快速检测转玉米PEPC基因作物的ELISA试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种快速检测转玉米

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的ELISA试剂盒及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。 

背景技术

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是玉米等C₄植物能够进行高效的光合作用,尤其是在低CO₂浓度和强光照下进行光合作用的关键基因之一。利用玉米的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）转化水稻后可以获得在光合效率、光饱和点、低CO₂浓度补偿点等生理指标方面得到很大改善，而且在单株有效穗、穗总粒数、千粒重和单株产量等主要经济性状比原始亲本大幅度提高的转基因植株（KuMSB,etal,1999，2001；迟伟等，2001；JiaoDM，etal，2001，2002，2003，2007；ZhangF，2003；陈绪清等，2004；李季航等，2006；何立斌等，2006；李霞等，2003，2005，2007；袁定阳等，2007；BandyopadhyayA,etal,2007；张边江等，2008，2009；LauraM,etal，2008；李艳，2009）。已有研究表明，利用C₄型（如玉米、高粱等）的光合作用关键基因之一——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）来改良水稻、小麦等C₃植物具有潜在的重要的经济和社会意义。 

外源基因转入受体物种后，对目标基因的检测方法主要有三种：（1）生物测试法；（2）DNA检测；（3）蛋白的免疫检测。在这三种检测方法中，第一种方法比较繁琐且工作量大，劳动力成本较高，测定结果偏差大，难以进行横向和纵向比较；第二种方法只是检测目的基因是否存在，并不代表基因是否表达，实际指导意义不大。免疫检测方法方便、简单、实用、经济，灵敏性更高，而且可以直接鉴定基因产物的表达情况，双夹心酶联免疫法整个操作过程仅需要5个小时左右。 

随着越来越多的对PEPC基因（GenBank登录号E17154）的关注与深入研究，利用基因本身的生物学信息来提高选育转基因后代材料就显得越来越重要。然而，目前所有的有关PEPC基因的研究主要是集中在转基因后代的生理生化指标的检测和利用PEPC基因的核苷酸信息设计引物来分析目的基因的整合与表达，还未见快速检测该基因表达的方法报道。利用PEPC基因的表达蛋白作为抗原获取专一性的抗体制成ELISA试剂盒能够检测出转基因后代植株中PEPC基因是否得以表达，为育种家提供快速的检测结果。 

发明内容

技术问题 

本发明的目的是提供一种快速检测玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）表达蛋白的ELISA试剂盒。 

技术方案 

本发明的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）表达蛋白ELISA试剂盒包括： 

1）96孔酶标板：包被玉米PEPC蛋白多克隆抗体的酶标板（包被浓度1：1600-1：3200）；玉米PEPC蛋白多克隆抗体的制备过程：玉米PEPC蛋白免疫3月龄的新西兰大白兔，4次免疫后心脏采血，离心，取血清。 

2）玉米PEPC蛋白单克隆抗体：玉米PEPC蛋白免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠，获得保藏号是CCTCCNO：C2012199的杂交瘤细胞4E5；玉米PEPC蛋白免疫BALB/c小鼠获得杂交瘤细胞4E5单克隆抗体（工作效价1：400-1：800） 

3）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（工作效价1：5000-1：10000）； 

4）阴性对照品：未转玉米PEPC基因的水稻蛋白提取液。 

5）样品处理液：50mmol·L^-1Tris-HCL，pH7.5，1mmol·L^-1MgCl₂，5mmol·L^-1DTT，2%PVP，10%甘油； 

6）稀释液：磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01M，pH7.5）； 

7）洗涤液：磷酸盐吐温缓冲液（PBST）（1000mL0.01MPBS中加0.5mLTween-20）； 

8）底物溶液： 

底物缓冲液:Na₂HPO₄·12H₂O0.2g；NaH₂PO₄·2H₂O6.84g，双蒸水500mL；4℃保存备用； 

TMB母液：TMB40mg；DMSO5mL；避光4℃保存备用； 

双蒸水配制的体积比1%H₂O₂。 

上述玉米PEPC基因表达蛋白ELISA试剂盒的使用方法为： 

1）将0.1g的植物样品在加有预冷的1mL的样品处理液的研钵中研碎，室温下放置约5min，10000rpm离心5min，取上清液100μL加入酶标板的一个孔中，37℃孵育60min； 

2）洗涤液洗板3次，每次3-5min； 

3）加入100μL工作浓度的单克隆抗体，37℃孵育90min； 

4）洗涤液洗板3次，每次3-5min； 

5）加入100μL工作浓度的酶标二抗，37℃孵育90min； 

6）洗涤液洗板5次，每次3-5min； 

7）加入新配制的底物溶液:12mL底物缓冲液+120μLTMB母液+48μL双蒸水配制的体积比1%H₂O₂，避光作用10min； 

8）加入2mol/LH₂SO₄终止液50μL，将酶标板放入酶标仪中用Gen5软件进行OD_450nm读数分析； 

9）结果判定：待检样品的OD_450nm值为P，阴性对照OD_450nm值为N，当P/N≥2.1时判为阳性，1.5≤P/N＜2.1时判为可疑，P/N＜1.5判为阴性。 

附图说明

图1为利用Western-blot对单克隆抗体进行特异性分析结果。表明获得的单克隆抗体能与PEPC基因（GenBank登录号E17154）表达109kD的PEPC蛋白特异性结合。（图1）50kD处为PEPC蛋白降解的片段。 

图2为利用PEPC基因特征SSR引物（编号为MP35）进行单株PCR检测结果。6个泳道中从左到右依次为Marker、117209、117267、117272、117275、9311。其中所用的SSR引物MP35（见《中国水稻科学》，2007，21（1）：25-30）序列为：5’AAGCAGGGAAGCGAGACG3’和5’GATTGCCGCCAGCAGTAG3’（上海英俊生物有限公司合成，PAGE纯化）；PCR反应程序为：94℃，5min；94℃40s，58℃40s，72℃40s，32个循环；72℃,10min。PCR扩增产物采用3%琼脂糖（Amerisco公司原装试剂）凝胶电泳，每管PCR扩增产物加5μL的溴酚蓝混匀，点入含有溴化乙锭（EB）的3%琼脂糖凝胶，于1×TBE缓冲液中恒压120V电泳约60min，取出凝胶，在BIO-RADQuantityOne凝胶成像系统上成像观察、照相存档。 

有益效果 

本发明利用PEPC基因的表达蛋白作为抗原获取专一性的抗体制成ELISA试剂盒能够检测出转基因后代植株中PEPC基因是否得以表达，为育种家提供快速的检测结果。 

2012年利用该试剂盒对PEPC基因PCR检测的325株阳性植株进行ELISA试剂盒分析时，发现有252株表现为阳性，6株疑似阳性株和67株阴性株；其阳性率为77.54%（结果见实施例2和表3），其中在编号为56的群体中阳性率为44.68%，而在编号为78、82和84的群体中阳性率为 100%。 

生物保藏 

杂交瘤细胞株4E5，中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCCNO：C2012199，日期为2012年12月26日，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。 

具体实施方法

本发明的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）表达蛋白ELISA试剂盒包括： 

1）96孔酶标板：包被玉米PEPC蛋白多克隆抗体的酶标板（包被浓度1：1600-1：3200）； 

玉米PEPC蛋白多克隆抗体的制备过程：玉米PEPC蛋白（购自南京华泽生物技术有限公司，CAS号为9067-77-0）免疫3月龄的新西兰大白兔，取PEPCase与等量弗氏完全佐剂充分混匀乳化，颈部皮下多点注射，每只1mg；2周后第二次免疫，取PEPCase与等量弗式不完全佐剂充分混匀乳化，颈部皮下多点注射，每只1mg；再2周后第三次免疫，取PEPCase与等量弗式不完全佐剂充分混匀乳化，颈部皮下多点注射，每只1mg；2周后第四次免疫，取PEPCase耳缘静脉注射，每只2mg。最后一次免疫后7d心脏采血获取抗血清。 

2）玉米PEPC蛋白单克隆抗体：玉米PEPC蛋白免疫BALB/c小鼠获得杂交瘤细胞4E5，用杂交瘤细胞4E5制备的单克隆抗体（工作效价1：400-1：800）。 

玉米PEPC单克隆抗体的制备过程： 

①玉米PEPC蛋白免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫，取PEPCase与等量弗氏完全佐剂充分混匀乳化，腹部皮下多点注射，每只50μg；2周后第二次免疫，取PEPCase与等量弗式不完全佐剂充分混匀乳化，腹部皮下多点注射，每只50μg；再2周后第三次免疫，取PEPCase与等量弗式不完全佐剂充分混匀乳化，腹部皮下多点注射，每只50μg；再2周后第四次免疫，取PEPCase腹腔注射，每只100μg。最后一次免疫后断尾采血，检测抗血清效价。3天后，选择效价高的小鼠取脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤细胞经50%PEG融合，获得杂交瘤细胞4E5； 

②：7d后，用15%FCS的HT培养基换出1/2培养基。14d后，改用15%FCS的HT完全培养基，当细胞生长至孔底面积的1/5且上清变黄时，采用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液； 

③：选择具有阳性反应的杂交瘤细胞系，利用有限稀释法经过3次亚克隆，获得单克隆抗体杂交瘤细胞株4E5。将BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，10d后腹腔接种单克隆抗体杂交瘤细胞4E5，约10d后采集腹水，通常每只小鼠可采5-10mL腹水，离心，去除细胞成分和其他沉淀物，取上清。 

3）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（工作效价1：5000-1：10000）； 

4）阴性对照品：未转玉米PEPC基因的水稻蛋白提取液。 

5）样品处理液：50mmol·L^-1Tris-HCL，pH7.5，1mmol·L^-1MgCl₂，5mmol·L^-1DTT，2%PVP，10%甘油； 

6）稀释液：磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01M，pH7.5）； 

7）洗涤液：磷酸盐吐温缓冲液（PBST）（1000mL0.01MPBS中加0.5mLTween-20）； 

8）底物溶液： 

底物缓冲液:Na₂HPO₄·12H₂O0.2g；NaH₂PO₄·2H₂O6.84g，双蒸水500mL；4℃保存备用； 

TMB母液：TMB40mg；DMSO5mL；避光4℃保存备用； 

双蒸水配制的体积比1%H₂O₂。 

玉米PEPC基因表达蛋白ELISA试剂盒的使用方法为： 

1）将0.1g的植物样品在加有预冷的1mL的样品处理液的研钵中研碎，室温下放置约5min，10000rpm离心5min，取上清液100μL加入酶标板的一个孔中，37℃孵育60min； 

2）洗涤液洗板3次，每次3-5min； 

3）加入100μL工作浓度的单克隆抗体，37℃孵育90min； 

4）洗涤液洗板3次，每次3-5min； 

5）加入100μL工作浓度的酶标二抗，37℃孵育90min； 

6）洗涤液洗板5次，每次3-5min； 

7）加入新配制的底物溶液:12mL底物缓冲液+120μLTMB母液+48μL双蒸水配制的体积比1%H₂O₂，避光作用10min； 

8）避光作用10min； 

9）加入2mol/LH₂SO₄终止液50μL，将酶标板放入酶标仪中用Gen5软件进行OD_450nm读数分析； 

10）结果判定：待检样品的OD_450nm值为P，阴性对照OD_450nm值为N，当P/N≥2.1时判为阳性，1.5≤P/N＜2.1时判为可疑，P/N＜1.5判为阴性。 

实施例1 

首先对PEPC蛋白进行Western-blot分析，结果表明获得的用杂交瘤细胞4E5制备的单克隆抗体能与PEPC基因（GenBank登录号E17154）表达109kD的PEPC蛋白特异性结合。（图1）50kD处为PEPC蛋白降解的片段。 

利用从湖南杂交水稻研究中心引进的含有玉米PEPC基因无选择标记的水稻阳性品种06D351（袁定阳等，共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系纯合体，《杂交水稻》，2007,22（2）：57-63）为供体，9311（又名扬稻6号《杂交水稻》，2001,16（6）：13-15）为受体进行回交转育，其中117209、117267、117272和117275为回交转育BC₄F₃群体中的经PCR检测为阳性的稳定单株（PCR检测结果见图2）。PEPC基因水稻ELISA试剂盒检测结果（表1）显示，117209、117267为阳性，117272、117275为阴性。与利用PEPC基因设计SSR引物进行PCR分析的电泳结果比较，117272与117275转PEPC基因的水稻品种中未表达PEPC蛋白。表1为利用本发明ELISA试剂盒检测部分回交转育PEPC基因的结果。 

表1部分转PEPC基因水稻ELISA试剂盒检测结果 

实施例2 

首先利用玉米PEPC基因特征引物MP35（《中国水稻科学》，2007,21（1）：25-30）对不同世代（F₂、BC₁F₂、F₃和F₄群体，这些群体是利用从湖南杂交水稻研究中心引进的含有玉米PEPC基因的转基因植株06D351（袁定阳等，共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系 纯合体，《杂交水稻》2007，22（2）：57-63）为父本；9311（又名扬稻6号《杂交水稻》，2001，16（6）：13-15）、宁恢108（《中国稻米》，2006，6:19-20）和徐稻7号（《北方粳稻》，2010，40（4）:66-67）为母本进行杂交回交后构建的群体单株进行PCR分析，结果有325个单株为阳性株，然后利用该ELISA试剂盒进行检测并根据标准进行判定。其中“编号”表示为该单株的田间编号；“平均值”为同一样品测量3次的平均；“P/N”为样品与阴性对照的比值。 

对PCR分子检测阳性的杂交、回交转育PEPC基因的F₂、BC₁F₂、F₃和F₄群体单株（共325个单株样品）进行ELISA分析，结果显示，在325株样品中，有252株为阳性单株，6株疑似阳性株和67株阴性株；其阳性率为77.54%（结果见表3），其中在编号为56的群体中阳性率为44.68%，而在编号为78、82和84的群体中阳性率为100%。 

表3经PCR检测阳性单株的ELISA试剂盒检测结果 

实施例3 

试剂盒保存期实验 

试剂盒保存条件为-20℃，经保存1，2，4，6和12个月后测定，试剂盒仍能获得明显的检测结果（结果见表2）。 

表2保存期实验 

P为待检样品2个平行孔的OD_450nm平均值；N为阴性对照93112个平行孔的OD_450nm平均值。