一种高效提取用于PCR扩增的地下水微生物DNA的方法

摘要

本发明公开了一种高效提取用于PCR扩增的地下水微生物DNA的方法，该方法的步骤为：第一步收集地下水微生物，用无菌微孔滤膜收集微生物，再用含有十六烷基三甲基溴化铵的缓冲液将微生物洗脱下来制得微生物细胞液；第二步裂解地下水微生物细胞，向微生物细胞液中加入溶菌酶和蛋白酶K进行细胞裂解，温水水浴后离心，得到细胞裂解上清液；第三步纯化细胞裂解液，将细胞裂解上清液进行多次离心纯化后，得到粗提DNA溶液；第四步纯化微生物基因组DNA，将粗提DNA溶液进行离心纯化、用体积浓度为70%的乙醇抽提后得到纯化的微生物基因组DNA。本发明方法能够高效提取出高质量的地下水微生物基因组DNA，操作简单，提取纯度高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因组DNA的提取方法，具体涉及一种高效提 取用于PCR扩增的地下水微生物DNA的方法。

背景技术

由于工厂废水、生活废水、生活垃圾的大量排放，化肥、农药的 大量使用致使地下水污染日趋严重，目前全国有90%的地下水都遭到 了不同程度的污染，其中60%为严重污染，水污染正威胁着全人类的 生活状况甚至生命。及时的检测地下水是否被污染以及污染程度，以 及如何治理水污染已成为当今社会的重要话题。

地下水微生物可以科学评价地下水的质量变化，而目前可在实验 室培养的微生物还不到自然界的1%，还有很多微生物没有被人类所 认识。随着分子生物技术的引入，使得地下水微生物降低了对培养的 依赖，而提取基因组DNA则成为研究地下水微生物分子生态学的前 提。地下水成分复杂，含有大量的有机或无机化合物存在，某些酶抑 制剂、重金属离子等都会干扰提取反应的进行，这给地下水微生物基 因组DNA的提取及PCR扩增带来了困难。

分子生物技术研究地下水微生物菌群结构的实质是用地下水微 生物DNA的不均一性来反映地下水微生物种群结构特征。因此，要 获得高浓度、大片段、多样性高、具有代表意义的地下水微生物基因 组DNA是研究地下水微生物菌群结构的分子生物学基础。而地下水 中含有很多有可能不利于DNA提取的物质，这些物质可能对内切酶 消化、PCR扩增、杂交等后续操作产生强烈的影响，因此提取高纯度、 质量好的DNA是非常重要的。且地下水微生物数量少，提取难度高， 要想简单有效的提取出高质量地下水微生物基因组DNA是一种巨大 的挑战。

发明内容

本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一 种高效提取用于PCR扩增的地下水微生物DNA的方法，该方法能够 高效提取出高质量的地下水微生物基因组DNA，且操作方法简单， DNA的提取纯度高，能够满足PCR扩增的要求。

为解决上述问题，本发明采用技术方案为：

一种高效提取用于PCR扩增的地下水微生物DNA的方法，该方 法包括收集地下水微生物、裂解地下水微生物细胞、纯化细胞裂解液 和提取纯化微生物基因组DNA步骤。

本发明为了实现高效提取地下水微生物基因组DNA，较佳的技 术方案有，该方法的具体步骤为：

第一步、收集地下水微生物：取地下水样品用无菌微孔滤膜过滤 收集微生物，再用含有十六烷基三甲基溴化铵的缓冲液将无菌微孔滤 膜上的微生物洗脱下来制得微生物细胞液；缓冲液中含有十六烷基三 甲基溴化铵，能够达到较好的洗脱效果。

第二步、裂解地下水微生物细胞：向微生物细胞液中加入溶菌酶 进行溶菌酶酶解，将溶菌酶酶解后的裂解液转入离心管，向离心管中 加入蛋白酶K进行蛋白酶酶解，温水水浴后离心，得到细胞裂解上 清液；本发明使用溶菌酶和蛋白酶K对细胞进行裂解，能够达到较 好的裂解效果，并且避免了微生物基因组DNA被生物酶破坏，保证 了DNA的完整性。

第三步、纯化细胞裂解液：将细胞裂解上清液进行多次离心纯化 后，得到粗提DNA溶液；进行离心纯化后，去除了细胞膜及细胞器， 得到粗提DNA溶液。

第四步、纯化微生物基因组DNA：将粗提DNA溶液进行离心纯 化、用体积浓度为70%的乙醇抽提后得到纯化的微生物基因组DNA； 本发明使用体积浓度为70%的乙醇抽提纯化基因组DNA，能够有效 除去杂质，得到高纯度的基因组DNA。

本发明为了提高基因组DNA的提取效果，较佳的技术方案还有， 第二步中所述裂解地下水微生物细胞的操作过程为：

①溶菌酶酶解：向微生物细胞液中加入溶菌酶溶液，至微生物细 胞液中的溶菌酶浓度为10mg/mL，于30℃～40℃条件下水浴1～2h 后转入新离心管；

②蛋白酶酶解：向溶菌酶酶解后的微生物细胞液中加入蛋白酶 K，至微生物细胞液中蛋白酶K的浓度0.2mg/mL，再加入100微升质 量浓度为20%的十二烷基硫酸钠、40微升5mol/L的NaCl溶液和20 微升2mol/L的Na₃PO₄溶液，于53℃水浴2h后，以转速9000～ 12000r/min离心5min后取上清，得到细胞裂解上清液。本发明在蛋白 酶K酶解过程中加入Na₃PO₄溶液，能够达到更好的酶解效果，提高了 基因组DNA的纯度，避免了DNA被其它生物酶分解。

本发明为了纯化细胞裂解液，得到高纯度的基因组DNA，较佳 的技术方案还有，第三步中所述纯化细胞裂解液的操作过程为：

①向细胞裂解上清液内加入细胞裂解上清液体积0.1～0.3倍的 溶液III混匀，冰浴10～15min后，于4℃温度下12000r/min离心10～ 15min，去除沉淀后得到一号上清液；

②向一号上清液中加入一号上清液体积2倍的预冷的无水乙醇， 于-20℃温度下沉淀60min，再于4℃温度下12000r/min离心10～ 15min，去除上清液后得到一号沉淀；

③向一号沉淀中加入400～500微升提取缓冲液溶解一号沉淀得 到粗提DNA溶液。本发明采用无水乙醇沉淀DNA与RNA，能够达 到更好的沉淀效果，而之后的操作中在使用RNA酶将RNA酶解， 得到较为纯净的基因组DNA。

本发明为了能够提取出高纯度的基因组DNA，以用于PCR扩增， 较佳的技术方案还有，第四步中所述纯化微生物基因组DNA的操作 过程为：

①向粗提DNA溶液加入与粗提DNA溶液等体积的一号抽提液 抽提10min后，于冰上静置15～20min；再于4℃温度下12000r/min 离心10min后，取上清液至新离心管得到二号上清液；本发明采用冰 上静置、离心等操作，能够达到更好的抽提效果；

②向二号上清液中加入与二号上清液等体积的二号抽提液，抽提 10min后于冰上静置15～20min，再于4℃温度下12000r/min离心 10min，取上清，得到三号上清液；此处的二号抽提液能够进一步去 除细胞碎片等杂质，同时除去残余的酚，避免酚类物质对DNA的污 染，提高DNA的纯度；

③向三号上清液中加入三号上清液2倍体积的预冷无水乙醇，于 -20℃温度下沉淀30～60min，再于12000r/min转速下离心15min，去 除上清液得到二号沉淀；

④向二号沉淀中加入体积浓度为70%的预冷乙醇清洗二号沉淀 两次，将沉淀自然风干后，再加入50μl含有微量核糖核酸酶的TE缓 冲液，得到纯化的微生物基因组DNA，于-20℃温度下保存备用。

本发明为了达到较好的提取效果，较佳的技术方案还有，提取缓 冲液的成分为：50～l00mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、 l00～300mmol/L的乙二胺四乙酸、质量分数为5%～10%的十六烷基 三甲基溴化铵、浓度为0.5～1mol/L的蔗糖，pH值为8.0。

本发明为了收集足够的微生物样品，提取出足够量的基因组 DNA以满足PCR的需求，较佳的技术方案还有，第一步中所述收集 地下水微生物的操作中，地下水样品取用10～50L，无菌微孔滤膜的 孔径为0.22μm。

本发明为了达到更好的抽提效果，高效出去细胞碎片及杂质，较 佳的技术方案还有，一号抽提液为酚:氯仿:异戊醇以体积比25:24:1 的混合液；二号提取液为氯仿:异戊醇以体积比24:1的混合液。

本发明为了进一步提高提取效果，较佳的技术方案还有，提取缓 冲液的成分为：60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、 200mmol/L的乙二胺四乙酸、质量分数为6%的十六烷基三甲基溴化 铵、0.8mol/L的蔗糖，pH值为8.0。

本发明为了达到更好的提取效果，滤出适量的微生物细胞，较佳 的技术方案还有，溶液III使用60mL5mol/L乙酸钾、11.5mL冰醋 酸和28.5ml去离子水配制而成，配制成的溶液III中钾离子的浓度为 3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L；地下水样品取用量为24L。

本发明的优点和有益效果为：

（1）本发明提取产物的纯度较高，方法简单不需要太多的仪器， 就可以得到可用于直接PCR的DNA产物。

（2）本发明提取操作成本低，本发明在提取地下水微生物的基 因组DNA过程中不需要使用商品化的纯化试剂盒进行纯化，因而降 低了成本。

（3）本发明方法的适用的范围广，可用于受过不同程度污染的 地下水微生物基因组DNA的提取。

附图说明

图1为三种对比方法所得到的基因组DNA电泳图谱。

图2为三种对比方法获得的未经纯化的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱。

图3为三种对比方法获得的纯化后的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱。

图4为本发明方法对四种不同污染程度的地下水微生物基因组 DNA提取物PCR扩增产物的电泳图谱。

图中：1、方法一SDS法提取的基因组DNA电泳图谱；2、方法 二本发明实施例6提取的基因组DNA电泳图谱；3、方法二本发明 实施例6方法提取的基因组DNA电泳图谱；4、方法三试剂盒方法 提取的基因组DNA电泳图谱；5、方法一SDS法获得的未经纯化的 基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；6、方法二本 发明实施例6方法获得的未经纯化的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；7、方法二本发明实施例6方法获 得的未经纯化的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图 谱；8、方法三试剂盒方法获得的未经纯化的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；9、方法一SDS法获得的纯化后 的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；10、方法 二本发明实施例6方法获得的纯化后的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；11、方法二本发明实施例6方法 获得的纯化后的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图 谱；12、方法三试剂盒方法获得的纯化后的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；13、包钢尾矿库区渗漏的地下水 微生物基因组DNA提取物PCR扩增产物的电泳图谱；14、距离包钢 尾矿库区5公里的居民废弃饮用井水的地下水微生物基因组DNA提 取物PCR扩增产物的电泳图谱；15、距离包钢尾矿库区8公里的居 民正常饮用井水的地下水微生物基因组DNA提取物PCR扩增产物的 电泳图谱；16、距离包钢尾矿库区10公里的居民正常饮用井水的地 下水微生物基因组DNA提取物PCR扩增产物的电泳图谱。

具体实施方式

下列实施例将进一步说明本发明。

实施例1

本发明采用技术方案为一种高效提取用于PCR扩增的地下水微 生物DNA的方法，该方法包括收集地下水微生物、裂解地下水微生 物细胞、纯化细胞裂解液和提取纯化微生物基因组DNA步骤。本发 明方法的具体步骤为：

第一步、收集地下水微生物：取地下水样品用无菌微孔滤膜过滤 收集微生物，再用含有十六烷基三甲基溴化铵的缓冲液将无菌微孔滤 膜上的微生物洗脱下来制得微生物细胞液；缓冲液中含有十六烷基三 甲基溴化铵，能够达到较好的洗脱效果。

第二步、裂解地下水微生物细胞：向微生物细胞液中加入溶菌酶 进行溶菌酶酶解，将溶菌酶酶解后的裂解液转入离心管，向离心管中 加入蛋白酶K进行蛋白酶酶解，温水水浴后离心，得到细胞裂解上 清液；本发明使用溶菌酶和蛋白酶K对细胞进行裂解，能够达到较 好的裂解效果，并且避免了微生物基因组DNA被生物酶破坏，保证 了DNA的完整性。

第三步、纯化细胞裂解液：将细胞裂解上清液进行多次离心纯化 后，得到粗提DNA溶液；进行离心纯化后，去除了细胞膜及细胞器， 得到粗提DNA溶液。

第四步、纯化微生物基因组DNA：将粗提DNA溶液进行离心纯 化、用体积浓度为70%的乙醇抽提后得到纯化的微生物基因组DNA； 本发明使用体积浓度为70%的乙醇抽提纯化基因组DNA，能够有效 除去杂质，得到高纯度的基因组DNA。

实施例2

在实施例1的基础上，本发明为了提高基因组DNA的提取效果， 较佳的实施方式还有，第二步中所述裂解地下水微生物细胞的操作过 程为：

①溶菌酶酶解：向微生物细胞液中加入溶菌酶溶液，至微生物细 胞液中的溶菌酶浓度为10mg/mL，于35℃条件下水浴1.5h后转入新 离心管；

②蛋白酶酶解：向溶菌酶酶解后的微生物细胞液中加入蛋白酶 K，至微生物细胞液中蛋白酶K的浓度0.2mg/mL，再加入100微升质 量浓度为20%的十二烷基硫酸钠、40微升5mol/L的NaCl溶液和20 微升2mol/L的Na₃PO₄溶液，于53℃水浴2h后，以转速11000r/min离 心5min后取上清，得到细胞裂解上清液。本发明在蛋白酶K酶解过程 中加入Na₃PO₄溶液，能够达到更好的酶解效果，提高了基因组DNA 的纯度，避免了DNA被其它生物酶分解。

其它部分与实施例1完全相同。

实施例3

在实施例2的基础上，本发明为了纯化细胞裂解液，得到高纯度 的基因组DNA，较佳的实施方式还有，第三步中所述纯化细胞裂解 液的操作过程为：

①向细胞裂解上清液内加入细胞裂解上清液体积0.2倍的溶液III 混匀，冰浴12min后，于4℃温度下12000r/min离心13min，去除沉 淀后得到一号上清液；

②向一号上清液中加入一号上清液体积2倍的预冷的无水乙醇， 于-20℃温度下沉淀60min，再于4℃温度下12000r/min离心14min， 去除上清液后得到一号沉淀；

③向一号沉淀中加入500微升提取缓冲液溶解一号沉淀得到粗 提DNA溶液。采用无水乙醇沉淀DNA与RNA，能够达到更好的沉 淀效果。

其它部分与实施例2完全相同。

实施例4

在实施例3的基础上，本发明为了能够提取出高纯度的基因组 DNA，以用于PCR扩增，较佳的实施方式还有，第四步中所述纯化 微生物基因组DNA的操作过程为：

①向粗提DNA溶液加入与粗提DNA溶液等体积的一号抽提液 抽提10min后，于冰上静置20min；再于4℃温度下12000r/min离心 10min后，取上清液至新离心管得到二号上清液；

②向二号上清液中加入与二号上清液等体积的二号抽提液，抽提 10min后于冰上静置15min，再于4℃温度下12000r/min离心10min， 取上清，得到三号上清液；此处的二号抽提液能够进一步去除细胞碎 片等杂质，同时除去残余的酚，避免酚类物质对DNA的污染，提高 DNA的纯度；

③向三号上清液中加入三号上清液2倍体积的预冷无水乙醇，于 -20℃温度下沉淀50min，再于12000r/min转速下离心15min，去除上 清液得到二号沉淀；

④向二号沉淀中加入体积浓度为70%的预冷乙醇清洗二号沉淀 两次，将沉淀自然风干后，再加入50μl含有微量核糖核酸酶的TE缓 冲液，得到纯化的微生物基因组DNA，于-20℃温度下保存备用。

其它部分与实施例3完全相同。

实施例5

在实施例4的基础上，本发明为了达到较好的提取效果，较佳的 实施方式还有，提取缓冲液的成分为：60mmol/L的三羟甲基氨基甲 烷盐酸缓冲液、200mmol/L的乙二胺四乙酸、质量分数为6%的十六 烷基三甲基溴化铵、0.8mol/L的蔗糖，pH值为8.0；一号抽提液为酚: 氯仿:异戊醇以体积比25:24:1的混合液；二号提取液为氯仿:异戊醇以 体积比24:1的混合液；溶液III使用60mL5mol/L乙酸钾、11.5mL 冰醋酸和28.5ml去离子水配制而成，配制成的溶液III中钾离子的浓 度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L，其它部分与实施例4完全相 同。

实施例6

在实施例5的基础上，本发明为了达到更好的提取效果，滤出适 量的微生物细胞，较佳的实施方式还有，地下水样品取用量为24L， 无菌微孔滤膜的孔径为0.22μm，其它部分与实施例5完全相同。

本发明根据实施例6方法获得的微生物基因组DNA具有较高的 纯度和较大的含量，实验室中将实施例6的方法获得的基因组DNA 与实验室常用的十二烷基硫酸钠即SDS提取法、试剂盒提取方法所 得的基因组DNA做对比，发现本发明实施例6的方法具有较大的优 势。

对比1：三种方法获得的微生物基因组DNA浓度和纯度对比

用分光光度计检测所三种方法所提取核酸的浓度和纯度，检测结 果见表1。

用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的目的DNA片段的大小，其中琼 脂糖凝胶的浓度为0.8%，电泳电压为100V，电泳时间为1.5h，使用 EB染色15min。电泳对比结果见图1。

表1：三种方法获得的DNA浓度和纯度对比表

由表1可知：方法一提取出的地下水微生物基因组DNA含量低 且纯度低，方法二本发明实施例6提取出来的基因组DNA纯度与浓 度均比较理想，方法三试剂盒所提取基因组DNA的浓度与纯度和实 施例6方法所得基因组DNA结果相近。

图1为三种方法所得到的基因组DNA电泳图谱：图1中1为方 法一SDS法提取的基因组DNA电泳图谱；2为方法二本发明实施例6 提取的基因组DNA电泳图谱；3为方法二本发明实施例6方法提取的 基因组DNA电泳图谱；4为方法三试剂盒方法提取的基因组DNA电泳 图谱；可以得到方法一提取出来的基因组DNA电泳图谱没有跑出条 带，方法二和方法三提取出来的基因组DNA电泳跑出的条带比较清 晰。

由表1和图1的对比可知，本发明实施例6方法提取的微生物基 因组DNA具有较高的纯度和浓度，能够满足PCR扩增的要求。

对比2：三种方法获得的未经纯化的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物对比

以三种方法提取的基因组DNA为模板：扩增16SrDNA基因的 部分序列，PCR扩增引物为细菌通用引物，其正向引物 为:27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；其反向引物 为:1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

16SrDNA-PCR反应体系，50μl反应体系的含量为：

PCR反应条件为:预变性:94℃，2min;变性:94℃，30s；退火:56 ℃，30s；延伸:72℃，30s；30个循环；终延伸：72℃，10min。

图2为三种对比方法获得的纯化后的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱，5为方法一SDS法获得的未经纯化 的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；6为方法二本 发明实施例6方法获得的未经纯化的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR 扩增产物电泳图谱；7为方法二本发明实施例6方法获得的未经纯化 的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；8为方法三试 剂盒方法获得的未经纯化的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物 电泳图谱。

由图2可知，方法一提取出来的未经纯化的基因组DNA进行扩 增没有跑出条带；方法二和方法三获得的未经纯化的基因组DNA扩 增能跑出条带，说明方法二的提取产物不需要进一步纯化，就可以直 接用于PCR扩增。

对比3：三种方法获得的纯化后的基因组DNA样品的 16SrDNA-PCR扩增产物对比

采用对比2所使用的16SrDNA-PCR扩增方法，对三种方法获得 的纯化后的基因组DNA样品进行16SrDNA-PCR扩增后，进行电泳 对比得到图3所示电泳图谱。图3中9为方法一SDS法获得的纯化后 的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；10为方法二 本发明实施例6方法获得的纯化后的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR 扩增产物电泳图谱；11为方法二本发明实施例6方法获得的纯化后 的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物电泳图谱；12为方法三 试剂盒方法获得的纯化后的基因组DNA样品的16SrDNA-PCR扩增产物 电泳图谱。

由图3可知：经纯化后三种方法提取出来的基因组DNA扩增产 物都能通过电泳跑出清晰的条带。

综合对比1、对比2和对比3的结果可得：方法一SDS方法提取 出来的地下水基因组DNA含量低且纯度低，必须经过核酸纯化试剂 盒的纯化后才能PCR扩增出来较多的DNA。方法二即实施例6的方 法提取出来的基因组DNA纯度与浓度均较为理想，可以直接用于 PCR扩增；方法三即试剂盒方法所提取的结果与本发明实施例6的提 取结果相近。说明本发明实施例6的基因组DNA提取方法是一种适 合地下水微生物PCR扩增的简便、高效的提取方法。

对比4：采用实施例6的方法对不同污染程度的地下水进行微生 物基因组DNA提取效果对比。

采用本发明实施例6的方法同时提取四种不同污染程度的地下 水样品中的微生物基因组DNA：1号样品为包钢尾矿库区渗漏的地 下水，2号样品为距离包钢尾矿库区5公里的居民废弃饮用井水，3 号样品为距离包钢尾矿库区8公里的居民正常饮用井水，4号样品为 距离包钢尾矿库区10公里的居民正常饮用井水。将使用实施例6方 法提取的四种样品的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为 8%，电压100V，电泳时间1h。同时检测四种样品所得核酸的浓度和 纯度。

表2.四种水样品中微生物基因组DNA浓度和纯度检测结果

由表2可知本发明基本适用于地下水微生物基因组DNA的提取 方法，提取产量在115.3ng/μl以上，OD260nm/OD280nm在1.84～1.91 之间，OD260nm/OD230nm介于1.61～2.17之间，说明提取的基因组 DNA纯度和浓度比较高。

将四种水样品中采集的微生物基因组DNA进行PCR扩增，其 PCR扩增产物电泳图谱见图4。图4中13为包钢尾矿库区渗漏的地 下水微生物基因组DNA提取物PCR扩增产物的电泳图谱；14为距离 包钢尾矿库区5公里的居民废弃饮用井水的地下水微生物基因组DNA 提取物PCR扩增产物的电泳图谱；15为距离包钢尾矿库区8公里的 居民正常饮用井水的地下水微生物基因组DNA提取物PCR扩增产物的 电泳图谱；16为距离包钢尾矿库区10公里的居民正常饮用井水的地 下水微生物基因组DNA提取物PCR扩增产物的电泳图谱。

由图4可得，本发明提取地下水微生物基因组DNA的方法能够 对不同污染程度的地下水微生物进行较好的提取，具有宽范围、高效 率的提取效果。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明 所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人 员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变 动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的 显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。