水稻OsMADS29基因在调控植物种子发育中的应用

摘要

本发明公开了水稻OsMADS29基因在调控植物种子发育中的应用。水稻OsMADS29基因翻译的蛋白如序列表序列1所示，该蛋白的编码序列为序列表序列2中第1位至第780位所示的核苷酸序列。所述蛋白可用于调控目的植物的下述至少一种性状：雌性育性、种子结实率、种子厚度、种子千粒重、胚乳淀粉含量。本发明可用于培育不育禾本科农作物或牧草，为畜牧业提供优质的青贮饲料；也可用于培育雌性不育材料，用于农作物的智能不育分子育种研究。此外，用于杨树、柳树等绿化植物中使花器官败育，可避免花絮满天飞的现象，增强园林绿化的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻OsMADS29基因在调控植物种子发育中的应用。

背景技术

根据高等真双子叶植物花发育的ABCDE模型，经典的B类花同源异型基因特异的 在花瓣和雄蕊中表达并参与这两轮器官的形成。2002年，A.Becker等人在建立B类 基因的系统进化树时首先在裸子植物麻黄纲买麻藤(Gnetum gnemon)中找到了一类不 同于经典B类基因的一个基因分支，这类基因主要是在雌性生殖器官中表达。鉴于其 与经典的B类基因结构相似，但在表达方式和功能上却完全不同的原因，将这一类基 因命名为B_sister基因。B_sister基因可能在种子植物繁殖器官的结构进化上起了非常重要的 作用。

目前已有的B_sister基因研究结果都集中在高等真双子叶植物中，对于单子叶植物水 稻来说，B_sister是否也在雌性生殖器官中特异表达并发挥作用尚不清楚。水稻中一共存 在着3个B_sister基因，分别为OsMADS29，OsMADS30和OsMADS31，但是对于它们的功能 研究至今未见报道。由于水稻是农业科学研究的模式植物，也是重要的粮食和经济作 物之一，它的雌性生殖器官的发育直接影响粮食产量和国计民生，因此，对水稻种子 发育的研究具有重要的理论意义和经济价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种OsMADS29蛋白的新用途。所述OsMADS29蛋白为序 列表序列1所示蛋白，来源于水稻，其编码序列为序列表序列2中第1位至第780位 所示的核苷酸序列。

本发明所提供的新用途为序列表序列1所示蛋白可用于调控目的植物的下述至少 一种性状，或调节序列表序列1所示蛋白质表达量的物质用于调控目的植物的下述至 少一种性状：雌性育性、种子结实率、种子厚度、种子千粒重、胚乳淀粉含量。

本发明的另一个目的是提供下述a)或b)的DNA分子：

a)其核苷酸序列为序列表序列2的第474位至第962位核苷酸段；

b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交的DNA分子；

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为： 50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶 液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、 0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂 洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在 65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃ 下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明还提供下述c)或d)的DNA分子：

c)式I所示的DNA片段，(I)SEQ_正向-X-SEQ_反向；

所述SEQ_正向是序列表序列2中包括第474位至第962位的核苷酸段；

所述SEQ_反向的序列与所述SEQ_正向的序列反向互补；

所述X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ _正向及所述SEQ_反向均不互补；

d)与c)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具 有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％ 或至少具有99％同一性且抑制序列表序列1所示蛋白表达的DNA分子。

在上述c)或d)的DNA分子中，所述SEQ_正向的核苷酸序列具体可为序列表序列2 中第474位至第962位核苷酸序列。

本发明保护含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌和重 组病毒。

可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA分子的重组表达载体。所述植物表达 载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、 pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非 翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所 述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti) 质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非 翻译区均具有类似功能。使用所述DNA分子构建重组植物表达载体时，在其转录起始 核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉 米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表 达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的 所述DNA分子构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列 的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或 结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载 体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 (GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生 素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮 霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷 抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露 糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

含有所述DNA分子的重组载体具体可为重组载体pU29i。

所述DNA分子可用于制备抑制或下调目的植物的序列表序列1所示蛋白表达的物 质。

本发明还提供一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中序列表序列1所示 蛋白的表达，得到与所述目的植物相比具有如下1)-5)中至少一种表型的转基因植 物：

1)雌性育性降低；

2)种子结实率降低；

3)种子厚度降低；

4)种子千粒重降低；

5)胚乳细胞中无淀粉粒或胚乳淀粉含量降低。

在上述方法中，所述抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的表达是通过将所述 c)或d)的DNA分子导入目的植物中实现的。

在上述方法中，所述式I所示的DNA片段为重组载体pU29i中的Spe I至Kpn I 之间的DNA片段。

在上述方法中，所述抑制目的植物中序列表序列1所示蛋白的编码基因的表达是 通过将重组载体pU29i导入目的植物中实现。

所述重组载体pU29i是将式II所示DNA片段沿着从Kpn I至Sac I的方向插在载 体pU1301的Kpn I和Sac I位点间，得到重组载体pU29i；

(II)式I-Y；

所述Y是终止式I所示DNA片段转录的核苷酸序列；

所述X的核苷酸序列是序列表序列3所示的核苷酸序列；

所述Y的核苷酸序列是序列表序列4所示的核苷酸序列。

在上述应用或方法中，所述目的植物可为单子叶植物，所述单子叶植物具体可为 水稻。

实验证明，利用序列表序列2中第474位至第962位核苷酸序列构建的RNAi重 组载体pU29i转化水稻，与对照转化pU1301空载体相比，所获得的T₀代转基因水稻 株系的OsMADS29基因表达量、种子结实率、种子厚度、种子千粒重和胚乳淀粉含量显 著降低；对OsMADS29基因的表达模式分析表明，OsMADS29基因相对特异的在受精后 的胚胎中高量表达，这说明该基因在子房发育或受精后的胚胎灌浆过程中起着重要作 用，其表达缺失导致的灌浆失败是RNAi转基因株系种子败育或干瘪的直接原因。

本发明可用于培育不育禾本科农作物或牧草，为畜牧业提供优质的青贮饲料；也 可用于培育雌性不育材料，用于农作物的智能不育分子育种研究。此外，用于杨树、 柳树等绿化植物中使花器官败育，可避免花絮满天飞的现象，增强园林绿化的效果。

附图说明

图1为OsMADS29基因cDNA序列的酶切鉴定。其中，泳道1-5为含有OsMADS29 基因cDNA序列的克隆载体经Xho I酶切所产生的片段，M为分子量标准，自上而下的 条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，P为含有OsMADS29基 因cDNA序列的克隆载体。

图2为OsMADS29基因的RNAi载体构建图。其中，A为pBJ29(-)的酶切鉴定电泳 图，其中的泳道1，2，3为质粒pBJ29(-)克隆1，2，3的Sal I单酶切产物；泳道5，6，7 为质粒pBJ29(-)克隆5，6，7的Pst I单酶切产物；泳道4为分子量标准D2000 Plus， 自上而下的条带依次为5kb、3kb、2kb、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；B 为pBJ29(+/-)的酶切鉴定电泳图，其中的泳道1为pBJ29(+/-)的Pst I单酶切产物， 泳道2为pBJ29(+/-)的Sal I单酶切产物，泳道3为质粒pBJ29(+/-)，泳道4为分 子量标准D2000 Plus，自上而下的条带依次为5kb、3kb、2kb、1000bp、750bp、500bp、 250bp和100bp；C为pU29i的酶切鉴定电泳图，其中的泳道1为pU29i经BamH I和 Sac I双酶切得到的片段，泳道2为pU29i经EcoRI单酶切得到的片段，泳道3为pU29i 经Pst I单酶切得到的片段，泳道4为pU29i经Sal I单酶切得到的片段，泳道5的 Marker为分子量标准，自上而下的条带依次为5kb，3kb，2kb， 1000bp，750bp，500bp，250bp和100bp。

图3为RNAi转基因水稻株系所结种子的表型分类及组成。其中，A为种子的表型 分类，第一排为正常种子，第二排为弱表型种子，第三排为强表型种子；B为各株系 中不同表型种子的组成。

图4为RNAi转基因水稻株系所结种子的石蜡组织切片图。其中，A-C分别为受精 后第7天的正常种子、弱表型种子及强表型种子经珠心的切面图，标尺代表200μm。

图5为RNAi转基因水稻株系中OsMADS29基因的相对表达水平。

图6为RNAi转基因水稻株系中OsMADS29、OsMADS30和OsMADS31基因的表达。

图7为OsMADS29基因在水稻不同组织中的RT-PCR表达分析。其中，图中各泳道 分别代表的水稻组织如下：R：萌发7天的根；SD：萌发7天的幼苗；ML：成熟叶片； P1：1-5cm花序；P2：10cm花序；P3：17cm花序；P4：22cm花序；S1：受精后第1 天的种子；S2：受精后第3天的种子；S3：受精后第5天的种子；S4：受精后第7 天的种子；S5：受精后第9天的种子；S6：受精后第14天的种子。

图8为OsMADS29基因在水稻各轮花器官中的表达分析。其中，图中各泳道分 别代表的水稻组织如下：le：外稃；pa：内稃；lo：浆片；st：雄蕊；pi：雌蕊。

图9为OsMADS29基因在水稻不同组织中的实时定量PCR分析。其中，R：萌发7 天的根；SD：萌发7天的幼苗；ML：成熟叶片；P1：1-5cm花序；P3：17cm花序；P4： 22cm花序；S4：受精后第7天的种子。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、水稻OsMADS29基因的RNAi重组表达载体构建

1.水稻OsMADS29基因的克隆

水稻OsMADS29的基因全长为4010bp，翻译成为由260个氨基酸组成的功能蛋白(命 名为OsMADS29蛋白)，其氨基酸序列如序列表序列1所示。OsMADS29蛋白的编码序列如 序列表序列2中第1位至第780位核苷酸序列所示。OsMADS29基因的cDNA克隆是从日本 cDNA文库(网址：http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中购买的，该克隆名称 (Clone name)为002-115-F04。序列分析发现含有该克隆的载体pCMVFL3(Suzuki et  al.，1997)的插入片断两端包含有Xho I酶切位点，插入片断长度为1325bp，在481bp 处有Xho I的单酶切位点，所以用Xho I酶切应该产生三个片断，大小分别为4kb(不含 该克隆的载体)、864bp和503bp。将含有该克隆的载体转化大肠杆菌，提取质粒后用 Xho I酶切鉴定，结果显示片断大小是正确的(图1)。进一步的测序分析也证明序列 是完全正确的。

2.RNAi重组表达载体的构建

RNAi重组表达载体的构建过程如图2所示，具体步骤如下：

1)pBj(B/N)的构建：将pJawohI3-RNAi载体(Genbank号：AF404854)用BamH I 和Not I双酶切，回收596bp的片段，该片段包含pJawohI3-RNAi载体上的内含子 (intron)(其核苷酸序列如序列表序列3所示)和终止子(pA35S)(其核苷酸序列如 序列表序列4所示)序列，将含有BamHI和Not I粘性末端的该片段与经过BamHI和 Not I双酶切的pBluescript II SK(+)载体(Biovector008，Invitrogen)的大片段 相连，构成一个重组的中间载体，命名为pBj(B/N)。

2)pBJ29(+/-)的构建：单独特异抑制OsMADS29的区段包含部分C区段和部分 3’UTR序列，大小为489bp，其序列为序列表序列2中第474位至第962位的核苷酸 序列。在该序列的5’端添加BamH I和Spe I的识别序列，3’端添加Hpa I和Nco I 的识别序列，将得到含有该489bp的DNA片段命名为OsMADS29 RNAi特异片段(即图 2中的29RNAi fragment)。用Spe I和Hpa I分别对pBj(B/N)载体和OsMADS29 RNAi 特异片段进行双酶切，将获得的含有Spe I和Hpa I粘性末端的pBj(B/N)载体大片段 和OsMADS29 RNAi特异片段连接，获得OsMADS29 RNAi特异片段的反向插入中间载体， 命名为pBJ29(-)。pBJ29(-)鉴定正确插入后，用BamH I和Nco I同时对pBJ29(-)载 体和OsMADS29 RNAi特异片段进行双酶切，将获得的含有BamH I和Nco I粘性末端的 pBJ29(-)载体大片段和OsMADS29 RNAi特异片段连接，完成OsMADS29 RNAi特异片段 的正向插入，获得含有的中间载体命名为pBJ29(+/-)。

上述pBJ29(-)的酶切鉴定：分别挑取pBJ29(-)3个单克隆，进行质粒提取酶切 检测。用Sal I对pBJ29(-)进行酶切检测，可得到691bp和3317bp的条带。用Pst I 对pBJ29(-)进行酶切检测，可得到550bp和3323bp的条带。结果显示正确(如图2 中的A所示)。

上述pBJ29(+/-)的酶切鉴定：用Pst I对pBJ29(+/-)进行酶切，可得到184bp、 713bp和3380bp的条带；用Sal I对pBJ29(+/-)进行酶切检测，可得到244bp，929bp 和3317bp的条带。结果显示正确(如图2中的B所示)。

3)转化载体pU29i的构建：用Kpn I和Sac I分别双酶切pBJ29(+/-)载体和pU1301， 分别获得含有Kpn I和Sac I粘性末端的1631bp目的片段和载体pU1301的大片段，将 二者连接后，获得RNAi重组载体pU29i，用于转化水稻。将pU29i上的T-DNA片段命 名为T-DNA-RNAi。

上述RNAi重组载体pU29i的酶切鉴定：用BamH I和Sac I对RNAi重组载体pU29i 进行双酶切，可得到1561bp的片段和13419bp载体大片段；用EcoR I单酶切pU29i， 可得到763bp，1421bp的片段和12796bp载体大片段；用Pst I单酶切pU29i，可得到 713bp，1986bp的片段和11956bp载体大片段；用Sal I单酶切pU29i，可得到929bp 和1397bp的片段及12443bp的载体大片段；结果显示正确(如图2中的C所示)。

上述pU1301载体的构建过程如下：

将载体pUbiGUSPlus(Genbank号：AY452736)用Hind III和BamH I双酶切，将得到 的2016bp的DNA片段(其序列如序列表序列5中的第2位至第2017位核苷酸序列所示)经 测序验证正确后，与经Hind III和BamH I双酶切后的pCAMBIA1301(Genbank号： AF234297，国际农业分子生物学应用中心，网址：www.cambia.org)大片段相连，获得 载体pU1301，将pU1301上的T-DNA片段命名为T-DNA-空。

实施例2、RNAi重组载体转化水稻

1、重组农杆菌的获得

将实施例1中步骤2获得的RNAi重组载体pU29i及载体pU1301用电击法分别导 入根癌农秆菌EHA105(Biovector-375，普如汀生物技术(北京)有限公司)，获得含 有RNAi重组载体pU29i的重组农杆菌，命名为EHA105/pU29i，及含有载体pU1301的 重组农杆菌，命名为EHA105/pU1301。

2、转基因水稻的获得

按照文献“Hiei，Y.，S.Ohta，et al.Efficient transformation of rice(Oryza  sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries  of the T-DNA.The Plant Journal.1994，6(2)：271-282”和“Huang，J.Q.，Z.M. Wei，et al.High Efficiency of Genetic Transformation of Rice Using  Agrobacterium Mediated Procedure.″Acta Botanica Sinica.2000，42(11)： 1172-1178”中的农杆菌介导的水稻遗传转化体系，用重组农杆菌EHA105/pU29i和 EHA105/pU1301分别侵染水稻中花11(倪丕冲.水稻花培新品种——中花11号.作物品 种资源，1989年04期)成熟胚诱导的愈伤组织，浸染后的愈伤组织经共培养、筛选具 有潮霉素抗性的愈伤，分化、生根、炼苗移栽，得到再生转基因水稻苗。对得到的再 生转基因水稻苗经一周左右的炼苗处理后，在向室外移栽前全部按不同株系分成单株， 编号并取各单株的叶片和根，按照文献“Jefferson R.A.，T A Kavanagh et al.GUS  fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker  in higher plants.The EMBO jounal.1987，6(13)：3901-3907”中的方法进行GUS染色 鉴定。经GUS染色鉴定为阳性的转基因水稻单株苗移栽到温室的土壤中生长。

结果：T₀代共获得18个含T-DNA-RNAi插入片段的水稻转基因株系，命名为中花 11号/RNAi株系；T₀代共获得3个含T-DNA-空插入片段的水稻转基因株系，命名为中 花11号/CK。

实施例3、OsMADS29基因功能分析

一、RNAi转基因水稻株系表型观测及其OsMADS29基因的表达量分析

观察实施例2获得的18个中花11号/RNAi的T₀代转基因株系，与3个中花11号 /CK的T₀代转基因株系(对照)相比，花器官形态和数目无变化，但是结实率却有显 著下降。分别选取具代表性的3个中花11号/RNAi株系L5、L8和L9及1个中花11 号/CK株系共4个株系进行如下观测和分析：

1、结实率统计

分别从上述4个株系内随机取3个单株，统计各单株上所结的饱满种子数、干瘪 种子数及停育种子数，计算各单株的种子结实率，结果如表1所示。

种子结实率＝(饱满种子数/(饱满种子数+干瘪种子数+停育种子数))×100％。

表1.RNAi转基因株系结实率统计

2、种子及株系的表型分类

1)种子表型分类：上述3个中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上所结的种子分 如下三种表型(如图3中的A所示)：正常种子：即饱满的种子；强表型种子：即停育 或败育的种子，在受精后的发育早期(即受精后第6天)就已停育；弱表型种子：即 干瘪的种子，可发育成型但最终是干瘪的，且表面有凹沟式缺口。

2)株系表型分类：将上述3个中花11号/RNAi的T₀代转基因株系按其所结种子 表型及其组成(如图3中的B所示)分如下三种表型：强表型株系，如表1中的株系 L5，所结种子都不正常，其中有些为强表型种子，有些为弱表型种子；中等表型株系， 如表1中的株系L8，所结种子中正常种子、强表型种子和弱表型种子各占一定的比例； 弱表型株系，如表1中的株系L9，结实率与对照相近，只是相对于对照而言种子败育 率稍大些。

步骤1-2的结果表明：与对照相比，OsMADS29基因的功能缺失影响了水稻的正常 灌浆，导致受精后的子房内淀粉得不到充分积累，从而导致种子干瘪甚至雌性不育， 种子结实率下降。

3、弱表型种子的测量

由于强表型种子在发育早期就已经停育，所以分别选取株系L5和L8中成熟的干 瘪种子(即弱表型种子)，以中花11号/CK株系中的饱满种子(即正常种子)为对照， 各株系中随机取10粒种子测量长度、宽度、厚度，随机取100粒测千粒重(重复3 次)，得到的平均值结果见表2。

表2的结果显示，与对照的饱满种子相比，株系L5和L8上所结的干瘪种子由于 淀粉积累失败，种子的厚度和千粒重明显降低，存在极显著差异。

表2.种子相关农艺性状的测量

注：**表示P＜0.01。

4、种子内部结构观察

为了观察RNAi转基因水稻种子内部的组织结构是否正常，按照文献“Yang J.P. Improvement of traditional par affin section prepar ation methods.Journal Of  Biology.2006，23(1)：45-46”中的石蜡组织切片方法，观察中花11号/CK的T₀代转基 因株系上的饱满种子(即正常种子)和中花11号/RNAi的T₀代转基因株系上的干瘪种子 (弱表型种子)和败育种子(强表型种子)的发育早期种子，即对受精后第7天的种子 的经珠心的切面进行切片观察，结果如图4所示。

结果显示，与正常种子胚乳细胞中充满的淀粉粒(图4，A)相比，弱表型种子和 强表型种子胚乳细胞中都没有淀粉粒的积累(图4，B和C)，这说明OsMADS29基因的 表达下调导致胚乳细胞淀粉不能正常积累。

5、Real-time PCR分析RNAi转基因水稻株系中OsMADS29基因的表达

方法：分别取上述4个株系内单株上的长度为18-22cm的成熟花序，用(Invitrogen^TM)法分别提取总RNA，经DNaseI(RNase free)(Takara)消化总RNA中的基 因组DNA后，用反转录试剂盒Superscript III(Invitrogen，Carlsbad，USA)将获 得的总RNA分别进行反转录得到cDNA。以该cDNA为模板，以qOsMADS29-F：5’-GATGA  CTCGG ATGAG GAACG-3’和qOsMADS29-R：5’-ACGAA GGTTG TCCAG CTGCT-3’为引物 进行real-time PCR扩增，同时以ACTIN1基因为内参基因，ACTIN1基因的PCR引物 为qACTIN1-F：5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’和qACTIN1-R： 5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。PCR结果用双Delt方法遵照说明书进行分析。

Real time PCR的反应体系(20μL)：ddH₂O 8μL，2×SYBGreen Buffer 10μL，Primer Forword(10μM)0.5μL，Primer Reverse(10μM)0.5μL，cDNA模板 1μL。

PCR反应条件：94℃ 30s；94℃ 10s，58℃ 10s，72℃ 20s，40个循环。

结果：如图5所示，株系L5中OsMADS29基因表达量的下降程度最大，下降了73.6％， 株系L8和L9中OsMADS29基因被抑制的水平稍低一些，分别被抑制了64.7％和28.3％。

6、Real-time PCR分析OsMADS30和OsMADS31基因的表达

由于水稻中具有OsMADS29，OsMADS30和OsMADS31共三个B_sister基因，为了防止在 抑制OsMADS29表达时另外两个基因也受到影响，在进行步骤5的OsMADS29表达量检 测的同时，按照相同的方法，对3个中花11号/RNAi株系L5、L8和L9内各单株中的 OsMADS30和OsMADS31的表达量也进行了检测。结果表明，在OsMADS29基因下调的同 时，OsMADS30和OsMADS31都几乎未受到影响(图6)。这说明RNAi转基因株系表型的 产生是由于OsMADS29的表达下调特异性引起的。

用于检测OsMADS30表达量的PCR引物为：

OsMADS30-F：5’CAGTG GATGA GCTCA GCCAG 3’，

OsMADS30-R：5’TCCTA CTGCT TCCAG GAAGT 3’；

用于检测OsMADS31表达量的PCR引物为：

OsMADS31-F：5’GGTGA TGACT TGGCT TCACT GAC 3’，

OsMADS31-R：5’TGGTT GCTCA GTTGC ATCCA GAC 3’。

步骤5-6的结果表明，在3个中花11号/RNAi株系L5、L8和L9及1个中花11 号/CK株系中，OsMADS29基因表达水平与步骤1统计的结实率呈正相关，与步骤2的 种子表型及株系表型的严重程度是相关联的；这说明OsMADS29基因在RNAi转基因株 系中的表达已被成功抑制，且OsMADS29基因的表达抑制是导致上述步骤1-4的表型产 生的直接原因。

结论：特异性抑制水稻中OsMADS29的表达以后，导致结实率显著下降，种子干瘪 或在发育早期严重停育。经组织切片观察发现，转基因种子所结的受精后第7天的强 表型种子和弱表型种子的胚乳细胞中无淀粉粒。

二、OsMADS29基因的表达模式检测

为了查看OsMADS29基因是否在产生表型的部位表达，以确定该基因与表型产生的 直接相关性，分别用RT-PCR、实时定量PCR和原位杂交的方法检测OsMADS29基因在野生 型水稻中的表达情况，具体如下：

1、RT-PCR分析OsMADS29基因的表达模式

方法I：将水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)品种中花11号种植于室外 网棚，分别取萌发7天的根，萌发7天的幼苗、成熟叶片、长度为1-5cm花序、10-17cm 花序、17-22cm花序以及受精后第1，3，5，7，9，14天的种子为材料，按照步骤一 中5的方法分别提取总RNA、反转录获得cDNA、对cDNA进行PCR扩增，并对扩增产物 进行分析。

结果I：如图7所示，OsMADS29基因在10cm长的花序中(图7中P2)开始有微 弱表达，从受精后第1天的种子(图7中S1)表达量开始上升，受精后第5天的种子 (图7中S3)中表达量达到最高，随后表达量下降，表达时期直至种子的成熟阶段S6 (图7)。

方法II：分别取处于抽穗未开花的水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)品种 中花11号的内外稃片、浆片、雄蕊和雌蕊为材料，按照步骤一中5的方法分别提取总RNA 反转录获得cDNA、对cDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行电泳分析，其中的内参基因 为APT1该基因的扩增引物为：

APT1-F：5‘ATTCA TTTTT GGTCC GCCC 3’，

APT1-R：5‘CCCAA ATAAC TCATG TGCCT AC 3’。

结果II：如图8所示，OsMADS29基因在雌蕊中特异表达(图8)。

I和II的结果表明，从表达方式来看，OsMADS29基因满足典型B_sister基因的在发育 中的种子高量表达的特点。所以，OsMADS29基因是水稻中具有典型B_sister功能的基因。

2、Real-time PCR分析OsMADS29基因的表达模式

方法：以步骤1中方法I获得的各cDNA样品为模板，按照步骤一中5的方法进行 Real-time PCR。

结果：与步骤1的结果I相同，在受精以后的种子中表达量最高(图9)。