维素。

所述制剂可包含至少一种任选的表面活性剂，其中优选地存在至少一 种表面活性剂。表面活性剂可包括但不限于离子型和非离子型表面活性剂或 润湿剂，如乙氧基化蓖麻油、多糖酵解型甘油酯、乙酰化单酸甘油酯、山梨 糖醇酐脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚氧化乙烯脂肪酸山梨糖醇酐酯、聚氧乙烯衍 生物、单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、多 库酯钠、十二烷基硫酸钠、胆酸或其衍生物、卵磷脂、磷脂、乙二醇和丙二 醇的嵌段共聚物、以及非离子有机硅树脂。优选的是，表面活性剂为聚氧化 乙烯脂肪酸山梨糖醇酐酯，更优选的是聚山梨酸酯80。

当制剂包含酶粉时，用于制备酶粉的表面活性剂的含量按酶粉中存在 的蛋白重量计在约5重量％至0.1重量％的范围内，优选地在约2重量％至 0.5重量％的范围内。

酶粉可附加地包含一种或多种缓冲剂(如下列钠盐和/或钾盐：碳酸氢 盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果 酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、和马来酸盐)、以及酶稳定剂(如乙二胺四 乙酸、(1-羟基亚乙基)二膦酸)。

通过对制剂进行喷雾干燥，以形成酶粉，例如大致在下列文献中所 述：“Spray DryingHandbook，，第5版，K.Masters，John Wiley&Sons， Inc.，NY，N.Y.(1991)，以及授予Platz，R.等人的PCT专利公布WO 97/41833和WO96/32149。

一般来讲，喷雾干燥包括将高度分散的液体、足量体积的热空气结合 在一起，从而使液滴蒸发和干燥。通常将进料喷入经过滤的热空气流中，使 溶剂蒸发，并将干燥产物送至收集器。然后将废气与溶剂一起排出。本领域 的技术人员将会知道，可以用若干种不同类型的设备来提供所需的产物。例 如，由Buchi Ltd.(Postfach，Switzerland)或GEA Niro Corp. (Copenhagen，Denmark)制造的市售喷雾干燥机可有效制备期望大小的颗 粒。还将认识到，可以对这些喷雾干燥机进行改动或定制，特别是它们的雾 化器，以用于专门的应用，例如采用双喷嘴技术同时喷雾两种溶液。更具体 地讲，可从一个喷嘴中使油包水乳液雾化，同时可从第二喷嘴中使含防粘剂 (如甘露糖醇)的溶液雾化。在其他情况下，可能期望的是用高压液相色谱 (HPLC)泵通过定制的喷嘴推出料液。只要能够制备出具有正确形态和/或 组成的微结构，那么设备的选择就不是关键性因素，根据本文的教导，其对 技术人员而言将是显而易见的。

对用于干燥喷雾材料的气体而言，其入口和出口温度均应使得不会导 致喷雾材料中的酶发生降解。此类温度通常以实验方法确定，但一般来讲入 口温度将在约50℃至约225℃的范围内，而出口温度将在约30℃至约150℃ 的范围内。优选的参数包括约20至150psi(0.14MPa至1.03MPa)范围内 的雾化压力，优选地在约30-40至100psi(0.21-0.28MPa至0.69MPa)的范 围内。使用的雾化压力通常为下列中的一者(MPa)：0.14、0.21、0.28、 0.34、0.41、0.48、0.55、0.62、0.69、0.76、0.83或以上。

在一个实施例中，“基本上保留酶活性”是指：与制备由羧酸酯和酶 粉构成的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，酶粉或羧酸酯中的酶粉制剂在环 境温度下长期贮存和/或在高温(高于环境温度)下短期贮存后可保留至少 约75％的酶活性。长期贮存是指在环境温度下贮存约一年到约两年。在一 个实施例中，短期贮存是指高温下的一段时间，即从40℃下制备由羧酸酯 和酶粉构成的制剂起至40℃下约八周。在另一个实施例中，高温在约30℃ 至约52℃的范围内。在一个优选的实施例中，高温在约30℃至约40℃的范 围内。

在一些实施例中，与在40℃下制备由羧酸酯和酶粉构成的制剂之前酶 粉的初始酶活性相比，在40℃下贮存八周后，在由羧酸酯和酶粉构成的制 剂中，酶粉保留至少75％的酶活性。在其他实施例中，与在40℃下制备由 羧酸酯和酶粉构成的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，在40℃下贮存八周 后，在由羧酸酯和酶粉构成的制剂中，酶粉保留至少一种酶的至少76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、或100％的酶活性。优选地，过水解活性如 美国专利公开申请公布2010-0086510的实例8-13所述进行测量；但是可使 用测量过水解活性的任何方法。

可以通过下列方法进一步改善指定时间内的酶活性：如美国专利公开 申请公布2010-0086534所述，将在约5.5至约9.5pH值范围内具有缓冲能 力的缓冲剂添加到由羧酸酯和喷雾干燥的酶粉构成的制剂中。适用的缓冲剂 可以包括但不限于下列钠盐、钾盐、或钠盐或钾盐的混合物：碳酸氢盐、焦 磷酸盐、磷酸盐、甲基磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、延胡索酸 盐、酒石酸盐、马来酸盐或琥珀酸盐。在由羧酸酯和喷雾干燥的酶粉构成的 制剂中使用的优选缓冲剂包括下列钠盐、钾盐、或钠盐或钾盐的混合物：碳 酸氢盐、焦磷酸盐、磷酸盐、甲基磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、 延胡索酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或琥珀酸盐。

在羧酸酯和酶粉制剂中可存在缓冲剂的实施例中，按由羧酸酯和酶粉 构成的制剂中羧酸酯的重量计，缓冲剂的含量在约0.01重量％至约50重量 ％的范围内。按由羧酸酯和酶粉构成的制剂中羧酸酯的重量计，缓冲剂的含 量可在约0.10％至约10％的更优选范围内。此外，在这些实施例中，经测 定，酶过水解活性之间的比较为：与在制备由羧酸酯、缓冲剂(在约5.5至 约9.5pH值范围内具有缓冲能力)和酶粉构成的制剂之前酶粉的初始过水 解活性相比，在40℃下贮存八周后在由羧酸酯、缓冲剂(在约5.5至约9.5 pH值范围内具有缓冲能力)和酶粉构成的制剂中酶粉可保留至少一种酶的 至少75％的过水解活性。

本发明意在将干酶粉作为混在有机化合物中的制剂进行贮存，其中有 机化合物为所述至少一种酶的底物，如甘油三乙酸酯。在不存在外加的过氧 化氢的情况下，甘油三乙酸酯在水溶液中通常会被CE-7糖酯酶水解，生成 甘油二乙酸酯和乙酸，而乙酸的生成则会导致反应混合物的pH值下降。酶 在甘油三乙酸酯中保持长期贮存稳定性的一个必要条件是甘油三乙酸酯与甘 油三乙酸酯中可能存在的任何水无明显的反应；在一种市售的甘油三乙酸酯 (由Tessenderlo Group，Brussels，Belgium提供)中，水含量规范为0.03重 量％(300ppm)。将酶贮存于甘油三乙酸酯中时所发生的甘油三乙酸酯的 任何水解会生成乙酸，这会导致CE-7过水解酶活性降低或失活；过水解酶 通常在等于或低于5.0的pH下失活(参见授予DiCosimo，R.等人的美国专 利公开申请公布2009-0005590)。为用于本发明而选择的赋形剂必须在由 于制剂中存在低浓度的水而可能生成乙酸的条件下为有机底物中的酶提供稳 定性。干燥酶粉可贮存为有机化合物中的制剂，所述有机化合物是至少一种 酶的底物，其中所述制剂另外包含赋形剂和一种或多种缓冲剂(例如下列钠 盐和/或钾盐：碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基磷 酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、和马来酸盐)。

用于通过酶催化从羧酸酯和过氢化氧制备过酸的合适反应条件

具有过水解活性的一种或多种酶可用于在本发明的个人护理组合物和 方法中生成有效浓度的期望过酸。在具有过水解活性的酶催化剂存在的情况 下，期望的过氧羧酸可通过羧酸酯与过氧源的反应进行制备，所述过氧源包 括但不限于过氧化氢、过氧化锌、过氧化钠、过氧化脲、过氧化钙、过硼酸 钠、过碳酸钠或过氧化氢复合物。

在靶向过水解酶内的过水解酶可为任何过水解酶并且可包括脂肪酶、 蛋白酶、酯酶、酰基转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合，只要所 述酶对一种或多种本发明底物具有过水解活性即可。例子可包括但不限于过 水解蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶变体；美国专利公开7,510,859)、过水解酯 酶(荧光假单胞菌；美国专利公开7,384,787；“L29P”变体SEQ ID NO： 477)、和过水解芳基酯酶(耻垢分枝杆菌；美国专利公开7,754,460； WO2005/056782；和EP1689859B1；SEQ ID NO：460[S54V变体]与478[野 生型])。

在一个实施例中，酶催化剂包含至少一种具有过水解酶活性的酶，其 中所述酶在结构上归类为CE-7糖酯酶家族的成员(CE-7；参见上文 Coutinho，P.M.和Henrissat，B.)。在另一个实施例中，过水解酶催化剂在 结构上被归类为先锋霉素C脱乙酰酶。在另一个实施例中，过水解酶催化 剂在结构上被归类为乙酰木聚糖酯酶。

在一个实施例中，过水解酶催化剂包含具有过水解活性和特征基序的 酶，所述特征基序包括：

a)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基118-120比对的RGQ基序；

b)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基179-183比对的GXSQG基序；和

c)与SEQ ID NO：2的氨基酸残基298-299比对的HE基序。

在一个优选的实施例中，与参考序列SEQ ID NO：2的比对使用 CLUSTALW进行。

在另一个实施例中，该CE-7特征基序还可包含附加的(即，第四)基 序，其被定义为当用CLUSTALW比对参考序列SEQ ID NO：2时在第267- 269氨基酸残基位置的LXD基序。

在另一个实施例中，过水解酶催化剂包含具有过水解酶活性的酶，所 述酶具有选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、424、437、和476的氨基酸序 列。

在另一个实施例中，过水解酶催化剂包含具有过水解酶活性的酶，所 述酶具有选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、 46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、424、437、和476的氨基酸序 列，其中所述酶可具有一个或多个添加、缺失、或替换，只要保留特征基序 并保持过水解活性即可。

如上所述，CE-7过水解酶可为融合蛋白，其具有包含CE-7过水解酶的 第一部分和包含肽组分的第二部分，所述肽组分对目标身体表面具有亲和 力，使得所述过水解酶“靶向”期望的身体表面。在一个实施例中，任何 CE-7过水解酶(通过存在的CE-7特征基序定义)可结合到能够使所述酶靶 向身体表面的任何肽组分/结合元件上。在一个方面，具有对口腔表面的亲 和力的肽组分可包括抗体、抗体片段(F_ab)、以及单链可变片段(scFv； 免疫球蛋白的重链(V_H)和轻链(V_L)的融合可变区)、单域骆驼抗体、 支架展示蛋白、和缺乏免疫球蛋白折叠的单链亲和肽。包含抗体、抗体片段 和其他免疫球蛋白来源的结合元件、以及大支架展示蛋白的组合物常常是不 经济的。同样地，并且在一个优选的方面，肽组分/结合元件是缺乏免疫球 蛋白折叠和/或免疫球蛋白域的单链亲和肽。短单链身体表面结合肽可根据 经验产生(例如带正电的多肽靶向带负电的表面)或使用对靶向身体表面的 生物淘选产生。使用任意数量的展示技术(例如噬菌体展示、酵母展示、细 菌展示、核糖体展示、和mRNA展示)鉴定/获取亲和肽的方法是本领域为 人们所熟知的。单个口腔表面结合肽可经由任选的间隔区/接头联接到一起 以形成大的结合“域”(本文也称为结合“手”)，从而促进过水解酶附接 /定位于目标口腔表面。

融合蛋白也可包括一个或多个肽接头/间隔区，其分开CE-7过水解酶口 腔表面结合域和/或介于不同的口腔表面结合肽之间(例如当多个口腔表面 结合肽联接在一起形成较大的靶向口腔表面结合域时)。可存在多个肽接头 /间隔区并且接头的数量可重复至多10次。提供了示例性肽间隔区的非限制 性列表，它们是氨基酸序列SEQ ID NO：383-396和在表5中示出的那些。

上文描述了对口腔表面具有亲和力的适用的肽。使用任何上述“展 示”技术鉴定附加的口腔表面结合肽的方法是为人们所熟知的，并且可用于 鉴定附加的口腔表面结合肽。

合适的羧酸酯底物可以包括具有下式的酯：

(a)一种或多种具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X为式R₆C(O)O的酯基；

R₆为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、 支化或环状烃基部分，其中对于R₆＝C2-C7，R₆任选地包含一 个或多个醚键；

R₅为任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基 部分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部分； 其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基，或不超过 一个酯基或羧酸基，并且其中R₅任选地包含一个或多个醚 键；

m为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数，

在25℃下，所述一种或多种酯具有至少5ppm的水中溶 解度；或

(b)一种或多种具有下列结构的甘油酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或

(c)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、 炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、 (CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；或

(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或

(e)(a)至(d)的任何组合。

适合的底物还可以包括一种或多种选自酰化的单糖、二塘、和多糖的 酰化的糖类。在另一个实施例中，酰化的糖类选自乙酰化木聚糖；乙酰化木 聚糖片段；乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)；乙酰化葡萄糖(例如α-D- 葡糖五乙酸酯；β-D-葡糖五乙酸酯；1-硫代-β-D-葡萄糖-2，3，4，6-四乙酸 酯)；β-D-半乳糖五乙酸酯；山梨醇六乙酸酯；蔗糖辛乙酸酯；β-D-呋喃核 糖-1，2，3，5-四乙酸酯；β-D-呋喃核糖-1，2，3，4-四乙酸酯；三-O-乙酰基-D-半乳 醛；三-O-乙酰基-D-葡萄烯糖；β-D-呋喃木糖四乙酸酯；α-D-吡喃葡萄糖五 乙酸酯；β-D-吡喃葡萄糖-1，2，3，4-四乙酸酯；β-D-吡喃葡萄糖-2，3，4，6-四乙酸 酯；2-乙酰氨基-2-脱氧-1，3，4，6-四乙酰-β-D-吡喃葡萄糖；2-乙酰氨基-2-脱氧- 3，4，6-三乙酰-1-氯-α-D-吡喃葡萄糖；α-D-吡喃甘露糖五乙酸酯、和乙酰化纤 维素。在一个优选的实施例中，乙酰化糖选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸 酯；三-O-乙酰基-D-半乳醛；三-O-乙酰基-D-葡萄烯糖；蔗糖辛乙酸酯；和 乙酰化纤维素。

在另一个实施例中，附加的适用底物也可包括5-乙酰氧甲基-2-呋喃甲 醛；3，4-二乙酰氧基-1-丁烯；4-乙酰氧基苯甲酸；乙酰香草醛；丙二醇甲醚 乙酸酯；乳酸甲酯；乳酸乙酯；乙醇酸甲酯；乙醇酸乙酯；甲氧基乙酸甲 酯；甲氧基乙酸乙酯；3-羟基丁酸甲酯；3-羟基丁酸乙酯；和2-乙酰柠檬酸 三乙酯。

在另一个实施例中，适合的底物选自：甘油一乙酸酯；甘油二乙酸 酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一 丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯； 乙酰化木聚糖；乙酰化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯；三-O- 乙酰基-D-半乳醛；三-O-乙酰基-D-葡萄烯糖；下列物质的单酯或二酯：1，2- 乙二醇；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2-丁二醇；1，3-丁二醇；2，3-丁二醇； 1，4-丁二醇；1，2-戊二醇；2，5-戊二醇；1，5-戊二醇；1，6-戊二醇；1，2-己二 醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇；以及它们的混合物。在另一个实施例中，所 述底物为包含一个或多个酯基的C1-C6多元醇。在一个优选的实施例中， 在C1-C6多元醇上的一个或多个羟基被一个或多个乙酰氧基(例如1，3-丙二 醇二乙酸酯；1，2-丙二醇二乙酸酯；1，4-丁二醇二乙酸酯；1，5-戊二醇二乙酸 酯等)取代。在另一个实施例中，所述底物为丙二醇二乙酸酯(PGDA)、 乙二醇二乙酸酯(EGDA)、或它们的混合物。

在另一个实施例中，合适的底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、 甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸 酯、甘油二丁酸酯、和甘油三丁酸酯。在又一方面，所述底物选自甘油二乙 酸酯和甘油三乙酸酯。在最优选的实施例中，适合的底物包括甘油三乙酸 酯。

在一个优选的实施例中，羧酸酯为选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸 酯、甘油三乙酸酯和它们的组合(即混合物)的液体底物。羧酸酯在反应制 剂中存在的浓度当酶催化过水解时足以产生期望浓度的过氧羧酸。羧酸酯不 需要在反应制剂中完全溶解，但是其溶解度足以通过过水解酶催化剂将酯转 化成相应的过氧羧酸。羧酸酯在反应制剂中的浓度为0.05重量％至40重量 ％，优选地为0.1重量％至20重量％，更优选地为0.5重量％至10重量％。

过氧源可包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢 加合物(过氧化脲))、过硼酸盐、过碳酸盐和过氧化物盐。反应制剂中的 过氧化合物的浓度可介于0.0033重量％至约50重量％，优选地0.033重量％ 至约40重量％，更优选地0.1重量％至约30重量％的范围内。

过氧源(即，过氧化氢)也可使用能够制备有效量过氧化氢的酶酶促 产生。例如，可在本发明组合物和方法中使用多种氧化酶以制备有效量的过 氧化氢，所述酶包括但不限于葡萄糖氧化酶、乳糖氧化酶、碳水化合物氧化 酶、醇氧化酶、乙二醇氧化酶、甘油氧化酶、和氨基酸氧化酶。

已经报道多种过水解酶催化剂(全细胞、透化的全细胞、以及部分纯 化的全细胞提取物)具有过氧化氢酶活性(EC111.1.6)。过氧化氢酶催化 过氧化氢转化成氧和水。在一个方面，过水解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。 在另一方面，可将过氧化氢酶抑制剂加到反应制剂中。本领域的技术人员可 以根据需要调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度通常在 0.1mM至约1M的范围内；优选地在约1mM至约50mM的范围内；更优选 地在约1mM至约20mM的范围内。

在另一个实施例中，酶催化剂缺乏明显的过氧化氢酶活性，或可被工 程化以降低或消除过氧化氢酶活性。可以用熟知的技术通过破坏负责过氧化 氢酶活性的基因的表达来下调或消除宿主细胞中的过氧化氢酶活性，这些技 术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变和随机诱变。在一 个优选的实施例中，编码内源过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即，敲 除)。如本文所用，“被破坏的”基因是其中不再存在由改性基因编码的蛋 白的活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，包括但不限 于插入、去除、或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在 另一个优选的实施例中，生产宿主是大肠杆菌生产宿主，其包含破坏的过氧 化氢酶基因，该基因选自katG和katE(参见美国专利公开申请公布2008- 0176299)。在另一个实施例中，生产宿主是大肠杆菌菌株，它包含下调和/ 或破坏的katG和katE过氧化氢酶基因。

含水反应制剂中的催化剂浓度取决于催化剂的催化比活性，并且经选 择以获取期望的反应速率。过水解反应中的催化剂的重量通常在每mL总反 应体积0.0001mg至10mg，优选地每mL总反应体积0.001mg至2.0mg的范 围内。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定到可溶性或不溶 性支持体上；参见例如Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F. Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催 化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂的形式可以是完整的 微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化 的酶、以及它们的混合物。

在一个方面，通过羧酸酯的化学法过水解和酶催化法过水解相结合产 生的过氧羧酸浓度足以提供用于所选个人护理应用的过氧羧酸有效浓度。在 另一方面，本发明的方法提供酶和酶底物的组合以生产期望有效浓度的过氧 羧酸，其中在不加入酶的情况下，产生的过氧羧酸浓度显著更低。虽然在一 些情况下通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应可基本上化学过水解酶 底物，但生成的过氧羧酸浓度可能不足以在期望应用中提供有效的过氧羧酸 浓度，并且加入合适的过水解酶催化剂到反应制剂中显著提高总过氧羧酸浓 度。

在10分钟内，优选地在5分钟内通过过水解至少一种羧酸酯生成的过 氧羧酸(例如过乙酸)的浓度为至少约0.1ppm，优选地至少0.5ppm， 1ppm，5ppm，10ppm，20ppm，100ppm，200ppm，300ppm，500ppm， 700ppm，1000ppm，2000ppm，5000ppm或10,000ppm的过酸，用于启动过 水解反应。包含过氧羧酸的产物制剂可任选地用水或主要包含水的溶液稀释 以制备基于目标应用具有期望的较低浓度过氧羧酸的制剂。明显地，本领域 的技术人员能够调节反应组分和/或稀释量以获得期望的过酸浓度，用于选 择的个人护理产品。

在一个方面，制备所需浓度过酸所需的反应时间不超过约二小时，优 选地不超过约30分钟，更优选地不超过约10分钟，最优选地在约5分钟或 更短的时间内。在其他方面，口腔表面接触根据本文所述方法在混合反应组 分5分钟内形成的过氧羧酸。在一个实施例中，目标口腔表面与根据本文所 述方法在组合所述反应组分约5分钟至约168小时内，或在约5分钟至约 48小时内，或在组合所述反应组分约5分钟至2小时内，或在本文任何此 类时间间隔内产生的过酸接触。

根据本文所述方法形成的过酸用于个人护理产品/应用，其中所述过酸 接触目标口腔表面以向口腔提供基于过酸的益处。在一个实施例中，用于为 目标身体表面制备过酸的方法原位进行。

可对反应温度进行选择，以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。 明显地，对于某些个人护理应用，目标身体表面的温度(例如在口腔内为 37℃)可为反应温度。反应温度范围可以从仅高于反应制剂的凝固点(约0 ℃)至约95℃，优选的范围为5℃至约75℃，更优选的反应温度范围为约5 ℃至约55℃。

包含过氧羧酸的最终反应制剂的pH值为约2至约9，优选约3至约 8，更优选约5至约8，甚至更优选约5.5至约8，甚至更优选约6.0至约 7.5。可以任选地通过添加合适的缓冲剂，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸 盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐，来控制反应和最终反应制剂的pH 值。当使用时，缓冲液浓度通常为0.1mM至1.0M，优选地1mM至 300mM，最优选地10mM至100mM。

在另一方面，酶过水解反应制剂可包含有机溶剂，其作为分散剂提高 反应制剂中的羧酸酯的溶解速率。此类溶剂包括但不限于丙二醇甲醚、丙 酮、环己酮、二乙二醇丁醚、三丙二醇甲醚、二乙二醇单甲醚、丙二醇丁 醚、二丙二醇甲醚、环己醇、苄醇、异丙醇、乙醇、丙二醇、以及它们的混 合物。

单步骤对多步骤施用方法

通常用于酶促制备过酸有益剂的反应组分的最小组将包括(1)至少一 种具有如本文所述的过水解活性的酶，例如CE-7过水解酶(任选地为靶向 融合蛋白形式)，(2)至少一种适用的羧酸酯底物，和(3)过氧源。

个人护理组合物的过酸制备反应组分可在使用前保持分离。在一个实 施例中，混合过酸制备组分并且随后接触目标身体表面，从而使所得基于过 酸的有益剂提供对身体表面的益处。可混合所述组分并随后接触目标身体表 面，或可在目标身体表面上混合。在一个实施例中，混合过酸制备组分，使 得过酸原位产生。

也可使用多步骤施用。过酸制备体系组合物的一个或两个单组分 (即，在身体表面上依次施用三种基础反应组分中的至少一种)可在施用酶 促制备过酸所需的剩余组分之前接触口腔表面。在一个实施例中，过水解酶 先接触口腔表面，随后羧酸酯底物和/或过氧源接触口腔表面(即，“两步 施用”)。在一个实施例中，具有过水解活性的酶是靶向过水解酶，将其施 用于口腔表面，随后混合酶促制备过酸所需的剩余组分。

在一个优选的实施例中，具有过水解活性的酶是“靶向CE-7过水解 酶”(即，CE-7融合蛋白)，将其施用于口腔表面，随后混合酶促制备过 酸所需的剩余组分(即，两步施用方法)。靶向过水解酶在合适条件下接触 口腔表面以促进融合蛋白非共价结合到口腔表面上。可使用任选的冲洗步骤 以除去过多的和/或未结合的融合蛋白，随后混合剩余的反应组分。

在另一个实施例中，将过水解酶(任选地为靶向口腔表面的融合蛋白 形式)和羧酸酯施用于目标口腔表面，随后加入过氧源。

在另一个实施例中，将过水解酶(任选地为靶向口腔表面的融合蛋白 形式)和过氧源(例如包含过氧化氢的水溶液)施用于口腔表面，随后加入 羧酸酯底物。

在另一个实施例中，将过水解酶(任选地为靶向口腔表面的融合蛋白 形式)和过氧源(例如包含过氧化氢的水溶液)施用于口腔表面，随后加入 羧酸酯底物。

在另一个实施例中，可将本文所述的任何组合物或方法组合形成试剂 盒，用于实施本发明。所述试剂盒可包括有利于酶促产生过酸的材料和试 剂。示例性的试剂盒包括底物、过氧源、和具有过水解活性的酶催化剂，其 中所述酶催化剂可任选地靶向口腔表面。其他试剂盒组件可无限制地包括一 种或多种下列组件：样品管、固体载体、说明书材料、以及用于酶促制备过 酸的其他溶液或其它化学试剂，例如可接受的组分或载体。

口腔护理组合物

口服可接受的组分/载体

本发明的组合物和方法也可包括口服可接受的载体以及附加的(即， 除基于过酸的有益剂之外的制剂)口腔护理有益剂。如本文所用，术语“口 腔护理有益剂”是应用于向口腔表面提供期望/益处或属性的化合物或物质 的一般术语。在一个实施例中，用于口腔表面的有益剂可包括(除基于过酸 的有益剂之外的制剂)着色剂，其包括但不限于白色颜料如二氧化钛和白色 矿物如羟基磷灰石或锆石。在另一个实施例中，口腔护理有益剂也可包括增 白剂和附加的酶诸如，例如，氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、脂肪酶、糖苷 酶、酯酶、和多糖水解酶。在另一方面，有益剂可包括抗斑剂、防污剂、和 抗微生物剂。抗微生物剂可包括但不限于抗微生物肽、爪蟾抗菌肽、抗菌 肽、杀菌剂、三氯生、氯己定、十六烷基氯化吡啶鎓、季铵化合物、氯二甲 苯酚、氯乙醇、邻苯二甲酸及其盐、百里酚、以及它们的组合。口腔护理有 益剂也可包括防龋剂如氟化钠或单氟磷酸钠，以及调味剂如冬青、胡椒薄 荷、或留兰香的油、或水杨酸甲酯、桉叶油素、或香草醛。口腔护理有益剂 也可包括凉爽剂如琥珀酸盐基的凉爽剂化合物，以及流涎剂等等。如本文所 用，术语“流涎剂”指当存在于口腔护理组合物中时促使使用者流涎更多的 材料。在一个实施例中，有益剂是批准用于口腔护理产品的口部可接受的材 料。在另一个实施例中，口部可接受的有益剂用于改善牙齿的美容外观。

在口腔上可接受的载体介质中常用的组分的非限制性列表在White等人 的美国专利公开6,740,311；Lawler等人的美国专利公开6,706,256； Fuglsang等人的美国专利公开6,264,925；和Ibrahim等人的美国专利公开申 请公布2005-0069501中有所描述，上述文献每个均全文以引用方式并入本 文。例如，口腔护理组合物可包含一种或多种下列物质：研磨剂、表面活性 剂、抗氧化剂、螯合剂、氟化物源、增稠剂、缓冲剂、溶剂、保湿剂、载 体、膨化剂、抗牙斑剂、防污剂、抗微生物剂、防龋剂、抗炎剂、脱敏剂、 甜味剂、调味剂、口气清新剂、凉爽剂、营养物质、和流涎剂。

应当理解，选择混合物中的组分使得口腔护理组合物保留酶促制备期 望过酸有益剂的能力。本文所公开的口腔护理体系的合适混合物可由本领域 的技术人员使用常规实验来测定。相对于口腔护理组合物的总重量，口腔护 理制剂具有的口腔护理有益剂的总浓度可为按重量计约0.001％至约90％。

口腔护理组合物可包括但不限于牙膏、牙科用乳膏、牙胶或牙粉、漱 口水、口气清新剂、和牙线。附加的实施例包括以糊料或凝胶形式施用反应 组分，它们经由牙托在口腔环境中施用。一种或多种反应组分也可首先沉积 在粘附到釉质的塑料贴上以递送一种或多种反应组分，从而产生过酸有益 剂。在将融合过水解酶沉积到递送装置如贴上的情况下，可设计融合过水解 酶以包括结合元件，其具有对贴材料的亲和力以帮助过水解酶在使用期间沉 积并保持在贴上，以及在使用后移除装置。

用于减少与口腔疾病相关联的微生物或除去非期望的生物膜的基于过酸的口腔护理产品。

基于过酸的口腔护理产品可用于减少与龋齿、齿龈炎、口腔念珠菌 病、或牙周炎相关联的口腔细菌(例如变异链球菌(Streptococcus  mutans))。基于过酸的口腔护理产品可用于减少或除去口腔生物膜。

在一个实施例中，提供了在口腔护理产品中使用具有过水解活性的酶 以产生有效浓度的至少一种过酸，用于漂白、美白、消毒、脱色、除臭或从 口腔表面上除去生物膜的方法。

在一个实施例中，具有过水解活性的酶是靶向过水解酶并且可包括脂 肪酶、蛋白酶、酯酶、酰基转移酶、芳基酯酶、糖酯酶、以及它们的组合， 只要所述酶对一种或多种本发明底物具有过水解活性即可。例子可包括但不 限于过水解蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶变体；美国专利公开 7,510,859)、过水解酯酶(例如荧光假单胞菌；美国专利公开7,384,787； SEQ ID NO：477)、和过水解芳基酯酶(例如耻垢分枝杆菌；美国专利公开 7,754,460；WO2005/056782；和EP1689859B1；SEQ ID NO：460[S54V变 体]与478[野生型])。

在另一个实施例中，提供了在口腔护理产品中使用具有过水解活性的 CE-7糖酯酶以产生有效浓度的至少一种过酸，用于漂白、美白、消毒、脱 色、除臭或从口腔表面上除去生物膜的方法。

在另一个实施例中，也提供了下列过酸制备组合物的用途，其包含：

a)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括酶，所述 酶具有使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO：2比对的CE-7特 征基序，所述特征基序包括：

i)在对应于SEQ ID NO：2的位置118-120的位置处的RGQ基 序；

ii)在对应于SEQ ID NO：2的位置179-183的位置处的GXSQG 基序；和

iii)在对应于SEQ ID NO：2的位置298-299的位置处的HE基序；

和

b)至少一种选自下列的底物：

1)具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基；

R₆＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链、支 化或环状烃基部分，其中对于R₆＝C2-C7，R₆任选地包含一个 或多个醚键；

R₅＝任选地被羟基取代的C1-C6直链、支化或环状烃基部 分或五元环状杂芳族部分或六元环状芳族或杂芳族部分；其中 R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基 或羧酸基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

M为1至R₅中碳原子数量的范围内的整数；并且

其中在25℃下，所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；

2)具有下列结构的甘油酯：

其中R₁＝任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链 或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

3)一种或多种下式的酯：

其中R₁为任选地被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直 链或支链烷基，并且R₂为C1-C10直链或支链烷基、烯基、炔 基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；和

4)选自下列的乙酰化糖：乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多 糖；和

c)过氧源；

从而当混合(a)、(b)、和(c)时形成过酸；其中所述过酸制备制剂用 于治疗或预防龋齿、齿龈炎、口腔念珠菌病、或牙周炎。

用于测定过氧羧酸和过氧化氢浓度的HPLC测定法。

本发明的方法能够使用多种分析方法分析反应物和产物，包括但不限 于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细 管电泳(CE)、由U.Pinkernell等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69 (17)：3623-3627(1997))、以及2，2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺 酸(ABTS)检测分析法(U.Pinkernell等人，Analyst，122：567-571 (1997)和Dinu等人，Adv.Funct.Mater.，20：392-398(2010))，如本 发明例子所述。

确定过氧羧酸的最低生物杀灭浓度

某些个人护理应用可与除去非期望的微生物相关联，举例来说，例如 与身体状态、真菌感染、和龋齿发展相关联的那些。同样地，人们可能想要 测量靶向个人护理应用的最低生物杀灭浓度。如J.Gabrielson等人(J. Microbiol.Methods50：63-73(2002))所述的方法确定过氧羧酸或过氧化 氢与酶底物的最低生物杀灭浓度(MBC)。该检测分析法基于XTT还原抑 制，其中XTT(2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四 唑翁内盐，单钠盐)是氧还染料，该染料通过在490nm或450nm测量的光 密度(OD)变化指示微生物呼吸活性。然而，还有许多种其他方法可用于 检测消毒剂和防腐剂的活性，包括但不限于平板活菌计数、直接显微镜计 数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见，例如Brock、Semour S.， Disinfection，Sterilization，and Preservation，第5版，Lippincott Williams& Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。

重组微生物的表达

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞中产生，尤其是在微 生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞 为微生物宿主，所述微生物宿主可在真菌或细菌家族中找到并且其可在广泛 的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真 菌可为表达本发明核酸分子的合适宿主。过水解酶可在细胞内、细胞外、或 细胞内和细胞外组合表达，其中细胞外表达细胞外表达比细胞内表达能够从 发酵产物中更容易地回收期望蛋白。转录、翻译和蛋白质生物合成仪器相对 于用来产生细胞生物质的细胞原料而言保持不变；无论如何，功能基因将被 表达。宿主菌株的例子包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属 (Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、 毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、 耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属 (Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属 (Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄 杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属 (Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、 短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属 (Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属 (Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌 属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属 (Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属 (Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属 (Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属 (Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属 (Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属 (Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施例中，细菌宿主菌 株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克鲁维酵母 属(Kluyveromyces)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个优选的实施 例中，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌或大肠杆菌(Escherichia coli)。

大规模的微生物生长和功能基因表达可使用广范围的简单或络合碳水 化合物、有机酸和醇或饱和烃如甲烷或二氧化碳(在光合或化学自养宿主情 况下)、不同形式和量的氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量营养素包括(小无 机离子)。可通过加入或不加入特定调节分子到培养物中调节生长速率，并 且通常不认为该调节分子是营养物质或能源。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体 或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染 色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转 录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿 主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管它们无需来源于 此。

可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表 达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。事实上， 任何能够驱动这些4因的启动子均适用于本发明，包括但不限于：CYC1、 HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、 URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在糖酵母属中表达)；AOX1(可用于在 毕赤酵母属中表达)；和lac、araB、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac以及trc (用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子和多个噬菌体启动 子，用于在芽孢杆菌属中表达。

终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施 例中，可任选包括终止控制区。在另一个实施例中，嵌合基因包括源于优选 宿主细胞的终止控制区。

工业生产

多种培养方法可用来生产过水解酶催化剂。例如，从重组微生物宿主 过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方 法进行。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且例 子可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of  Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA (1989)和Deshpande、Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227- 234(1992)。

期望过水解酶催化剂的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是 开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出 等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对 数生长期的恒定高液相密度。或，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中 连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废 弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体支持体进行，所述固体支持体由天然 材料和/或合成材料组成。

从分批发酵、分批补料发酵、或连续培养中回收期望的过水解酶催化 剂可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内生产酶催 化剂时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望 pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使 其匀化，生产出包含期望酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地滤过 合适的助滤剂如硅藻土或二氧化硅以在热处理步骤前除去细胞碎片，所述热 处理步骤用于从酶催化剂溶液中沉淀非期望的蛋白。然后通过膜过滤或离心 将包含所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并且所得的部 分纯化的酶催化剂溶液通过额外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体 (例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并 喷雾干燥以产生包含所需酶催化剂的固体粉末。

当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和 优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或 优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管 所述范围是否被单独地公开。在本文详述数值范围时，除非另外指明，所述 范围旨在包括其端点以及所述范围内的所有整数和分数。当定义一个范围 时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

为演示本发明的优选方面，本文提供了下列例子。本领域的技术人员 应理解的是例子中公开的技术遵循能够有效实施本发明的实践的技术，因此 可将这些技术视为适合其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据 本发明理解的是，在不背离本发明所公开的方法和例子的精神和范围的情况 下，可对所公开的具体实施例进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。

所有试剂和材料获取自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、 GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、Roche  Diagnostics Corporation(Indianapolis，IN)、Thermo Scientific(Pierce  Protein Research Products)(Rockford，IL)或Sigma-Aldrich Chemical  Company(St.Louis，MO)，除非另外指明。

本说明书中的下列缩写对应于量度、技术、特性、或化合物的单位如 下：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL” 指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔，“M”指摩尔， “mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分之一或几，“wt”指重量，“wt％” 指重量百分比，“g”指克，“μg”指微克，“mg”指毫克，“ng”指纳 克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱，“dd H₂O”指蒸馏并去离 子水，“dcw”指干细胞重量，“ATCC”或指美国典型培养物 保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，“U”指过 水解酶活性单位，“rpm”指每分钟转数，“Tg”指玻璃化转变温度，并且 “EDTA”指乙二胺四乙酸。

表达载体pLD001

质粒pLD001(SEQ ID NO：397)以前已经报道为大肠杆菌的适宜表达 载体(参见授予Wang等人的美国专利公开申请公布2010-0158823A1；以 引用方式并入本文)。

载体pLD001来源于可商购获得的载体pDEST17(Invitrogen， Carlsbad，CA)。它包括来源于可商购获得的载体pET31b(Novagen， Madison，WI)的序列，该序列编码酮类固醇异构酶的片段(KSI)。以融 合伴侣的形式包括KSI片段以促进分开的肽进入大肠杆菌中的不溶解包含 体中。使用标准诱变方法修改来自pET31b的编码序列(QuickChange II， Stratagene，La Jolla，CA)以包括除存在于野生型序列中的一个半胱氨酸密 码子之外的三个附加的半胱氨酸密码子。此外，编码序列中的所有Asp密 码子被Glu密码子取代。质粒pLD001以SEQ ID NO：397提供，它使用本领 域的技术人员熟知的标准重组DNA方法构建。

实例1

过乙酸作为牙齿漂白剂的效果

这个实例描述了使用过乙酸以获得对有色斑的模型釉质表面的漂白效 应。牛釉质门牙获取自SE Dental(Baton Rouge，LA)。使用具有金刚石刀 片的转锯(Robert Bosch Power Tool Corporation；Chicago，IL) 将牙齿切开并切成每个面大约7mm的釉质块。清洁釉质块并略微打磨以除 去表面碎屑。用咖啡和茶的混合物预处理釉质1-5天以使其颜色类似于人的 有色斑的牙齿。

在使用前在水中水合每个釉质块至少1小时。在暴露于测试溶液前对 基质进行颜色测量。在pH7.2的500mM磷酸钠缓冲液中用32％的原液制备 过乙酸溶液。也在相同缓冲液中制备2.5％的H₂O₂溶液。多个釉质块暴露于 各个溶液1分钟，随后另外暴露5分钟、10分钟、15分钟和30分钟。对于 每次处理，用原液制备过乙酸和过氧化氢的新溶液。在每次处理釉质块后， 用水冲洗并用Konica-Minolta2600d分光光度计进行测量。测定每个样品的 白度指数，在表1和2中列出。

白度指数(WI)由国际照明委员会(Intemational Commission on  Illumination，CIE)定义并在ASTM方法E313-05中有所描述，并且对于 D65/10入射光进行如下计算：

WI＝Y+800*(0.3138-x)+1700*(0.3310-y)

其中Y、x、和y是各个釉质基质的亮度因数和色度坐标。

表1：过乙酸与过氢化氧对有色斑牛釉质的漂白比较。

表2：不同浓度的过乙酸与过氢化氢对有色斑牛釉质的漂白比较。

白度指数变为较大的正值指示美白效应。样品的视觉检查也显示了过 乙酸处理样品与缓冲液和过氧化氢对照相比更明显的美白效应。这一数据表 明过乙酸是有效的漂白剂并提供了比较低浓度的过氧化氢更优异的性能。

实例2

使用标准生物淘选选择牙釉和牙膜结合肽

该实例的目的是使用标准噬菌体展示生物淘选方法鉴定与牙釉和牙膜 结合的噬菌体肽。

牛釉质门牙获取自SE Dental(Baton Rouge，LA)。将牙齿切成大约 5mm平方的大小并进行打磨以除去表面碎屑。釉质块在使用前进行灭菌。 将釉质块插入包含模塑材料的具孔板中以便仅暴露孔中的釉质表面。通过将 釉质块安装在蜡底座上用于在口中孵育30分钟以形成包被薄膜的表面，在 附加的釉质块上形成薄膜。用牙膏(Colgate- Palmolive，New York，NY)的1∶2浆液刷洗包被薄膜的釉质基质，并且再 孵育附加的30分钟。从蜡中移出一部分釉质块并插入具孔板中，而其他部 分在插入具孔板前进行再刷洗。所述插入方法使得溶液仅接触釉质和包被薄 膜的釉质表面。

然后基质在封闭缓冲液中孵育1小时，孵育温度为室温(～22℃；包含 lmg/mL牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH7.2(Pierce BUPH^TM#28372)， 含有0.1％20(PBST)，随后用PBST洗涤2次。将包含长度为15 至20个氨基酸的随机肽插入序列的噬菌体库(10¹¹pfu)加入到每个孔中。 最终结合溶液包含10¹¹pfu噬菌体，10％UV处理的全唾液和在0.1％ 20(PBST)中的1mg/mL BSA。在37℃下以50rpm振荡孵育30分 钟后，将液体抽吸出每个孔除去未结合的噬菌体，随后用1.0mL PBST洗涤 6次。

然后将釉质块转移到洁净管中并将在0.2M甘氨酸-HCl中由1mg/mL BSA组成的、pH2.2的1mL洗脱缓冲液加入到每个孔中，孵育10分钟以洗 脱结合的噬菌体。然后将由1M Tris-HCl组成的、pH9.1的167μL中和缓冲 液加入到每个孔中。在洗脱缓冲液中以及釉质块上的噬菌体微粒通过与 20mL稀释的大肠杆菌ER2738细胞一起在37℃下孵育4.5小时进行扩增， 所述稀释细胞来自在LB培养基中1∶100稀释的过夜培养物。在这段时间 后，将细胞培养物离心2分钟并将上部15mL的上清液转移到新管中，加入 2.5mL PEG/NaCl(20％聚乙二醇-800，2.5M氯化钠)，使噬菌体在4℃下沉 淀过夜。通过在10,000×g、4℃条件下离心收集沉淀物并将所得沉淀物重悬 在1mL PBS中。这是第一轮扩增原液。然后按照标准规程滴定扩增的第一 轮噬菌体原液。为了进行随后多轮的生物淘选，使用来自前一轮的超过2× 10¹¹pfu的噬菌体原液。在第一轮之后附加的每轮也包括用人的全唾液(在 室温下UV处理2小时)进行的附加洗涤、用pH9.4的碳酸盐缓冲液 (Pierce BUPH^TM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液#28382)进行的两次洗涤、用pH 2.5的50mM磷酸盐缓冲液进行的2次洗涤、以及随后用标准PBST进行的2 次洗涤。

在第3轮生物淘选和其后每轮之后，分离95个随机单噬菌体噬菌斑， 并且使用Illustra Templiphi500扩增试剂盒(GE Healthcare，Piscataway， NJ)制备单链噬菌体基因组DNA并用-96gIII测序引物(5’- CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’；SEQ ID NO：398)在DuPont Sequencing  Facility测序。展示肽位置紧随基因III信号肽之后。基于肽序列，鉴定12个 候选噬菌体用于进一步的结合分析，如表3所示。

表3：牙釉结合和薄膜结合肽序列。

序列ID 序列 SEQ ID NO： P30l SNATMYNIQSHSHHQ 399 P302 QAAQVHMMQHSRPTT 400 P303 HDPYTMKSALRQSTS 401 P304 DLGTFPNRTLKMAAH 402 P305 DTIHPNKMKSPSSPL 403 P306 GSNNHLPSTVPRLTV 404 P307 SNPIPNFAHDLRHSKYNS 405 P308 TKPPRTPTANTSRPHHNF 406 P309 ANSGFPIWLQKYPWSEVQQE 407 P310 ATPRLTPEAHHKAGNWYAS 408 P311 ATPSQHRYGLMQNHAPNGIE 409 P312 GMGSEVLSQYPQAPVG 410

实例3

表征釉质上的牙齿结合候选

这个实例的目的是使用合成制备的肽确认釉质表面上的肽组合物的结 合。

使用从表3中获得的序列制备总计11个合成肽。肽得自SynBioSci  Corp.(Livermore，CA)，其C末端具有生物素标记的赖氨酸。

如实例2所述来制备釉质基质。将每个基质在室温(～22℃)下与1mL 封闭液一起孵育1小时，所述封闭液由在PBST(Pierce BUPHTM#28372，含 有0.1％的20)中的1mg/mL BSA组成。通过将液体抽吸出每个孔 来移除封闭液。用包含PBST的洗涤缓冲液冲洗管2次。孔中填充有500μL 的20μM肽溶液，其通过在封闭液中稀释来制备。样品在37℃、缓慢振荡 条件下孵育30分钟。用PBST洗涤6次以除去未结合肽。然后加入在PBST 中以1∶1000稀释的500μL辣根过氧化物酶/链霉亲和素缀合物(Pierce #22127)并在室温(～22℃)下孵育1小时。除去缀合物溶液并用TBST洗 涤釉质块4次。

从孔中移出每个釉质基质并在15-mL测试管中用10mL PBST再次洗 涤。然后将每个釉质基质安装在洁净具孔板中，仅有釉质表面暴露。将 200μL QUANTABLU^TM基质溶液(Thermo-Fisher，Rockford，IL； #1856187)直接加入每个釉质块。将该溶液在室温培养20分钟。加入 200μL QUANTABLU^TM终止溶液(Thermo Fisher)。在混合后，将200μL溶 液转移到清洁的96孔黑色微量离心板中。使用微板分光光度计(Molecular  Devices，Sunnyvale，CA)，利用325nm的激发和420nm的发射，在无截 止波长的情况下测量所述板的荧光。表4给出了所得的荧光值。11个薄膜/ 釉质结合候选的分析与已知的结合肽DenP03进行比较。每个序列与三个平 行测定的釉质基质一起检测。

表4：获取自生物淘选的结合候选在牛釉质上的合成肽ELISA结果。

实例4

构建过水解酶和过水解酶融合

这个实例描述了用于经由釉质结合序列生产靶向釉质的过水解酶表达 系统的设计。

设计编码将具有过水解活性的酶(“过水解酶”)融合到釉质结合域 上的基因以具有表5列出的多个酶的多核苷酸序列，它们在编码多个氨基酸 柔性接头的核苷酸序列3’-末端融合；每个接头还融合到如表6所述的釉质 结合域或非结合序列对照上。基因经密码子优化以在大肠杆菌中表达，并且 通过DNA2.0(Menlo Park，California)合成。在质粒中克隆编码序列，它 在T7启动子(表达载体pLD001(SEQ ID NO：397))或pBAD启动子之 后，在NdeI和AscI限制性位点之间产生质粒。为了表达融合蛋白，将质粒 转移到适宜的表达宿主中：在T7启动子控制下用于构建体的大肠杆菌菌株 BL21AI(Invitrogen，Carlsbad，California)，或在pBAD启动子控制下用于 构建体的大肠杆菌MG1655AraBAD衍生物。

在表5中列出的非靶向过水解酶变体相似地进行克隆。海栖热袍菌 (Thermotoga maritima)变体的制备和重组表达以前已经由DiCosimo等人 在美国专利公开申请公布2010-0087529中报道；其以引用方式并入本文。

附加的CE-7过水解酶来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(乙酰木 聚糖酯酶；SEQ ID NO：40)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti) (乙酰木聚糖酯酶；SEQ ID NO：42)、和短小芽孢杆菌(Bacillus  pumilus)(乙酰木聚糖酯酶；SEQ ID NO：10)，它们以相似地方式进行克 隆。来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、百脉根中慢生根瘤菌 (Mesorhizobium loti)、和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的CE-7过水 解酶的克隆和表达以前已经由DiCosimo等人在美国专利公开申请公布 2011-0081693和美国专利公开7,951,566中报道；它们每个均以引用方式并 入本文。

不属于CE-7过水解酶家族的过水解酶也以相似的方式克隆。耻垢分枝 杆菌芳基酯酶(“ArE；野生型序列是SEQ ID NO：478；S54V变体以 SEQ ID NO：460提供)具有过水解活性，它在美国专利公开7,754,460中有 所描述。荧光假单胞菌酯酶变体L29P(“Pfl；SEQ ID NO：477)具有过 水解活性，它在美国专利公开7,384,787中有所描述。

实例5

制备融合蛋白

这个实例描述了在具有和不具有用于结合到口腔表面上的靶向序列的 情况下过水解酶的表达和纯化。

菌株在包含50mg/L奇放线菌素的1L自动诱导培养基(10g/L胰蛋白 胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，50mM Na₂HPO₄，50mM KH₂PO₄， 25mM(NH₄)₂SO₄，3mM MgSO₄，0.75％甘油，0.075％葡萄糖和0.05％阿拉伯 糖)中，在200rpm搅拌、37℃条件下生长20小时。未靶向的过水解酶的生 产以前已经在授予DiCosimo等人的美国专利公开申请公布2010-0087529中 进行了描述。靶向过水解酶的生产按照相似的方案进行。通过在8000rpm下 离心来收获细胞，并且通过将细胞沉淀物重悬在20mL的50mM磷酸钾缓冲 液(pH7.1，包含1mm DTT)中进行洗涤。在8000rpm下再次离心所述溶 液，除去上清液并在包含DTT的磷酸盐缓冲液中再次分散所述沉淀物。然 后匀化所述溶液30秒以分散所述沉淀物(Brinkman匀化器，PCUll型)。 然后通过French Press(SLM Instruments)在13,000psi(～89.6MPa)下加工 所述溶液以裂解细胞。再通过压机两次以加工溶液，达到完全裂解效果。然 后将细胞溶液转移到锥形管中，并在8500rpm下离心5分钟。对于海栖热袍 菌(T.maritima)构建体，除去上清液并在80℃下加热30分钟。再次离心 溶液并将上清液转移到清洁小瓶中。

对于非嗜热酶，不利用热处理来纯化所述酶，使其与污染的细胞组分 分离。相反地，使用利用Co-NTA琼脂糖的金属螯合色谱融合到酶C末端 的His6标签(HisPur Cobalt Resin，Thermo Scientific，产品编号：89965) 来纯化样品。通常将细胞提取物加载到5至10mL的Co-NTA琼脂糖柱上， 该柱子用4倍体积的平衡缓冲液(10mM Tris HCl pH7.5，10％甘油，1mM 咪唑和150mM氯化钠)平衡。调节加载到所述柱上的每种提取物的量以含 有5至10mg的融合过水解酶/mL Co-NTA琼脂糖小珠。用两倍床体积的平 衡缓冲液洗涤树脂并用两倍体积的洗脱缓冲液(10mM Tris HCl pH7.5， 10％甘油，150mM咪唑，500mM氯化钠)洗脱。收集片段并通过PAGE确 认全长纯化蛋白的存在。

为了制备构建体EZ-19-至EZ-26，在细胞生产后，通过以8000rpm离 心收获细胞并通过在pH7.2的20mL50mM磷酸钾缓冲液中重悬细胞沉淀物 进行洗涤。在8000rpm下再次离心所述溶液，除去上清液并在磷酸盐缓冲液 中再次分散所述沉淀物。然后匀化所述溶液30秒以分散所述沉淀物 (Brinkman匀化器，PCUl1型)。然后通过French Press(SLM Instruments)在13,000psi(～89.6MPa)下加工所述溶液以裂解细胞。再通过 压机两次以加工溶液，达到完全裂解效果。然后将细胞溶液转移到锥形管 中，并在8500rpm下离心5分钟。以3mL缓冲液/50mL细胞裂解液沉淀物将 不溶解的裂解沉淀物溶解在十二烷基肌氨酸钠缓冲液(50mM磷酸盐缓冲 液，pH7.2，2％-X100和1.5％十二烷基肌氨酸钠)中。离心所述 溶液并将上清液转移到新管中。使用得自Thermo Scientific(Rockford， IL)的HisPur^TM Cobalt Resin试剂盒纯化融合蛋白。

这些生产和纯化方案的输出通常产生2-10mg蛋白/mL，通过聚丙烯酰 胺凝胶电泳(PAGE)分析估计融合过水解酶的纯度介于90％和75％蛋白之 间。通过二喹啉甲酸(BCA)测定法(Thermo Scientific)，使用牛血清白 蛋白溶液作为标准品定量总蛋白。

实例6

将釉质靶向融合过水解酶结合到羟基磷灰石上

这个实例描述了将过水解酶结合到羟基磷灰石颗粒上。羟基磷灰石有 效地模拟釉质。

评估表6中列出的过水解酶结合到羟基磷灰石上的情况。将0.5％固体 分散在pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液中制备分散的羟基磷灰石纳米颗粒 (Aldrich677418)。将酶原液加到羟基磷灰石分散体中，最终浓度为 10μM，并且在微量离心管中，在缓慢搅拌条件下孵育30分钟。每个样品以 10000rpm离心5分钟。移除上清液并加入附加缓冲液。重悬所述颗粒并将 其转移到新管中。再重复该方法两次。制备初始输入的酶样品、用每个洗涤 步骤从颗粒中移除的上清液和最终颗粒进行SDS-PAGE分析，该分析通过 混合60μL样品，20μL LDS缓冲液和8μL还原剂(Nu-PAGE)进行。样品 在85℃下加热10分钟。将25μL每个样品加载到4-12％BisTris凝胶 (Invitrogen)上并在115伏下运行1.5小时。除去凝胶并用1∶1稀释的 Simply Blue stain(Invitrogen)染色过夜，并在去离子水中脱色4小时。分 析凝胶并基于存在的条带预测每个片段中检测到的酶。分析结果在表7中提 供，指示凝胶中每个条带与酶输入(输入＝1)相比较的相对强度，用于确 定羟基磷灰石表面和每个酶之间的结合强度。

表7：保持在羟基磷灰石上的过水解酶。

酶 输入 未结合的 洗涤1 洗涤2 HAP颗粒 EZ-1 1 0.98 0.01 0.0 0.01 EZ-2 1 0.5 0.0 0.0 0.5 EZ-3 1 0.8 0.05 0.05 0.1 EZ-4 1 0.5 0.05 0.05 0.4 EZ-5 1 0.2 0.05 0.05 0.7 EZ-7 1 0.5 0.01 0.0 0.5 EZ-9 1 0.9 0.01 0.00 0.05

表7中的数据表明融合靶向序列的过水解酶在洗涤后保持在羟基磷灰 石上，而非靶向的过水解酶则相反。

实例7

定量在溶液中的过水解酶活性和与羟基磷灰石的结合

这个实例描述了经由其过水解酶活性检测并定量过水解酶的方法，该 方法使用甘油三乙酸酯和过氧化氢以产生过乙酸。

过乙酸的检测按照Pinkernell等人(Analyst，1997，122，567)所述的 方法，使用通过过乙酸的2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)氧 化进行比色检测。在加入甘油三乙酸酯和过氧化氢形成过乙酸后，将90μL 溶液加到在具孔板中的10μL0.1M H₃PO₄中。加入50μL1M乙酸，50μL 0.5g/L ABTS和50μL0.002g/L KI。孵育溶液5分钟。使用微板读数器测量 405nm的溶液吸光度。基于使用过乙酸试剂溶液同时得到的标准曲线计算过 乙酸浓度。

通过制备0.625μg/mL各种酶在pH7.2的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液 来测量溶液中的酶活性。10μL酶溶液与90μL缓冲液，30μL3％甘油三乙酸 酯水溶液，30μL30mM H₂O₂混合。孵育所述溶液5分钟。移出90μL等分 试样以经由如上所述的ABTS氧化进行检测。结果列于表8中。

表8：用ABTS氧化酶与溶液中的甘油三乙酸酯和过氧化氢检测过乙酸

酶ID 减去背景的平均吸光度405nm 无酶 0.000 EZ-1 1.830 EZ-2 1.577 EZ-3 1.751 EZ-5 1.658 EZ-7 1.619

使用相同的ABTS方法测定曾经结合到HAP盘表面上的融合蛋白的过 水解酶活性。羟基磷灰石盘(HiMed Inc，Old Bethpage，NY；5mm直径× 1.8mm厚度)在20μM酶溶液(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.2)中孵育60分 钟，随后洗涤6次(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.2)。将具有酶吸收的盘转 移到新孔中，并且加入200μL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.2)，30μL3％ 甘油三乙酸酯(最终浓度为0.346％)和30μL30mM H₂O₂(最终浓度为 3.46mM)。使溶液在室温下孵育5分钟。将90μL溶液用移液管吸移到包含 10μL100mM H₃PO₄的新孔中。如上所述加入50μL乙酸，50μLKI，50μL ABTS。在室温下孵育溶液5分钟，并且在A405nm下读数。结果列于表9 中。

表9：利用结合到羟基磷灰石的酶，用ABTS检测过乙酸

酶 5分钟时的平均吸光度 减去背景的平均吸光度 PAA浓度μM/盘 无酶，无HAP 0.775 0 0 无酶对照 0.840 0.065 1.2 EZ-1 0.901 0.126 3.5 EZ-5 2.154 1.379 49.7 EZ-7 1.45 1.450 23.5

当结合到羟基磷灰石上并加入甘油三乙酸酯和过氧化氢以产生过乙酸 时，这个实验表明EZ-5和EZ-7是活性酶。EZ-1检测到的低值过乙酸与EZ- 1不结合羟基磷灰石(实例6)并且不存在于表面上以产生过乙酸的其他观 察结果一致。

实例8

定量在溶液中的过水解酶活性和附加的CE-7过水解酶构建体与羟基磷灰石的结合

这个实例描述了CE-7过水解酶和溶液中的相应融合蛋白的过水解活 性，以及当它们结合到羟基磷灰石上时的过水解活性，所述羟基磷灰石来自 海栖热袍菌、短小芽孢杆菌(Bpu)、百脉根中慢生根瘤菌(Mlo)和乳酸 乳杆菌(Lla)，使用甘油三乙酸酯和过氧化氢以生成过乙酸。

评估表6列出的过水解酶的溶液活性。用于测量溶液中的过水解酶活 性的方法在实例7中有所描述，该方法通过制备500μL溶液进行，所述溶 液在pH7.2的100mM磷酸盐缓冲液中包含0.5μM酶，100mM甘油三乙酸 酯，100mM H₂O₂。混合所述溶液并在37℃下孵育10分钟。移出10μL等分 试样并稀释以供检测，如实例7所述。使用用过乙酸(Aldrich)原液生成的 标准曲线测定过乙酸浓度。所述实验也在无酶的情况下进行，用作对照。

表10：不同的融合CE-7过水解酶反应10分钟时在溶液中产生的过乙酸。

酶ID 描述 PAA(ppm) 无酶 --- 378.9 EZ-7 C277S-DenP308 4877.2 EZ-27 Bpu-H6 2332.9 EZ-28 Bpu-HC263 2512.7 EZ-29 Bpu-DenP308 2273.5 EZ-30 Mlo-H6 468.8 EZ-31 Mlo-HC263 434.9 EZ-32 Mlo-DenP308 497.7 EZ-33 Lla-H6 1062.5 EZ-34 Lla-HC263 786 EZ-35 Lla-DenP308 998

为了评估这些构建体与羟基磷灰石的结合，用pH7.2的10mM磷酸盐 缓冲液洗涤33mg羟基磷灰石颗粒(Macro-prep Ceramic Hydroxyapatite  TYPE I，80μm粒径，BioRad，Hercules，CA)。在除去上清液后，将酶原 液加到羟基磷灰石分散体中，最终浓度为10μM，并且在微量离心管中，在 缓慢搅拌条件下孵育30分钟。每个样品以10000rpm离心1分钟。移除上清 液并加入附加缓冲液。重悬所述颗粒并将其转移到新管中。再重复该方法两 次。通过加入500μl溶液测量结合到羟基磷灰石上的酶活性，所述溶液包含 在pH7.2的100mM磷酸盐缓冲液中的100mM甘油三乙酸酯，100mM H₂O₂。溶液在37℃孵育30分钟。移出等分试样并与H₃PO₄混合，并且适度 稀释以经由ABTS氧化进行检测，如实例7所述。以不同方法进行实验，不 加入酶作为每个实验的对照。结果列于表11中。

表11：从结合羟基磷灰石的融合CE-7过水解酶产生过乙酸

酶ID 描述 过乙酸(ppm) 无酶   118.8 EZ-9 C277S-H6 1885.1 EZ-27 Bpu-H6 634.9 EZ-30 Mlo-H6 658.5 EZ-33 Lla-H6 359.1 无酶   30 EZ-2 C277S-HC263 3666.4 EZ-28 Bpu-HC263 534.2 EZ-31 Mlo-HC263 241.4 EZ-34 Lla-HC263 242.2 无酶   113.9 EZ7 C277S-DenP308 4453.7 EZ-29 Bpu-DenP308 1299.8 EZ-32 Mlo-DenP308 419.3 EZ-35 Lla-DenP308 260

实验表明来自Bpu、Mlo和Llo酶的所有融合CE-7过水解酶显示与无 酶的对照相比，在溶液中以及在结合羟基磷灰石表面后的显著过水解酶活 性。来自短小芽孢杆菌的所有三种融合CE-7过水解酶与来自百脉根中慢生 根瘤菌或乳酸乳球菌的融合酶相比具有更高的酶活性。来自短小芽孢杆菌的 靶向EZ-29显示出比非靶向EZ-27更高的结合活性。

实例9

定量在溶液中的过水解酶活性和具有CXH肽的靶向C277S融合过水解酶与羟基磷灰石的结合

这个实例描述了CE-7C277S和具有CXH肽的融合以及它们的过水解 酶活性，使用甘油三乙酸酯和过氧化氢并且当结合羟基磷灰石时在溶液中产 生过乙酸。羟基磷灰石有效地模拟釉质。

评估表6中列出的过水解酶EZ-19至EZ-26在溶液中的酶活性。测量 溶液中过水解酶活性的方法在实例7中有所描述。通过制备500μl十二烷基 肌氨酸钠缓冲液测量溶液中的酶活性，所述缓冲液在100mM甘油三乙酸 酯，100mM H₂O₂和pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液中包含0.5μM各种酶。溶 液在37℃孵育10分钟。在通过混合H₃PO₄终止反应后，移出10μL等分试 样进行适度稀释，然后经由ABTS氧化进行检测，如实例7所述。结果列于 表12中。

也评估相同的融合过水解酶与羟基磷灰石的结合。使用水合羟基磷灰 石盘(5mM直径×1.8mM厚度，得自HiMed Inc)。在pH7.2的10mM磷酸 盐缓冲液中平衡所述盘10分钟。将200μL酶溶液加到羟基磷灰石盘中，最 终浓度在10mM磷酸盐缓冲液中为10μM，并且在微量离心管中，在缓慢搅 拌条件下孵育30分钟。移除上清液并用于未结合的酶活性测定。将所述盘 转移到新管中并用磷酸盐缓冲液冲洗。再重复该方法两次。通过加入500μl 溶液到盘中并在37℃孵育30分钟测量具有结合酶的羟基磷灰石盘的酶活 性，所述溶液包含100mM甘油三乙酸酯，100mM H₂O₂和pH7.2的100mM 磷酸盐缓冲液。在通过混合H₃PO₄终止反应后，移出10μL等分试样进行适 度稀释，然后经由ABTS氧化进行检测，如实例7所述。经多天进行实验， 使用无酶的溶液作为每天的对照。在减去无酶对照后的结果在表12中列 出。

表12：C277s和CXH过水解酶融合蛋白在溶液中以及当结合羟基磷灰石时产生的过乙酸。

所述实验表明所有具有CXH靶向序列的C277S变体是活性的并在溶液 中和当结合羟基磷灰石时产生足量的过乙酸。

实例10

定量在溶液中的过水解酶活性和非CE-7过水解酶构建体与羟基磷灰石的结合

这个实例的目的上展示表6列出的来自耻垢分枝杆菌的靶向或非靶向 芳基酯酶变体和来自荧光假单胞菌的过水解酶变体用于在溶液中以及当结合 羟基磷灰石时产生过乙酸的用途。

对于芳基酯酶构建体，通过制备lmL溶液测量溶液中的酶活性，所述 溶液在pH7.2的100mM磷酸盐缓冲液中包含0.5μM各种酶，100mM甘油 三乙酸酯，和100mM H₂O₂。混合所述溶液并在37℃下孵育30分钟。如实 例7所述，通过移除一部分H₃PO₄终止反应，并且移出10μL等分试样并稀 释以经由ABTS氧化进行检测。

对于在羟基磷灰石上的结合和活性的评估，如实例8所述将芳基酯酶 暴露于羟基磷灰石颗粒，使用33mg用缓冲液洗涤的HAP颗粒(Macro-prep  Ceramic Hydroxyapatite TYPE I，80μm粒径，BioRad，Hercules，CA)，使 用在10mM磷酸盐缓冲液中的10μM溶液。在离心并除去酶溶液后，通过离 心和移除上清液用磷酸盐缓冲液冲洗颗粒。将包含100mM甘油三乙酸酯， 100mM H₂O₂和pH7.2的100mM磷酸盐缓冲液的200μL溶液加到颗粒中并 在37℃下孵育30分钟。如实例7所述，通过移除一部分H₃PO₄终止反应， 并且移出10μL等分试样进行稀释以经由ABTS氧化进行检测。溶液和表面 结合测定的结果在表13中列出。

表13：耻垢分枝杆菌芳基酯酶样品的溶液和表面结合生成的过乙酸

对于荧光假单胞菌构建体，通过混合1mL溶液来测量溶液活性，所述 溶液在pH5.5的1M乙酸钠缓冲液中包含2μM酶，100mM H₂O₂。溶液在 37℃孵育30分钟。如实例7所述，通过移除一部分H₃PO₄终止反应，并且 移出10μL等分试样并稀释以经由ABTS氧化进行检测。对于在羟基磷灰石 上的结合和活性的评估，如实例8所述将荧光假单胞菌酶暴露于在10mM磷 酸盐缓冲液中的20μM羟基磷灰石颗粒，使用100mg用缓冲液洗涤的HAP 颗粒(Macro-prep Ceramic Hydroxyapatite TYPE I，80μm粒径，BioRad， Hercules，CA)。在离心并除去酶溶液后，通过离心和移除上清液用磷酸盐 缓冲液冲洗颗粒。将包含溶解在pH5.5的1M乙酸钠缓冲液中的300mM H₂O₂的200μL溶液加到颗粒中并在37℃下孵育10分钟。如实例7所述，通 过移除一部分H₃PO₄终止反应，并且移出10μL等分试样并稀释以经由 ABTS氧化进行检测。溶液和表面结合测定的结果在表14中列出。

表14：荧光假单胞菌过水解酶样品的溶液和表面结合生成的过乙酸

这些实验表明对于包括靶向序列的构建体，来自除CE-7家族之外的家 族的过水解酶在溶液中以及当结合羟基磷灰石时是活性的。

实例11

定量在溶液中的和结合到牛釉质上的釉质靶向C277S和C277T融合过水解酶变体

这个实例描述了过水解酶融合蛋白与牛釉质的结合以及在溶液中和当 结合到牛釉质上时的酶活性测量。

如实例7所述评估表5列出的过水解酶在溶液中的酶活性。通过制备 500μl溶液测量溶液中的酶活性，所述溶液在100mM甘油三乙酸酯， 100mM H₂O₂和pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液中包含0.5μM各种酶。将该溶 液在37℃下孵育10分钟。在通过混合等分试样与H₃PO₄终止反应后，移出 10μL等分试样进行适度稀释，然后经由ABTS氧化进行检测，如实例7所 述。结果列于表15中。

也评估过水解酶与牛釉质基质的结合。如实例2和3所述来制备釉质 基质。在室温(～22℃)下将每个釉质块在水中水合过夜。然后釉质块用 pH7.2的10mM磷酸钾缓冲液平衡10分钟。釉质基质用缓冲液冲洗3次。 釉质孔填充有500μL10μM酶溶液，其通过在10mM磷酸盐缓冲液中稀释进 行制备。样品在37℃、缓慢振荡条件下孵育30分钟。通过用磷酸盐缓冲液 洗涤4次除去未结合的酶。然后将每个釉质块插入填充有橡皮泥的24孔板 中，仅暴露釉质顶部表面。釉质结合酶的过水解酶活性如实例8所述进行测 量。将100μL反应混合物(pH7.2的100mM磷酸盐缓冲液和100mM H₂O₂以及100mM甘油三乙酸酯)加到釉质顶部并在37℃孵育30分钟。移出 90μL等分试样用于经由ABTS氧化进行检测，如实例8所述。结果列于表 15中。每个样品数据点代表3个独立釉质块的平均值。

表15：海栖热袍菌构建体在溶液中以及当结合牛釉质表面时产生的过乙酸。

这个实验表明使用来自海栖热袍菌序列变体的C227S和C277T的融合 在溶液中以及当结合牛釉质时对于包括靶向序列的构建体是活性的，并且产 生足够水平的过乙酸以美白牙齿。

实例12

以一步施用方法使用过水解酶的牙齿美白功效

这个实例的目的是示出一步施用方法酶促产生的过乙酸的牙齿美白功 效，并且与化学来源的过乙酸达到的功效进行比较。开发两种方法以使用过 水解酶(CE-7过水解酶)体系获得目标牙齿美白水平。第一种方法(本文 称为“一步方法”)包括使用有色斑的模型釉质基质，混合不同量的至少一 种CE-7过水解酶与甘油三乙酸酯(适宜酯底物的一个实例)和过氧化氢以 产生过乙酸。

牛釉质门牙如实例1所述进行制备。有色斑的牛釉质块s在使用前在水 中水合至少1小时以稳定基质颜色。在开始实验前，在水合后测量每个釉质 块的颜色。用每种溶液类型处理三个釉质样品。使用的溶液是仅用作对照的 缓冲液，2.5％H₂O₂，1％过乙酸，包括10μM EZ-1(C277S；SEQ ID NO： 424)的过水解酶组合物，100mM甘油三乙酸酯和250mM H₂O₂，以及 100mM甘油三乙酸酯和250mM H₂O₂的无酶对照。在pH7.2的500mM磷酸 钠缓冲液中制备所有溶液。需要高缓冲液强度以将1％过乙酸溶液保持在中 性pH。所有溶液在每个处理点新鲜制备。酶-甘油三乙酸酯-H₂O₂组合和甘 油三乙酸酯-H₂O₂组合在釉质暴露前即时混合。在每个处理步骤后，用水冲 洗每个釉质块并测量颜色。总处理时间为61分钟，暴露时间为1分钟、5 分钟、10分钟、15分钟和30分钟。通过ABTS氧化的比色检测评估在处理 1分钟、10分钟和30分钟后溶液中的过乙酸浓度。结果在表16和17中提 供。

表16：以1-步施用方法使用的过水解酶体系对有色斑的牛釉质的漂白功效

通过比色方法测定反应混合物中的过乙酸(PAA)浓度，所述测定根 据Dinu等人(同上)描述的方法进行。制备在pH5.0的125mM柠檬酸钾 缓冲液中的1mM2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)，50μM 碘化钾的试剂溶液。25μL样品与975μL这种检测试剂混合并孵育5分钟。 使用微板读数器分析该溶液在405nm的吸光度。通过直接比较吸光度值测 定溶液中过乙酸的相对量比较值。

表17：在指示的处理时间末期评估溶液中的过乙酸浓度。每个样品以1∶100稀释到ABTS检测试剂中，在405nm下测量。

表16中的数据证实酶-酯-过氧化物组合物在美白牙齿方面是有效的。 表17中的数据表明过乙酸由EZ-1(C277S；SEQ ID NO：424)酶、甘油三 乙酸酯和H₂O₂的组合产生。与化学过乙酸的吸光度数据比较也令人惊讶地 表明酶促漂白体系示出更好的美白性能，以及更低的可检出过乙酸。对于包 含甘油三乙酸酯和H₂O₂(它们经检测以1∶10稀释到ABTS试剂中)、无酶 的情况，经过一段时间也产生低水平的过乙酸(不包括在表中)。这产生可 检出的漂白性能，但是与酶催化产生的高水平过乙酸相比，产率要低得多。

实例13

以一步施用方法使用釉质靶向的过水解酶的牙齿漂白功效

这个实例的目的是示出以一步施用方法使用靶向CE-7过水解酶酶促产 生的过乙酸的牙齿美白功效，并且与化学来源的过乙酸达到的功效进行比 较。

牛釉质门牙如实例1所述进行制备。有色斑的牛釉质块在使用前在水 中水合至少1小时以稳定基质颜色。在开始实验前，在水合后测量每个釉质 块的颜色。用每种溶液类型处理两个釉质样品。使用的溶液是仅用作对照的 缓冲液，0.1％过乙酸，包括0.52μM EZ-7(具有釉质结合域的C277S；SEQ  ID NO：429)的过水解酶组合物，100mM甘油三乙酸酯和32.6mM H₂O₂。 在pH7.2的100mM磷酸钠缓冲液中制备所有溶液。所有溶液在每个处理点 新鲜制备。酶-甘油三乙酸酯-H₂O₂组合在釉质暴露前即时混合。在每个处理 步骤后，用水冲洗每个釉质块并测量颜色。每组釉质基质的处理时间为30 分钟，重复4次。通过ABTS氧化的比色检测评估在处理30分钟后溶液中 的过乙酸浓度。结果在表18和19中提供。

表18：以1-步施用方法使用的靶向过水解酶对有色斑的牛釉质的漂白功效。平均来自两种基质的数据。

表19：在指示的处理时间末期评估溶液中的过乙酸浓度。每个样品以1∶10稀释到ABTS检测试剂中，在405nm下测量。

表18中的数据证实酶-酯-过氧化物组合物在以1-步方法美白牙齿方面 是有效的。表19中的数据表明过乙酸由EZ-7酶、甘油三乙酸酯和H₂O₂的 组合产生。

实例14

使用CE-7过水解酶对多种酯底物产生过乙酸

这个实例的目的是展示广泛多种CE-7过水解酶-包括釉质靶向过水解 酶-在口腔护理特定条件下催化从广泛多种酯中形成过乙酸。

海栖热袍菌过水解酶变体被克隆、通过重组表达并以与实例4所述方 式相似的方式纯化。表5列出了在这些过水解酶变体中的序列变化。

对表5列出的至少两种或更多种过水解酶变体测试多种酯底物。除了 三种酯通过常规合成，所有其他酯得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、 TCI America(Portland，OR)、Alpha Aesar(Ward Hill，MA)或Tessendlo  Company(Phoenix，AZ)。

为了对一种酯底物测试多种酶，通过交错每个反应的开始时间0.5-1分 钟方便地同时进行至多4个反应。每个反应在玻璃容器(高度：76mm；外 径：33mm；内径：24mm)中进行，所述玻璃容器配有磁性搅棒。将四个反 应容器捆扎在一起并在带夹套的一升不锈钢回火烧杯(KGW IsoTherm，# TSS-G1000W)中，利用由Thermo NesLab循环浴(Model#RTE-7Digital  One)控制的循环水保持恒温。将缓冲液(6mL，100mM磷酸钠缓冲液， pH7.2)加到每个反应容器中并平衡至37℃。加入所关注的酯底物至浓度为 100mM。通过同时加入40ppm酶和60mM H₂O₂(37μL，30％过氧化氢溶 液)开始反应。在产生过乙酸之后，在1至15分钟的特定时间间隔从每个 反应中移出80μL样品。样品在包含一定体积和浓度磷酸溶液的微量离心过 滤管(NanoSep30K VWR cat#82031-354)中立即淬灭，所述磷酸溶液足以 终止酶反应(通过将pH降低至介于2和3之间)并足以稀释样品以方便地 进行HPLC分析。将酸淬灭的样品离心5分钟以除去任何颗粒。一旦进行了 过滤，立即使用如以前授予DiCosimo等人的美国专利公开7,829,315所述的 方法对每组样品进行Karst反应和过乙酸的HPLC分析。表20列出了由每个 酯底物产生的最大量过乙酸。

在与用于产生表20数据的条件相同的反应条件下，使用靶向C277S过 水解酶变体EZ-7测试这些酯底物的过乙酸生产。在表21中示出了使用丙二 醇二乙酸酯或蔗糖辛乙酸酯，利用EZ-7过水解酶体系生产过乙酸。显示的 数据表明可供选择的酯是如实例5所述的靶向过水解酶变体的有效底物。

表21：使用靶向和非靶向CE-7过水解酶，由可供选择的底物产生的最大量过乙酸。

实例15

使用作用于多种酯底物的CE-7过水解酶进行牙齿漂白

这个实例的目的是为了展示使用CE-7过水解酶的牙齿漂白功效，所述 过水解酶在口腔护理相关条件下从四种酯中催化并形成过乙酸。

对于这个实例，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)过水解酶的C277S (EZ-1)变体被克隆、通过重组表达并如实例4所述纯化。所有底物购自 Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，例外的是甘油三乙酸酯(Tessendlo Company(Phoenix，AZ))。

使用底物甘油三乙酸酯(TA)、α-D-葡糖五乙酸酯(GPA)、蔗糖辛 乙酸酯(SOC)和丙二醇二乙酸酯(PGDA)展示酶介导的牙齿增白，所述 酶为EZ-1(C277S；SEQ ID NO：424)。用于利用每种底物产生过乙酸的最 佳条件来源于实例14的研究并如下列出：

40ppm EZ-1，100mM底物，XmM H₂O₂，95mM磷酸盐，pH7.2，其中X取 决于底物特性而不同；100mM H₂O₂(TA)，360mM H₂O₂(PGDA和 SOC)，60mM H₂O₂(GPA)。

牛釉质门牙如实例1所述进行制备。将有色斑的釉质块置于24孔板 中，其牙质面向下，并且在pH7.2的磷酸盐缓冲液中水合过夜。在处理 前，使用Konica-Minolta2600d分光光度计测量每个牙齿的颜色并如实例1 所述计算白度指数。

在1.5-mL微量离心管(Eppendorf，#2243102-1)中制备每种酶溶液并 将1mL所述溶液立即转移到包含预水合牙齿的24孔板中。对照样品包含 pH7.2的100mM磷酸盐缓冲液和在pH5.3的100mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲 液中的9％H₂O₂。牙齿在室温下孵育30分钟，将其移出、用pH7.2的 100mM磷酸盐冲洗并测量颜色。将牙齿放回24孔板中，在这时制备新酶溶 液并加到每个孔中。这一方法重复进行总计3次美白处理；每次处理30分 钟(表22)。

表22：暴露于40ppm E7-1，100mM底物，不同H₂O₂¹，95mM磷酸盐，pH7.2的咖啡-茶染色的牛釉质的颜色测量

附表说明：¹H₂O₂浓度取决于底物而不同，并且如下所示：100mM H₂O₂(TA)， 360mM H₂O₂(PGDA和SOC)，60mM H₂O₂(GPA)。^a对照样品不含酶。

如表22所示，使用TA、PGDA、SOC和GPA酶促产生的所有过乙酸 样品显示白度指数的显著改变，其经每次连续处理后变为较大的正值。缓冲 液对照的白度指数改变是微小的，ΔWI为11.4。这些测量也与牙齿在每次 30分钟处理后的视觉检查一致。这一数据表明使用多种不同底物，利用EZ- 1酶促产生的过乙酸在美白咖啡-茶染色的牛牙齿方面是有效的。

实例16

以两步施用方法使用过水解酶的牙齿美白功效

这个实例的目的是为了展示以两步施用方法使用的过水解酶体系的牙 齿美白功效。

牛釉质门牙如实例1所述进行制备。将有色斑的釉质块插入48孔板以 保护牙质背面，使其不暴露于溶液。制备每种酶在pH7.2的10mM磷酸盐 缓冲液中的10μM溶液并将每个釉质基质在500μL溶液中孵育60分钟。除 去酶溶液并用附加的500μL缓冲液冲洗每个孔三次。将釉质块置于新孔中 进行美白处理。新制最终浓度为在pH7.2的50mM磷酸盐缓冲液中的 40mM甘油三乙酸酯，100mM H₂O₂溶液，并将500μL溶液加到每个釉质块 中。经过1小时时间，移出釉质块并测量颜色，然后将每个釉质块放回到具 孔板的溶液中。监测每个样品的白度指数。结果列于表23中。

表23：在2步中暴露于多种过水解酶和甘油三乙酸酯/H₂O₂的咖啡-茶染色的牛釉质的颜色测量。

这个实例表明表面结合的过水解酶可通过催化过乙酸在釉质表面形成 来美白牙齿。在这个实例中的漂白性能与观察到的每种酶在羟基磷灰石上的 保持相关联。非靶向的EZ-1(C277S；SEQ ID NO：424)表现出在羟基磷灰 石和釉质上的保持不良，因此其在2-步方法中达到合适的美白效果的潜力 不高。加入有效的靶向序列以将酶保持在釉质上能够以2-步施用方法产生 过乙酸。

实例17

以两步施用方法使用过水解酶的牙齿美白功效

这个实例的目的是为了展示以两步施用方法使用的靶向和非靶向的过 水解酶体系的牙齿美白功效。

牛釉质门牙如实例1所述进行制备。将有色斑的釉质块插入橡皮(Crayola LLC，Easton，PA)填充的孔中，使用24-孔板以保护牙质背面， 使其不暴露于溶液。制备在pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液中的20μM每种 酶的溶液，并将500μL酶溶液加到每个釉质块上，并在37℃孵育10分钟。 釉质块然后每次用附加的500μL缓冲液冲洗三次。将釉质块转移并插入新 的橡皮泥孔，用于美白处理。将包含100mM磷酸盐缓冲液，100mM甘油三 乙酸酯，100mM H₂O₂，pH7.2的溶液(200μL)加到釉质上，并且在37℃ 孵育10分钟。使用镊子从孔中移出釉质块，然后冲洗并贮存在填充有 1.5mL水的孔中进行颜色测量。重复该2-步方法5次(总计50分钟)。在 2-步方法后咖啡-茶染色的牛釉质的颜色测量结果在表24中示出。每个样品 数据点代表独立釉质块的2个重复。

为了测量体系中产生的过乙酸的水平，使用ABTS方法，将90μL反应 混合物移到新孔中，所述新孔包含10μL终止缓冲液(1.33M H₃PO₄)。用 100mM磷酸盐缓冲液进行样品的1∶100稀释，并且将其加到ABTS检测试 剂中，如实例8所述。结果列于表25中。每个样品数据点代表独立釉质块 的2个重复。

表24：在2步中暴露于多种过水解酶和甘油三乙酸酯/H₂O₂的咖啡-茶染色的牛釉质的颜色测量。

表25：在每轮美白处理后产生的过乙酸的水平。

这个实例表明表面结合的过水解酶可通过催化过乙酸在釉质表面形成 来美白牙齿。在这个使用牛釉质的实例中的漂白性能与观察到的每种酶在羟 基磷灰石上的保持相关联。非靶向的EZ-1(C277S)表现出在羟基磷灰石和 釉质上的保持不良，因此其在2-步方法中达到合适的美白效果的潜力不 高。加入有效的靶向序列以将酶保持在釉质上能够以2-步施用方法产生过 乙酸。