编码重组新城疫病毒的cDNA、由该cDNA拯救的病毒及其在治疗恶性肿瘤中的应用

摘要

本发明公开了一种重组病毒，即表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的重组新城疫病毒核苷酸序列及其在肿瘤抑制方面的应用。本发明提供的肿瘤治疗药物，具有良好的肿瘤抑制效果，同时本发明为重组新城疫病毒治疗肿瘤的提供了依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码重组新城疫病毒的cDNA rNDV-TRAIL构建, 由该cDNA拯救的病毒及其在治疗恶性肿瘤中的应用。

背景技术

恶性肿瘤又称癌症，全世界癌症的发病率正以每年3%的速度递增，每年因癌症而死亡人数达600多万人，我国癌症的发病率与死亡人数也呈上升趋势。据统计资料表明我国一些大中城市居民癌症死亡已占据全部死因的首位，因此，加强恶性肿瘤治疗的研究，寻找新型治疗肿瘤方法有着极其重要的意义。

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV)是为不分节段单股负链RNA病毒，在病毒学分类上将其归于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属 (Avulavirus)。大量研究表明，NDV可以有效的杀伤肿瘤，而对正常细胞不产生影响。NDV通过启动不依赖p53的内源性凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡，并激活免疫系统对肿瘤进行识别杀伤和免疫记忆，成为肿瘤治疗领域一个新兴的关注热点。

本研究所涉及相关专利为200510097997.8 、200610001693.1。本研究与之前专利有以下不同：1.本研究所用的毒株为新城疫Clone30株，与之前专利的Lasota株不同；2.本研究所应用的功能为恶性肿瘤治疗，之前的专利功能为防治禽病二价疫苗；3.本研究外源基因的插入位点为HN与L之间，之前专利为P和M之间；故本专利与之前专利有本质不同。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF )家族的成员之一。TRAIL是由281个氨基酸组成的典型的                                                型跨膜蛋白，它的一个最重要的生物学特点是可以选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无明显毒副作用。此外，抗肿瘤谱广，与放疗及化疗药物之间具有明显的协同作用。这些特点使其成为抗肿瘤新药研究 的一个热点。目前，TRAIL在国外已完成临床期实验，证实TRAIL毒副作用低无免疫反应且不会造成任何组织器官受损，并且已进入期临床研究阶段。

发明内容

本发明涉及一段编码重组病毒的cDNA序列，序列含有SEQ ID NOS：1，或由于插入、缺失和突变导致的与SEQ ID NOS：1同源性超过90%以上的衍生DNA序列。

本发明还涉及一种权利要求1所述重组病毒的反向遗传操作系统，该系统包含：

(1)权利要求1所述的序列1；

(2)辅助质粒，包括编码表达NDV的核蛋白（NP）、磷蛋白（P）、大聚合酶蛋白（L）的DNA序列；

(3)NDV病毒的病毒复制许可的宿主细胞，如BHK-21细胞。

具体的，构建表达hTRAIL 重组新城疫LaSota病毒株的基因组cDNA, 由该cDNA拯救出具有特异性感染肿瘤细胞新城疫病毒，及其在治疗恶性肿瘤中的应用，构建重组新城疫LaSota病毒株rNDV-TRAIL主要通过以下技术方案获得并验证其在治疗恶性肿瘤中的作用：

取志愿者外周血，提取人外周血总RNA,反转录成cDNA,如序列2，3所示，根据GenBank上已发表的人TRAIL基因（序列号GI:117606467），设计PCR引物，完整克隆人TRAIL基因。

取蚀斑纯化后NDV Clone 30提取基因组RNA，反转录成cDNA作为模板，分为十段对病毒全基因组进行克隆，并在pBluscript载体上进行组装。在HN与L基因之间引入酶切位点HpaⅠ、PmeⅠ、AscⅠ、MluⅠ酶切位点。在全长cDNA片段5’端加入T7RNA 聚合酶启动子，在全长cDNA片段后连入具有自我催化功能的丁肝核酶序列（GenBank X04451）和T7转录终止信号。构建完成的质粒命名为pBR-NDV-Clone30。以NDV基因组为模板，分别克隆NP、P和L基因连于pBluescript质粒T7启动子下游，分别命名为pBR/NP、pBR/P、pBR/L。

将克隆出的人TRAIL基因用HpaI插入NDV-Clone30株的基因组中构建重组质粒命名为pBR-Clone30-TRAIL。并将pBR-Clone30-TRAIL、pBR/NP、pBR/P、pBR/L共转染表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，拯救出重组新城疫病毒rNDV- TRAIL。

细胞水平上，利用ELISA方法检测出外源基因TRAIL的表达量；利用MTT检测重组病毒感染后，肿瘤细胞的凋亡情况，通过AnnexinV/PI流式细胞仪法分析，重组新城疫病毒诱导细胞凋亡的能力及对肿瘤细胞生长周期的影响。

建立昆明小鼠H22皮下实体瘤模型，建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型，在动物水平上，检测重组新城疫病毒rNDV-TRAIL，对肿瘤的治疗效果及安全性。　

本发明提供的重组新城疫病毒rNDV-TRAIL可有效抑制动物肿瘤生长，具有TRAIL蛋白和新城疫病毒治疗肿瘤的双重优势，可作为药物治疗肿瘤疾病。

附图说明

图1为实施例1中克隆hTRAIL（人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）基因序列分析结果

图2为实施例1中rNDV-TRAIL阳性重组质粒PCR鉴定结果：1为重组质粒rNDV-TRAIL PCR扩增TRAIL基因的结果；M为DL2000 DNA marker；

图3为实施例1中rNDV-TRAIL重组质粒重组质粒HpaI酶切鉴定：M为λT14 digest DNA marker；1为rNDV-TRAIL重组质粒；2为rNDV-TRAIL HpaI酶切鉴定；m为DL2000 DNA Marker

图4为血凝（HA）实验结果

图5为实施例2中利用ELISA方法在B16F10，HepG2，A549和CT26细胞水平上检测TRAIL基因的表达量

图6为实施例3中rNDV-TRAIL和rNDV空载体对HepG2细胞的抑制效果

图7为实施例3中rNDV-TRAIL和rNDV空载体对B16F10细胞的抑制效果

图8为实施例3中rNDV-TRAIL和rNDV空载体对A549细胞的抑制效果

图9为实施例3中RNDV-TRAIL和rNDV空载体对CT26细胞的抑制效果

图10为实施例3中 rNDV-TRAIL以及rNDV空载体作用B16F10和HepG2细胞Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率

图11 为实施例4中rNDV-TRAIL病毒和rNDV空载体病毒治疗小鼠黑色素瘤的效果

图12为实施例4中 rNDV-TRAIL病毒和rNDV空载体病毒治疗小鼠H22肝癌的效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1重组新城疫病毒rNDV-TRAIL的构建

1.  重组新城疫病毒rNDV-TRAIL的构建：人外周血总RNA提取，反转录cDNA,

根据GenBank上已发表的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因序列（序列号GI:117606467），设计PCR引物完整克隆人TRAIL基因。

2.  NDV Clone30株基因组cDNA及辅助质粒的构建：

将蚀斑纯化后NDV Clone 30接种SPF鸡胚尿囊腔，每枚200ml。孵化3～4天后，将鸡胚在-20℃冰箱放置1小时后收取尿囊液，用9日龄SPF鸡胚连续传代两次，所得尿囊液反复冻融3次离心取上清，超速离心（37000rpm）后，-70℃冻存备用。取450ml纯化后病毒，加入蛋白酶K（终浓度500mg/ml和10%SDS 50ml，55℃水浴2h，加500ml预冷的酚氯仿（酚：氯仿=1∶1），剧烈振荡混匀30 sec，12000 r/min，4 ℃ 离心10min。取上清，重复一次。取上清，加等体积氯仿，充分混匀，12000 r/min，4 ℃离心10 min。取上清，加1/10体积的3M NaAc(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-70℃沉降12h。12000r/min，4℃离心30min。用1ml预冷75%乙醇，8000r/min，4℃离心5min洗涤RNA沉淀，弃上清，重复3次，室温干燥。用30μl灭菌DEPC水溶解RNA，-70℃保存备用。以此RNA为模板，将基因组分为10个片段进行完整cDNA克隆，利用各个片段的重叠部分的酶切位点，在转录载体质粒pBluescript质粒进行连接组装，获得15186bp的完整cDNA克隆，在HN与L基因之间引入酶切位点HpaⅠ、PmeⅠ、Hand III、AscⅠ、MluⅠ酶切位点。在全长cDNA片段5’端加入T7RNA 聚合酶启动子，在全长cDNA片段后连入具有自我催化功能的丁肝核酶序列（GenBank X04451）和T7转录终止信号。构建完成的质粒命名为pBR-NDV-Clone30。以NDV基因组为模板，分别克隆NP、P和L基因连于pBluescript质粒T7启动子下游，分别命名为pBR/NP、pBR/P、pBR/L。

3.  将克隆出的人TRAIL基因用HpaI插入NDV-Clone30株的基因组中构建重组质

粒命名为pBR-Clone30-TRAIL。

    结果如图1、2、3所示，成功克隆人TRAIL基因，并成功插入NDV-Clone30株的基因组中。

4.拯救重组新城疫病毒rNDV-TRAIL：表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞接种于六孔板内生长至70-80%单层，取1 μg、0.5 μg、0.25 μg和0.1 μg纯化后去内毒素的质粒pBR-Clone30-TRAIL、pBR/NP、pBR/P、pBR/L采用脂质体转染法，用Lipofe- ctmine 2000转染试剂共转染BHK-21细胞，具体操作步骤参照Invitrogen公司转染试剂说明书进行。转染4 h后弃去培养液，加入完全培养基继续培养，5h后再弃去培养液，加入无血清的培养基Opti-MEM并加入 TPCK（1 μg·ml^-1），继续孵育72 h后细胞在-70℃冷冻，然后反复冻融3次，再4℃低速离心（1 500 rpm/min）收集上清，取100~200 μL接种于9日龄SPF鸡胚。待3-4 d后，收集并混合尿囊液，按常规方法进行血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验。收获HA及HI试验结果为阳性的尿囊液，分装后于-70℃冻存。

    结果如图4所示，为成功拯救出重组新城疫病毒rNDV-TRAIL的血凝实验。

实施例2 细胞水平上，利用ELISA方法检测外源基因人TRAIL的表达量

 将处于对数生长期的人B16F10，HepG2，A549和CT26肿瘤细胞经胰蛋白酶消化后进行收集，制备成1～10×10⁵/mL的细胞悬液，吹打均匀后加入6孔板，待细胞长到80%实验孔以0.1 MOI重组新城疫病毒rNDV-TRAIL以及NDV空载体病毒感染。感染48h后，收获细胞上清，用人TRAIL ELISA试剂盒检测外源基因表达量。

结果如图5所示，证明插重组新城疫病毒rNDV-TRAIL可以在肿瘤细胞内表达人TRAIL蛋白，并分泌到上清培养基中。

实施例3 重组新城疫病毒rNDV-TRAIL对肿瘤的抑制作用、杀伤作用及对肿瘤细胞细胞周期的影响

1.MTT法测定重组新城疫病毒rNDV-TRAIL对肿瘤细胞的抑制作用：将处于对数生长期的人的B16F10，HepG2，A549, CT26细胞经胰蛋白酶消化后进行收集，稀释成210⁴个/mL的肿瘤细胞悬液，吹匀后向96孔板的每孔中加入200 μL肿瘤细胞悬液，在37℃、5% CO₂培养箱中继续培养过夜，弃掉培养基，实验孔内加入用DMEM培养基稀释成0.1 MOI 的病毒稀释液200μL，对照组内加入用DMEM培养基稀释成0.1 MOI的NDV空载体病毒200μL，对照孔内加200μL DMEM培养基。病毒感染1 h后，用 PBS洗涤一次后加入细胞维持液（含有5%的血清），继续培养。分别培养24，48，72，96 h后，向每孔中加入20μL MTT溶液/孔（5 mg/mL）孵育4 h，弃去培养液，每孔再加入150uL DMSO，震荡混匀10min后，用酶联免疫仪于测定波长为490nm 测定OD值。计算细胞生长的抑制率。

    结果如图6、7、8、9所示，表明重组新城疫病毒rNDV-TRAIL对恶性肿瘤细胞B16F10，HepG2、A549，CT26的抑制率与时间呈依赖性关系，在96h达到对肿瘤细胞的最大抑制率。

2.Annexin V/PI法分析重组新城疫病毒rNDV-TRAIL对肿瘤细胞的杀伤效果：将处于对数生长期的B16F10,HepG2、A549和CT26细胞经胰蛋白酶消化后进行收集，并稀释成含0.001%胰酶的5×10⁵/mL的细胞悬液，吹匀后加入6孔板，每孔1mL，待细胞密度达到50-80%，分组进行实验：实验组每孔加入剂量为0.1 MOI 重组新城疫病毒rNDV-TRAIL，对照组每孔分别加入剂量为0.1 MOI的NDV空载体病毒，空白对照组培养孔内加入1mL DMEM。用病毒感染1 h后加入细胞维持液。培养48 h，用0.25%的胰酶消化细胞，冷PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1 × 10⁶ /mL，加入200 μL Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μL FITC标记的Annexin-V，室温下混匀避光反应30 min，最后加入5μL PI和300μL Binding Buffer，避光反应5～15 min后立即用流式细胞术定量检测（一般在1 h以内），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的细胞一管作为阴性对照。

结果如图10所示，重组新城疫病毒rNDV-TRAIL和NDV空载体病毒均可以诱导HepG2和B16F10肿瘤细胞发生凋亡，但经由重组新城疫病毒rNDV-TRAIL处理过的HepG2和B16F10肿瘤细胞的凋亡情况比相同条件下的NDV空载体病毒处理过的细胞效果要更加明显.

实施例4 动物水平检测，重组新城疫病毒rNDV-TRAIL对肿瘤的治疗作用及病毒安全性检测

1.新城疫重组病毒rNDV-TRAIL对昆明小鼠H22肝癌模型肿瘤的治疗作用：

建立昆明小鼠H22肝癌动物模型，取6周龄昆明小鼠进行实验，将H22小鼠肝癌细胞于昆明小鼠腹腔接种，7天后待腹水长出断颈处死。无菌条件下抽取含有H22细胞的腹水，加入适量PBS，配成癌细胞悬液，细胞计数及测定细胞活力，活细胞率达95 %。调整细胞密度为10⁶个细胞/mL备用。每只小鼠右侧腹股沟皮下注入剂量0.2mL，约含2×10⁵个肿瘤细胞。8-12天后形成实体瘤直径在5-8mm，造模成功，可进行后续实验。取直径在5-8 mm的小鼠去除形态、大小差异大的个体，将剩余荷瘤小鼠按体重、瘤体积平均分配原则，随机分为PBS对照组，NDV空载体病毒对照组、重组新城疫病毒rNDV-TRAIL实验组。实验组从第一天起，每两天瘤内注射0.2 mL约5×10⁷ pfu的重组病毒，连续注射四次。NDV空载体对照组与实验组相同注射0.2 mL约5×10⁷ pfu的NDV空载体病毒，PBS对照组从第一天起，每两天瘤内注射0.2 mL的PBS，连续注射四次。

结果如图11所示，证明重组新城疫病毒rNDV-TRAIL抑制黑色素瘤生长的效果极其明显。

2.新城疫重组病毒rNDV-TRAIL对C57BL/6小鼠黑色素瘤模型肿瘤的治疗作用：    

建立C57BL/6小鼠黑色素瘤动物模型，取6周龄C57BL/6小鼠进行实验，将B16F10小鼠黑色素瘤细胞加入适量PBS，配成癌细胞悬液，细胞计数及测定细胞活力，活细胞率达95 %。调整细胞密度为10⁶个细胞/mL备用。每只小鼠右侧脚掌背部注入剂量0.2mL，约含2×10⁵个肿瘤细胞。8-12天后形成黑色素瘤直径在5mm，造模成功，可进行后续实验。待小鼠出现可见肿瘤时即造模成功，去除形态、大小差异大的个体，将剩余荷瘤小鼠按体重、瘤体积平均分配原则，随机分为PBS对照组，NDV空载体病毒对照组、重组新城疫病毒rNDV-TRAIL实验组。实验组从第一天起，每两天瘤内注射0.2 mL约1×10⁷ pfu的重组病毒，连续注射四次。NDV空载体对照组与实验组相同注射0.2 mL约1×10⁷ pfu的NDV空载体病毒，PBS对照组从第一天起，每两天瘤内注射0.2 mL的PBS，连续注射四次。

结果如图12所示,证明重组新城疫病毒rNDV-TRAIL抑制H22肝癌生长的效果极其明显。

3.重组病毒安全性检测:进行急性毒性试验，亚急性毒性试验：

    实验结果证明重组新城疫病毒rNDV-TRAIL对正常小鼠的正常生长无不良影响，将该重组病毒用做治疗小鼠肿瘤安全性可靠。

序列1

    1 CTGGCGTAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC

   51 GTAGCCTGAA TGGCGAATGG GACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG

  101 GCGGGTGTGG TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT

  151 AGCGCCCGCT CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG

  201 GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG GTTCCGATTT

  251 AGTGCTTTAC GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTAGG GTGATGGTTC

  301 ACGTAGTGGG CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG

  351 AGTCCACGTT CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC

  401 AACCCTATCT CGGTCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC

  451 GGCCTATTGG TTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATT

  501 TTAACAAAAT ATTAACGTTT ACAATTTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT

  551 GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA

  601 TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA

  651 GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT

  701 GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT

  751 AAAAGATGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG

  801 ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT

  851 CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG

  901 TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA

  951 ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC

 1001 ATGACAGTAA GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAAGCATGA GTGATAACAC

 1051 TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG

 1101 CTTTTTTTCA CAACATGGGG GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA

 1151 CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC

 1201 TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA

 1251 CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT

 1301 GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA

 1351 TAAATCTGGA GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG

 1401 GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGCAGT

 1451 CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC

 1501 ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT

 1551 AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC

 1601 CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA

 1651 CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT

 1701 TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA

 1751 GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT

 1801 AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC

 1851 CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC

 1901 GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG

 1951 TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT

 2001 CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC

 2051 TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CATTGAGAAA GCGCCACGCT

 2101 TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA

 2151 CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GGAACGCCTG GTATCTTTAT

 2201 AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG

 2251 CTCGTCAGGG GGGCCGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT

 2301 TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG

 2351 TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA

 2401 TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG

 2451 AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG

 2501 ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG

 2551 TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTACCT CACTCATTAG GCACCCCAGG

 2601 CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCCTATGT TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA

 2651 TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTCGG

 2701 AAGCGGCCGC TAATACGACT CACTATAGGG ACCAAACAGA GAATCCGTAA

 2751 GTTACGATAA AAGGCGAAGG AGCAATTGAA GTCGCACGGG TAGAAGGTGT

 2801 GAATCTCGAG TGCGAGCCCG AAGCACAAAC TCGAGAAAGC CTTCTGCCAA

 2851 CATGTCTTCC GTATTTGATG AGTACGAACA GCTCCTCGCG GCTCAGACTC

 2901 GCCCCAATGG AGCTCATGGA GGGGGAGAAA AAGGGAGTAC CTTAAAAGTA

 2951 GACGTCCCGG TATTCACTCT TAACAGTGAT GACCCAGAAG ATAGATGGAG

 3001 CTTTGTGGTA TTCTGCCTCC GGATTGCTGT TAGCGAAGAT GCCAACAAAC

 3051 CACTCAGGCA AGGTGCTCTC ATATCTCTTT TATGCTCCCA CTCACAGGTA

 3101 ATGAGGAACC ATGTTGCCCT TGCAGGGAAA CAGAATGAAG CCACATTGGC

 3151 CGTGCTTGAG ATTGATGGCT TTGCCAACGG CACGCCCCAG TTCAACAATA

 3201 GGAGTGGAGT GTCTGAAGAG AGAGCACAGA GATTTGCGAT GATAGCAGGA

 3251 TCTCTCCCTC GGGCATGCAG CAACGGAACC CCGTTCGTCA CAGCCGGGGC

 3301 CGAAGATGAT GCACCAGAAG ACATCACCGA TACCCTGGAG AGGATCCTCT

 3351 CTATCCAGGC TCAAGTATGG GTCACAGTAG CAAAAGCCAT GACTGCGTAT

 3401 GAGACTGCAG ATGAGTCGGA AACAAGGCGA ATCAATAAGT ATATGCAGCA

 3451 AGGCAGGGTC CAAAAGAAAT ACATCCTCTA CCCCGTATGC AGGAGCACAA

 3501 TCCAACTCAC GATCAGACAG TCTCTTGCAG TCCGCATCTT TTTGGTTAGC

 3551 GAGCTCAAGA GAGGCCGCAA CACGGCAGGT GGTACCTCTA CTTATTATAA

 3601 CCTGGTAGGG GACGTAGACT CATACATCAG GAATACCGGG CTTACTGCAT

 3651 TCTTCTTGAC ACTCAAGTAC GGAATCAACA CCAAGACATC AGCCCTTGCA

 3701 CTTAGTAGCC TCTCAGGCGA CATCCAGAAG ATGAAGCAGC TCATGCGTTT

 3751 GTATCGGATG AAAGGAGATA ATGCGCCGTA CATGACATTA CTTGGTGATA

 3801 GTGACCAGAT GAGCTTTGCG CCTGCCGAGT ATGCACAACT TTACTCCTTT

 3851 GCCATGGGTA TGGCATCAGT CCTAGATAAA GGTACTGGGA AATACCAATT

 3901 TGCCAGGGAC TTTATGAGCA CATCATTCTG GAGACTTGGA GTAGAGTACG

 3951 CTCAGGCTCA GGGAAGTAGC ATTAACGAGG ATATGGCTGC CGAGCTAAAG

 4001 CTAACCCCAG CAGCAAGGAG GGGCCTGGCA GCTGCTGCCC AACGGGTCTC

 4051 CGAGGAGACC AGCAGCATAG ACATGCCTAC TCAACAAGTC GGAGTCCTCA

 4101 CTGGGCTTAG CGAGGGGGGG TCCCAAGCTC TACAAGGCGG ATCGAATAGA

 4151 TCGCAAGGGC AACCAGAAGC CGGGGATGGG GAGACCCAAT TCCTGGATCT

 4201 GATGAGAGCG GTAGCAAATA GCATGAGGGA GGCGCCAAAC TCTGCACAGG

 4251 GCACTCCCCA ATCGGGGCCT CCCCCAACTC CTGGGCCATC CCAAGATAAC

 4301 GACACCGACT GGGGGTATTG ATGGACAAAA CCCAGCCTGC TTCCACAAAA

 4351 ACATCCCAAT GCCCTCACCC GTAGTCGACC CCTCGATTTG CGGCTCTATA

 4401 TGACCACACC CTCAAACAAA CATCCCCCTC TTTCCTCCCT CCCCCTGCTG

 4451 TACAACTCCG CACGCCCTAG ATACCACAGG CACAATGCGG CTCACTAACA

 4501 ATCAAAACAG AGCCGAGGGA ATTAGAAAAA AGTACGGGTA GAAGAGGGAT

 4551 ATTCAGAGAT CAGGGCAAGT CTCCCGAGTC TCTGCTCTCT CCTCTACCTG

 4601 ATAGACCAGG ACAAACATGG CCACCTTTAC AGATGCAGAG ATCGACGAGC

 4651 TATTTGAGAC AAGTGGAACT GTCATTGACA ACATAATTAC AGCCCAGGGT

 4701 AAACCAGCAG AGACTGTTGG AAGGAGTGCA ATCCCACAAG GCAAGACCAA

 4751 GGTGCTGAGC GCAGCATGGG AGAAGCATGG GAGCATCCAG CCACCGGCCA

 4801 GTCAAGACAA CCCCGATCGA CAGGACAGAT CTGACAAACA ACCATCCACA

 4851 CCCGAGCAAA CGACCCCGCA TGACAGCCCG CCGGCCACAT CCGCCGACCA

 4901 GCCCCCCACC CAGGCCACAG ACGAAGCCGT CGACACACAG CTCAGGACCG

 4951 GAGCAAGCAA CTCTCTGCTG TTGATGCTTG ACAAGCTCAG CAATAAATCG

 5001 TCCAATGCTA AAAAGGGCCC ATGGTCGAGC CCCCAAGAGG GGAATCACCA

 5051 ACGTCCGACT CAACAGCAGG GGAGTCAACC CAGTCGCGGA AACAGTCAGG

 5101 AAAGACCGCA GAACCAAGTC AAGGCCGCCC CTGGAAACCA GGGCACAGAC

 5151 GTGAACACAG CATATCATGG ACAATGGGAG GAGTCACAAC TATCAGCTGG

 5201 TGCAACCCCT CATGCTCTCC GATCAAGGCA GAGCCAAGAC AATACCCTTG

 5251 TATCTGCGGA TCATGTCCAG CCACCTGTAG ACTTTGTGCA AGCGATGATG

 5301 TCTATGATGG AGGCGATATC ACAGAGAGTA AGTAAGGTTG ACTATCAGCT

 5351 AGATCTTGTC TTGAAACAGA CATCCTCCAT CCCTATGATG CGGTCCGAAA

 5401 TCCAACAGCT GAAAACATCT GTTGCAGTCA TGGAAGCCAA CTTGGGAATG

 5451 ATGAAGATTC TGGATCCCGG TTGTGCCAAC ATTTCATCTC TGAGTGATCT

 5501 ACGGGCAGTT GCCCGATCTC ACCCGGTTTT AGTTTCAGGC CCTGGAGACC

 5551 CCTCTCCCTA TGTGACACAA GGAGGCGAAA TGGCACTTAA TAAACTTTCG

 5601 CAACCAGTGC CACATCCATC TGAATTGATT AAACCCGCCA CTGCATGCGG

 5651 GCCTGATATA GGAGTGGAAA AGGACACTGT CCGTGCATTG ATCATGTCAC

 5701 GCCCAATGCA CCCGAGTTCT TCAGCCAAGC TCCTAAGCAA GTTAGATGCA

 5751 GCCGGGTCGA TCGAGGAAAT CAGGAAAATC AAGCGCCTTG CTCTAAATGG

 5801 CTAATTACTA CTGCCACACG TAGCGGGTCC CTGTCCACTC GGCATCACAC

 5851 GGAATCTGCA CCGAGTTCCC CCCCGCAGAC CCAAGGTCCA ACTCTCCAAG

 5901 CGGCAATCCT CTCTCGCTTC CTCAGCCCCA CTGAATGATC GCGTAACCGT

 5951 AATTAATCTA GCTACATTTA AGATTAAGAA AAAATACGGG TAGAATTGGA

 6001 GTGCCCCAAT TGTGCCAAGA TGGACTCATC TAGGACAATT GGGCTGTACT

 6051 TTGATTCTGC CCATTCTTCT AGCAACCTGT TAGCATTTCC GATCGTCCTA

 6101 CAAGACACAG GAGATGGGAA GAAGCAAATC GCCCCGCAAT ATAGGATCCA

 6151 GCGCCTTGAC TTGTGGACTG ATAGTAAGGA GGACTCAGTA TTCATCACCA

 6201 CCTATGGATT CATCTTTCAA GTTGGGAATG AAGAAGCCAC TGTCGGCATG

 6251 ATCGATGATA AACCCAAGCG CGAGTTACTT TCCGCTGCGA TGCTCTGCCT

 6301 AGGAAGCGTC CCAAATACCG GAGACCTTAT TGAGCTGGCA AGGGCCTGTC

 6351 TCACTATGAT AGTCACATGC AAGAAGAGTG CAACTAATAC TGAGAGAATG

 6401 GTTTTCTCAG TAGTGCAGGC ACCCCAAGTG CTGCAAAGCT GTAGGGTTGT

 6451 GGCAAACAAA TACTCATCAG TGAATGCAGT CAAGCACGTG AAAGCGCCAG

 6501 AGAAGATTCC CGGGAGTGGA ACCCTAGAAT ACAAGGTGAA CTTTGTCTCC

 6551 TTGACTGTGG TACCGAAGAA GGATGTCTAC AAGATCCCAG CTGCAGTATT

 6601 GAAGGTTTCT GGCTCGAGTC TGTACAATCT TGCGCTCAAT GTCACTATTA

 6651 ATGTGGAGGT AGACCCGAGG AGTCCTTTGG TTAAATCTCT GTCTAAGTCT

 6701 GACAGCGGAT ACTATGCTAA CCTCTTCTTG CATATTGGAC TTATGACCAC

 6751 CGTAGATAGG AAGGGGAAGA AAGTGACATT TGACAAGCTG GAAAAGAAAA

 6801 TAAGGAGCCT TGATCTATCT GTCGGGCTCA GTGATGTGCT CGGGCCTTCC

 6851 GTGTTGGTAA AAGCAAGAGG TGCACGGACT AAGCTTTTGG CACCTTTCTT

 6901 CTCTAGCAGT GGGACAGCCT GCTATCCCAT AGCAAATGCT TCTCCTCAGG

 6951 TGGCCAAGAT ACTCTGGAGT CAAACCGCGT GCCTGCGGAG CGTTAAAATC

 7001 ATTATCCAAG CAGGTACCCA ACGCGCTGTC GCAGTGACCG CCGACCACGA

 7051 GGTTACCTCT ACTAAGCTGG AGAAGGGGCA CACCCTTGCC AAATACAATC

 7101 CTTTTAAGAA ATAAGCTGCG TCTCTGAGAT TGCGCTCCGC CCACTCACCC

 7151 AGATCATCAT GACACAAAAA ACTAATCTGT CTTGATTATT TACAGTTAGT

 7201 TTACCTGTCT ATCAAGTTAG AAAAAACACG GGTAGAAGAT TCTGGATCCC

 7251 GGTTGGCGCC CTCCAGGTGC AAGATGGGCT CCAGACCTTC TACCAAGAAC

 7301 CCAGCACCTA TGATGCTGAC TATCCGGGTT GCGCTGGTAC TGAGTTGCAT

 7351 CTGTCCGGCA AACTCCATTG ATGGCAGGCC TCTTGCAGCT GCAGGAATTG

 7401 TGGTTACAGG AGACAAAGCC GTCAACATAT ACACCTCATC CCAGACAGGA

 7451 TCAATCATAG TTAAGCTCCT CCCGAATCTG CCCAAGGATA AGGAGGCATG

 7501 TGCGAAAGCC CCCTTGGATG CATACAACAG GACATTGACC ACTTTGCTCA

 7551 CCCCCCTTGG TGACTCTATC CGTAGGATAC AAGAGTCTGT GACTACATCT

 7601 GGAGGGGGGA GACAGGGGCG CCTTATAGGC GCCATTATTG GCGGTGTGGC

 7651 TCTTGGGGTT GCAACTGCCG CACAAATAAC AGCGGCCGCA GCTCTGATAC

 7701 AAGCCAAACA AAATGCTGCC AACATCCTCC GACTTAAAGA GAGCATTGCC

 7751 GCAACCAATG AGGCTGTGCA TGAGGTCACT GACGGATTAT CGCAACTAGC

 7801 AGTGGCAGTT GGGAAGATGC AGCAGTTTGT TAATGACCAA TTTAATAAAA

 7851 CAGCTCAGGA ATTAGACTGC ATCAAAATTG CACAGCAAGT TGGTGTAGAG

 7901 CTCAACCTGT ACCTAACCGA ATTGACTACA GTATTCGGAC CACAAATCAC

 7951 TTCACCTGCT TTAAACAAGC TGACTATTCA GGCACTTTAC AATCTAGCTG

 8001 GTGGAAATAT GGATTACTTA TTGACTAAGT TAGGTGTAGG GAACAATCAA

 8051 CTCAGCTCAT TAATCGGTAG CGGCTTAATC ACCGGTAACC CTATTCTATA

 8101 CGACTCACAG ACTCAACTCT TGGGTATACA GGTAACTCTA CCTTCAGTCG

 8151 GGAACCTAAA TAATATGCGT GCCACCTACT TGGAAACCTT ATCCGTAAGC

 8201 ACAACCAGGG GATTTGCCTC GGCACTTGTC CCAAAAGTGG TGACACAGGT

 8251 CGGTTCTGTG ATAGAAGAAC TTGACACCTC ATACTGTATA GAAACTGACT

 8301 TAGATTTATA TTGTACAAGA ATAGTAACGT TCCCTATGTC CCCTGGTATT

 8351 TATTCCTGCT TGAGCGGCAA TACGTCGGCC TGTATGTACT CAAAGACCGA

 8401 AGGCGCACTT ACTACACCAT ACATGACTAT CAAAGGTTCA GTCATCGCCA

 8451 ACTGCAAGAT GACAACATGT AGATGTGTAA ACCCCCCGGG TATCATATCG

 8501 CAAAACTATG GAGAAGCCGT GTCTCTAATA GATAAACAAT CATGCAATGT

 8551 TTTATCCTTA GGCGGGATAA CTTTAAGGCT CAGTGGGGAA TTCGATGTAA

 8601 CTTATCAGAA GAATATCTCA ATACAAGATT CTCAAGTAAT AATAACAGGC

 8651 AATCTTGATA TCTCAACTGA GCTTGGGAAT GTCAACAACT CGATCAGTAA

 8701 TGCTTTGAAT AAGTTAGAGG AAAGCAACAG AAAACTAGAC AAAGTCAATG

 8751 TCAAACTGAC TAGCACATCT GCTCTCATTA CCTATATCGT TTTGACTATC

 8801 ATATCTCTTG TTTTTGGTAT ACTTAGCCTG ATTCTAGCAT GCTACCTAAT

 8851 GTACAAGCAA AAGGCGCAAC AAAAGACCTT ATTATGGCTT GGGAATAATA

 8901 CTCTAGACCA GATGAGAGCC ACTACAAAAA TGTGAACACA GATGAGGAAC

 8951 GAAGGTTTCC CTAATAGTAA TTTGTGTGAA AGTTCTGGTA GTCTGTCAGT

 9001 TCAGAGAGTT AAGAAAAAAC TACCGGTTGT AGATGACCAA AGGACGATAT

 9051 ACGGGTAGAA CGGTAAGAGA GGCCGCCCCT CAATTGCGAG CCAGGCTTCA

 9101 CAACCTCCGT TCTACCGCTT CACCGACAAC AGTCCTCAAT CATGGACCGC

 9151 GCCGTTAGCC AAGTTGCGTT AGAGAATGAT GAAAGAGAGG CAAAAAATAC

 9201 ATGGCGCTTG ATATTCCGGA TTGCAATCTT ATTCTTAACA GTAGTGACCT

 9251 TGGCTATATC TGTAGCCTCC CTTTTATATA GCATGGGGGC TAGCACACCT

 9301 AGCGATCTTG TAGGCATACC GACTAGGATT TCCAGGGCAG AAGAAAAGAT

 9351 TACATCTACA CTTGGTTCCA ATCAAGATGT AGTAGATAGG ATATATAAGC

 9401 AAGTGGCCCT TGAGTCTCCG TTGGCATTGT TAAATACTGA GACCACAATT

 9451 ATGAACGCAA TAACATCTCT CTCTTATCAG ATTAATGGAG CTGCAAACAA

 9501 CAGTGGGTGG GGGGCACCTA TCCATGACCC AGATTATATA GGGGGGATAG

 9551 GCAAAGAACT CATTGTAGAT GATGCTAGTG ATGTCACATC ATTCTATCCC

 9601 TCTGCATTTC AAGAACATCT GAATTTTATC CCGGCGCCTA CTACAGGATC

 9651 AGGTTGCACT CGAATACCCT CATTTGACAT GAGTGCTACC CATTACTGCT

 9701 ACACCCATAA TGTAATATTG TCTGGATGCA GAGATCACTC ACATTCATAT

 9751 CAGTATTTAG CACTTGGTGT GCTCCGGACA TCTGCAACAG GGAGGGTATT

 9801 CTTTTCTACT CTGCGTTCCA TCAACCTGGA CGACACCCAA AATCGGAAGT

 9851 CTTGCAGTGT GAGTGCAACT CCCCTGGGTT GTGATATGCT GTGCTCGAAA

 9901 GTCACGGAGA CAGAGGAAGA AGATTATAAC TCAGCTGTCC CTACGCGGAT

 9951 GGTACATGGG AGGTTAGGGT TCGACGGCCA GTACCACGAA AAGGACCTAG

10001 ATGTCACAAC ATTATTCGGG GACTGGGTGG CCAACTACCC AGGAGTAGGG

10051 GGTGGATCTT TTATTGACAG CCGCGTATGG TTCTCAGTCT ACGGAGGGTT

10101 AAAACCCAAT TCACCCAGTG ACACTGTACA GGAAGGGAAA TATGTGATAT

10151 ACAAGCGATA CAATGACACA TGCCCAGATG AGCAAGACTA CCAGATTCGA

10201 ATGGCCAAGT CTTCGTATAA GCCTGGACGG TTTGGTGGGA AACGCATACA

10251 GCAGGCTATC TTATCTATCA AGGTGTCAAC ATCCTTAGGC GAAGACCCGG

10301 TACTGACTGT ACCGCCCAAC ACAGTCACAC TCATGGGGGC CGAAGGCAGA

10351 ATTCTCACAG TAGGGACATC TCATTTCTTG TATCAACGAG GGTCATCATA

10401 CTTCTCTCCC GCGTTATTAT ATCCTATGAC AGTCAGCAAC AAAACAGCCA

10451 CTCTTCATAG TCCTTATACA TTCAATGCCT TCACTCGGCC AGGTAGTATC

10501 CCTTGCCAGG CTTCAGCAAG ATGCCCCAAC TCGTGTGTTA CTGGAGTCTA

10551 TACAGATCCA TATCCCCTAA TCTTCTATAG AAACCACACC TTGCGAGGGG

10601 TATTCGGGAC AATGCTTGAT GGTGTACAAG CAAGACTTAA CCCTGCGTCT

10651 GCAGTATTCG ATAGCACATC CCGCAGTCGC ATTACTCGAG TGAGTTCAAG

10701 CAGTACCAAA GCAGCATACA CAACATCAAC TTGTTTTAAA GTGGTCAAGA

10751 CTAATAAGAC CTATTGTCTC AGCATTGCTG AAATATCTAA TACTCTCTTC

10801 GGAGAATTCA GAATCGTCCC GTTACTAGTT GAGATCCTCA AAGATGACGG

10851 GGTTAGAGAA GCCAGGTCTG GCTAGTTGAG TCAATTATAA AGGAGTTGGA

10901 AAGATGGCAT TGTATCACCT ATCTTCTGCG ACATCAAGAA TCAAACCGAA

10951 TGCCGGCGCG TGCTCGAATT CCATGTTGCC AGTTGACCAC AATCAGCCAG

11001 TGCTCATGCG ATCAGATTAA GCCTTGTCAA TAGTCTCGTT AACTTAAGAA

11051 AAAATACGGG TAGAACCGCC ACCATGGAGA CAGACACACT CCTGCTATGG

11101 GTACTGCTGC TCTGGGTTCC AGGATCCACT GGTACCTCTG AGGAAACCAT

11151 TTCTACAGTT CAAGAAAAGC AACAAAATAT TTCTCCCCTA GTGAGAGAAA

11201 GAGGTCCTCA GAGAGTAGCA GCTCACATAA CTGGGACCAG AGGAAGAAGC

11251 AACACATTGT CTTCTCCAAA CTCCAAGAAT GAAAAGGCTC TGGGCCGCAA

11301 AATAAACTCC TGGGAATCAT CAAGGAGTGG GCATTCATTC CTGAGCAACT

11351 TGCACTTGAG GAATGGTGAA CTGGTCATCC ATGAAAAAGG GTTTTACTAC

11401 ATCTATTCCC AAACATACTT TCGATTTCAG GAGGAAATAA AAGAAAACAC

11451 AAAGAACGAC AAACAAATGG TCCAATATAT TTACAAATAC ACAAGTTATC

11501 CTGACCCTAT ATTGTTGATG AAAAGTGCTA GAAATAGTTG TTGGTCTAAA

11551 GATGCAGAAT ATGGACTCTA TTCCATCTAT CAAGGGGGAA TATTTGAGCT

11601 TAAGGAAAAT GACAGAATTT TTGTTTCTGT AACAAATGAG CACTTGATAG

11651 ACATGGACCA TGAAGCCAGT TTTTTCGGGG CCTTTTTAGT TGGCTAAGTT

11701 AACGTTTAAA CAAGCTTGGC GCGCCCGACG CGTTTGATTA AGAAAAAATG

11751 TAAGTGGCAA TGAGATACAA GGCAAAACAG CTCATGGTAA ATAATACGGG

11801 TAGGACATGG CGAGCTCCGG TCCTGAAAGG GCAGAGCATC AGATTATCCT

11851 ACCAGAGTCA CACCTGTCTT CACCATTGGT CAAGCACAAA CTACTCTATT

11901 ACTGGAAATT AACTGGGCTA CCGCTTCCTG ATGAATGTGA CTTCGACCAC

11951 CTCATTCTCA GCCGACAATG GAAAAAAATA CTTGAATCGG CCTCTCCTGA

12001 TACTGAGAGA ATGATAAAAC TCGGAAGGGC AGTACACCAA ACTCTTAACC

12051 ACAATTCCAG AATAACCGGA GTGCTCCACC CCAGGTGTTT AGAAGAACTG

12101 GCTAATATTG AGGTCCCAGA TTCAACCAAC AAATTTCGGA AGATTGAGAA

12151 GAAGATCCAA ATTCACAACA CGAGATATGG AGAACTGTTC ACAAGGCTGT

12201 GTACGCATAT AGAGAAGAAA CTGCTGGGGT CATCTTGGTC TAACAATGTC

12251 CCCCGGTCAG AGGAGTTCAG CAGCATTCGT ACGGATCCGG CATTCTGGTT

12301 TCACTCAAAA TGGTCCACAG CCAAGTTTGC ATGGCTCCAT ATAAAACAGA

12351 TCCAGAGGCA TCTGATGGTG GCAGCTAGGA CAAGGTCTGC GGCCAACAAA

12401 TTGGTGATGC TAACCCATAA GGTAGGCCAA GTCTTTGTCA CTCCTGAACT

12451 TGTCGTTGTG ACGCATACGA ATGAGAACAA GTTCACATGT CTTACCCAGG

12501 AACTTGTATT GATGTATGCA GATATGATGG AGGGCAGAGA TATGGTCAAC

12551 ATAATATCAA CCACGGCGGT GCATCTCAGA AGCTTATCAG AGAAAATTGA

12601 TGACATTTTG CGGTTAATAG ACGCTCTGGC AAAAGACTTG GGTAATCAAG

12651 TCTACGATGT TGTATCACTA ATGGAGGGAT TTGCATACGG AGCTGTCCAG

12701 CTACTCGAGC CGTCAGGTAC ATTTGCAGGA GATTTCTTCG CATTCAACCT

12751 GCAGGAGCTT AAAGACATTC TAATTGGCCT CCTCCCCAAT GATATAGCAG

12801 AATCCGTGAC TCATGCAATC GCTACTGTAT TCTCTGGTTT AGAACAGAAT

12851 CAAGCAGCTG AGATGTTGTG TCTGTTGCGT CTGTGGGGTC ACCCACTGCT

12901 TGAGTCCCGT ATTGCAGCAA AGGCAGTCAG GAGCCAAATG TGCGCACCGA

12951 AAATGGTAGA CTTTGATATG ATCCTTCAGG TACTGTCTTT CTTCAAGGGA

13001 ACAATCATCA ACGGGTACAG AAAGAAGAAT GCAGGTGTGT GGCCGCGAGT

13051 CAAAGTGGAT ACAATATATG GGAAGGTCAT TGGGCAACTA CATGCAGATT

13101 CAGCAGAGAT TTCACACGAT ATCATGTTGA GAGAGTATAA GAGTTTATCT

13151 GCACTTGAAT TTGAGCCATG TATAGAATAT GACCCTGTCA CCAACCTGAG

13201 CATGTTCCTA AAAGACAAGG CAATCGCACA CCCCAACGAT AATTGGCTTG

13251 CCTCGTTTAG GCGGAACCTT CTCTCCGAAG ACCAGAAGAA ACATGTAAAA

13301 GAAGCAACTT CGACTAATCG CCTCTTGATA GAGTTTTTAG AGTCAAATGA

13351 TTTTGATCCA TATAAAGAGA TGGAATATCT GACGACCCTT GAGTACCTTA

13401 GAGATGACAA TGTGGCAGTA TCATACTCGC TCAAGGAGAA GGAAGTGAAA

13451 GTTAATGGAC GGATCTTCGC TAAGCTGACA AAGAAGTTAA GGAACTGTCA

13501 GGTGATGGCG GAAGGGATCC TAGCCGATCA GATTGCACCT TTCTTTCAGG

13551 GAAATGGAGT CATTCAGGAT AGCATATCCT TGACCAAGAG TATGCTAGCG

13601 ATGAGTCAAC TGTCTTTTAA CAGCAATAAG AAACGTATCA CTGACTGTAA

13651 AGAAAGAGTA TCTTCAAACC GCAATCATGA TCCGAAAAGC AAGAACCGTC

13701 GGAGAGTTGC AACCTTCATA ACAACTGACC TGCAAAAGTA CTGTCTTAAT

13751 TGGAGATATC AGACAATCAA ATTGTTCGCT CATGCCATCA ATCAGTTGAT

13801 GGGCCTACCT CACTTCTTCG AATGGATTCA CCTAAGACTG ATGGACACTA

13851 CGATGTTCGT AGGAGACCCT TTCAATCCTC CAAGTGACCC TACTGACTGT

13901 GACCTCTCAA GAGTCCCTAA TGATGACATA TATATTGTCA GTGCCAGAGG

13951 GGGTATCGAA GGATTATGCC AGAAGCTATG GACAATGATC TCAATTGCTG

14001 CAATCCAACT TGCTGCAGCT AGATCGCATT GTCGTGTTGC CTGTATGGTA

14051 CAGGGTGATA ATCAAGTAAT AGCAGTAACG AGAGAGGTAA GATCAGACGA

14101 CTCTCCGGAG ATGGTGTTGA CACAGTTGCA TCAAGCCAGT GATAATTTCT

14151 TCAAGGAATT AATTCATGTC AATCATTTGA TTGGCCATAA TTTGAAGGAT

14201 CGTGAAACCA TCAGGTCAGA CACATTCTTC ATATACAGCA AACGAATCTT

14251 CAAAGATGGA GCAATCCTCA GTCAAGTCCT CAAAAATTCA TCTAAATTAG

14301 TGCTAGTGTC AGGTGATCTC AGTGAAAACA CCGTAATGTC CTGTGCCAAC

14351 ATTGCCTCTA CTGTAGCACG GCTATGCGAG AACGGGCTTC CCAAAGACTT

14401 CTGTTACTAT TTAAACTATA TAATGAGTTG TGTGCAGACA TACTTTGACT

14451 CTGAGTTCTC CATCACCAAC AATTCGCACC CCGATCTTAA TCAGTCGTGG

14501 ATTGAGGACA TCTCTTTTGT GCACTCATAT GTTCTGACTC CTGCCCAATT

14551 AGGGGGACTG AGTAACCTTC AATACTCAAG GCTCTACACT AGAAATATCG

14601 GTGACCCGGG GACTACTGCT TTTGCAGAGA TCAAGCGACT AGAAGCAGTG

14651 GGATTACTGA GTCCTAACAT TATGACTAAT ATCTTAACTA GGCCGCCTGG

14701 GAATGGAGAT TGGGCCAGTC TGTGCAACGA CCCATACTCT TTCAATTTTG

14751 AGACTGTTGC AAGCCCAAAT ATTGTTCTTA AGAAACATAC GCAAAGAGTC

14801 CTATTTGAAA CTTGTTCAAA TCCCTTATTG TCTGGAGTGC ACACAGAGGA

14851 TAATGAGGCA GAAGAGAAGG CATTGGCTGA ATTCTTGCTT AATCAAGAGG

14901 TGATTCATCC CCGCGTTGCG CATGCCATCA TGGAGGCAAG CTCTGTAGGT

14951 AGGAGAAAGC AAATTCAAGG GCTTGTTGAC ACAACAAACA CCGTAATTAA

15001 GATTGCGCTT ACTAGGAGGC CATTAGGCAT CAAGAGGCTG ATGCGGATAG

15051 TCAATTATTC TAGCATGCAT GCAATGCTGT TTAGAGACGA TGTTTTTTCC

15101 TCCAGTAGAT CCAACCACCC CTTAGTCTCT TCTAATATGT GTTCTCTGAC

15151 ACTGGCAGAC TATGCACGGA ATAGAAGCTG GTCACCTTTG ACGGGAGGCA

15201 GGAAAATACT GGGTGTATCT AATCCTGATA CGATAGAACT CGTAGAGGGT

15251 GAGATTCTTA GTGTAAGCGG AGGGTGTACA AGATGTGACA GCGGAGATGA

15301 ACAATTTACT TGGTTCCATC TTCCAAGCAA TATAGAATTG ACCGATGACA

15351 CCAGCAAGAA TCCTCCGATG AGGGTACCAT ATCTCGGGTC AAAGACACAG

15401 GAGAGGAGAG CTGCCTCACT TGCAAAAATA GCTCATATGT CGCCACATGT

15451 AAAGGCTGCC CTAAGGGCAT CATCCGTGTT GATCTGGGCT TATGGGGATA

15501 ATGAAGTAAA TTGGACTGCT GCTCTTACGA TTGCAAAATC TCGGTGTAAT

15551 GTAAACTTAG AGTATCTTCG GTTACTGTCC CCTTTACCCA CGGCTGGGAA

15601 TCTTCAACAT AGACTAGATG ATGGTATAAC TCAGATGACA TTCACCCCTG

15651 CATCTCTCTA CAGGGTGTCA CCTTACATTC ACATATCCAA TGATTCTCAA

15701 AGGCTGTTCA CTGAAGAAGG AGTCAAAGAG GGGAATGTGG TTTACCAACA

15751 GATCATGCTC TTGGGTTTAT CTCTAATCGA ATCGATCTTT CCAATAACAA

15801 CAACCAGGAC ATATGATGAG ATCACACTGC ACCTACATAG TAAATTTAGT

15851 TGCTGTATCA GAGAAGCACC TGTTGCGGTT CCTTTCGAGC TACTTGGGGT

15901 GGTACCGGAA CTGAGGACAG TGACCTCAAA TAAGTTTATG TATGATCCTA

15951 GCCCTGTATC GGAGGGAGAC TTTGCGAGAC TTGACTTAGC TACTTTCAAG

16001 AGTTATGAGC TTAATCTGGA GTCATATCCC ACGATAGAGC TAATGAACAT

16051 TCTTTCAATA TCCAGCGGGA AGTTGATTGG CCAGTCTGTG GTTTCTTATG

16101 ATGAAGATAC CTCCATAAAG AATGACGCCA TAATAGTGTA TGACAATACC

16151 CGAAATTGGA TCAGTGAAGC TCAGAATTCA GATGTGGTCC GCCTATTTGA

16201 ATATGCAGCA CTTGAAGTGC TCCTCGACTG TTCTTACCAA CTCTATTACC

16251 TGAGAGTAAG AGGCCTAGAC AATATTGTCT TATATATGGG TGATTTATAC

16301 AAGAATATGC CAGGAATTCT ACTTTCCAAC ATTGCAGCTA CAATATCTCA

16351 TCCCGTCATT CATTCAAGGT TACATGCAGT GGGCCTGGTC AACCATGACG

16401 GATCACACCA ACTTGCAGAT ACGGATTTTA TCGAAATGTC TGCAAAACTA

16451 TTAGTATCTT GCACCCGACG TGTGATCTCC GGCTTATATT CAGGAAATAA

16501 GTATGATCTG CTGTTCCCAT CTGTCTTAGA TGATAACCTG AATGAGAAGA

16551 TGCTTCAGCT GATATCCCGG TTATGCTGTC TGTACACGGT ACTCTTTGCT

16601 ACAACAAGAG AAATCCCGAA AATAAGAGGC TTAACTGCAG AAGAGAAATG

16651 TTCAATACTC ACTGAGTATT TACTGTCGGA TGCTGTGAAA CCATTACTTA

16701 GTCCCGATCA AGTGAGCTCT ATCATGTCTC CTAACATAAT TACATTCCCA

16751 GCTAATCTGT ACTACATGTC TCGGAAGAGC CTCAATTTGA TCAGGGAAAG

16801 GGAGGACAGG GATACTATCC TGGCGTTGTT GTTCCCCCAA GAGCCATTAT

16851 TAGAGTTCCC TTCTGTGCAA GATATTGGTG CTCGAGTGAA AGATCCATTC

16901 ACCCGACAAC CTGCGGCATT TTTGCAAGAG TTAGATTTGA GTGCTCCAGC

16951 AAGGTATGAC GCATTCACAC TTAGTCAGAT TCATCCTGAA CTCACATCTC

17001 CAAATCCGGA GGAAGACTAC TTAGTACGAT ACTTGTTCAG AGGGATAGGG

17051 ACTGCATCTT CCTCTTGGTA TAAGGCATCT CATCTCCTTT CTGTACCCGA

17101 GGTAAGATGT GCAAGACACG GGAACTCCTT ATACTTAGCT GAAGGGAGCG

17151 GAGCCATCAT GAGTCTTCTC GAACTGCATG TACCACATGA AACTATCTAT

17201 TACAATACGC TCTTTTCAAA TGAGATGAAC CCCCCGCAAC GACATTTCGG

17251 GCCGACCCCA ACTCAGTTTT TGAATTCGGT TGTTTATAGG AATCTACAGG

17301 CGGAGGTAAC ATGCAAAGAT GGATTTGTCC AAGAGTTCCG TCCATTATGG

17351 AGAGAAAATA CAGAGGAAAG TGACCTGACC TCAGATAAAG TAGTGGGGTA

17401 TATTACATCT GCAGTGCCCT ACAGATCTGT ATCATTGCTG CATTGTGACA

17451 TTGAAATTCC TCCAGGGTCC AATCAAAGCT TACTAGATCA ACTAGCTATC

17501 AATTTATCTC TGATTGCCAT GCATTCTGTA AGGGAGGGCG GGGTAGTAAT

17551 CATCAAAGTG TTGTATGCAA TGGGATACTA CTTTCATCTA CTCATGAACT

17601 TGTTTGCTCC GTGTTCCACA AAAGGATATA TTCTCTCTAA TGGTTATGCA

17651 TGTCGAGGAG ATATGGAGTG TTACCTGGTA TTTGTCATGG GTTACCTGGG

17701 CGGGCCTACA TTTGTACATG AGGTGGTGAG GATGGCGAAA ACTCTGGTGC

17751 AGCGGCACGG TACGCTTTTG TCTAAATCAG ATGAGATCAC ACTGACCAGG

17801 TTATTCACCT CACAGCGGCA GCGTGTGACA GACATCCTAT CCAGTCCTTT

17851 ACCAAGATTA ATAAAGTACT TGAGGAAGAA TATTGACACT GCGCTGATTG

17901 AAGCCGGGGG ACAGCCCGTC CGTCCATTCT GTGCGGAGAG TCTGGTGAGC

17951 ACGCTAGCGA ACATAACTCA GATAACCCAG ATCATCGCTA GTCACATTGA

18001 CACAGTTATC CGGTCTGTGA TATATATGGA AGCTGAGGGT GATCTCGCTG

18051 ACACAGTATT TCTATTTACC CCTTACAATC TCTCTACTGA CGGGAAAAAG

18101 AGGACATCAC TTAAACAGTG CACGAGACAG ATCCTAGAGG TTACAATACT

18151 AGGTCTTAGA GTCGAAAATC TCAATAAAAT AGGCGATATA ATCAGCCTAG

18201 TGCTTAAAGG CATGATCTCC ATGGAGGACC TTATCCCACT AAGGACATAC

18251 TTGAAGCATA GTACCTGCCC TAAATATTTG AAGGCTGTCC TAGGTATTAC

18301 CAAACTCAAA GAAATGTTTA CAGACACTTC TGTACTGTAC TTGACTCGTG

18351 CTCAACAAAA ATTCTACATG AAAACTATAG GCAATGCAGT CAAAGGATAT

18401 TACAGTAACT GTGACTCTTA ACGAAAATCA CATATTAATA GGCTCCTTTT

18451 TTGGCCAATT GTATTCTTGT TGATTTAATC ATATTATGTT AGAAAAAAGT

18501 TGAACCCTGA CTCCTTAGGA CTCGAATTCG AACTCAAATA AATGTCTTAA

18551 AAAAAGGTTG CGCACAATTA TTCTTGAGTG TAGTCTCGTC ATTCACCAAA

18601 TCTTTGTTTG GTTTGGTGGC CGGCATGGTC CCAGCCTCCT CGCTGGCGCC

18651 GGCTGGGCAA CATTCCGAGG GGACCGTCCC CTCGGTAATG GCGAATGGGA

18701 CGCGGCCGAT CCGGCTGCTA ACAAAGCCCG AAAGGAAGCT GAGTTGGCTG

18751 CTGCCACCGC TGAGCAATAA CTAGCATAAC CCCTTGGGGC CTCTAAACGG

18801 GTCTTGAGGG GTTTTTTGCT GAAAGGAGGA ACTATATCCG GATCGGCCGA

18851 TCCGGCTGCT AACAAAGCCC GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT GCTGCCACCG

18901 CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG CCTCTAAACG GGTCTTGAGG

18951 GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATGGCCGC CACCGGTGGG

19001 CCTTGCAGCA CATCCCCCCT TCGCCAG

 

 

 

序列1说明：

11038-11043 HpaⅠ酶切位点      11044-11054 GE序列             11055 IG序列

11056-11067 GS序列             11068-11073 Kozak序列          11074-11697 TRAIL开放阅读框

11698-11703 HpaⅠ酶切位点      11704-11711 PmeⅠ酶切位点       11712-11717 HindⅢ酶切位点

11718-11725 AscⅠ酶切位点       11728-11733 MluⅠ酶切位点  

 

 

序列2

    1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG

   51 ATCCACTGGT ACCTCTGAGG AAACCATTTC TACAGTTCAA GAAAAGCAAC

  101 AAAATATTTC TCCCCTAGTG AGAGAAAGAG GTCCTCAGAG AGTAGCAGCT

  151 CACATAACTG GGACCAGAGG AAGAAGCAAC ACATTGTCTT CTCCAAACTC

  201 CAAGAATGAA AAGGCTCTGG GCCGCAAAAT AAACTCCTGG GAATCATCAA

  251 GGAGTGGGCA TTCATTCCTG AGCAACTTGC ACTTGAGGAA TGGTGAACTG

  301 GTCATCCATG AAAAAGGGTT TTACTACATC TATTCCCAAA CATACTTTCG

  351 ATTTCAGGAG GAAATAAAAG AAAACACAAA GAACGACAAA CAAATGGTCC

  401 AATATATTTA CAAATACACA AGTTATCCTG ACCCTATATT GTTGATGAAA

  451 AGTGCTAGAA ATAGTTGTTG GTCTAAAGAT GCAGAATATG GACTCTATTC

  501 CATCTATCAA GGGGGAATAT TTGAGCTTAA GGAAAATGAC AGAATTTTTG

  551 TTTCTGTAAC AAATGAGCAC TTGATAGACA TGGACCATGA AGCCAGTTTT

  601 TTCGGGGCCT TTTTAGTTGG CTAA