检测猪蓝耳病流行病毒与HP-PRRS病毒天津株的RT-PCR引物及试剂盒

摘要

本发明公开了一对检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株的RT-PCR引物及试剂盒。所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-CGTCCGTGTCATCAAGCAGCTC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-AAAAGAGGCACAATAGAGTAAAAGC-3′。所述试剂盒包括以上所述的引物。采用本发明引物能检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株是否呈阳性，具有敏感性高、特异性强、快速简便、检测成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒分子检测生物技术领域，具体涉及一对检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病疫苗天津株的RT-PCR引物及试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。本病于1996年在我国首次报道。

2006年我国南方部分省份出现养猪场暴发猪“高热病”疫情，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪蓝耳病”（Highly PathogenicPorcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS），其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。依据猪繁殖与呼吸综合征病毒结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分为经典猪蓝耳病病毒和高致病性猪蓝耳病病毒两种亚型，高致病性猪蓝耳病病毒包括高致病性猪蓝耳病病毒江西株（JXA1-R株）、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株（HuN4-F112株）、高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）。目前我国使用的高致病性猪蓝耳病活疫苗有江西株（JXA1-R株）和湖南株（HuN4-F112株）、天津株（TJ株）。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。随着PCR技术研究和应用的深化，该技术在兽医领域得到广泛应用，几乎所有已知的DNA和RNA序列的病毒均可用PCR和RT-PCR方法进行特异性检测、诊断，如口蹄疫、猪瘟、蓝耳、伪狂犬病、细小病毒感染、传染性法氏囊病、禽流感等。

中国专利申请号为200710076592.5，公开了一种用于检测高致病性猪蓝耳病病毒核苷酸片段的引物和探针序列，该引物对包括:由序列为CCCAAGCTGATGACACCTTT的上游引物PVpf和序列为AATCCAGAGGCTCATCCTGGT的下游引物PVpr组成的引物对,探针Pfpb序列为CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA。中国专利申请号为200810032141.6，公开了一种高致病性猪蓝耳病病毒RT-PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包含的引物序列为：5’-CGTAGAACTGTGACAACAAC-3’、5’-TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT-3’。使用上述引物只能检测是否感染了高致病性猪蓝耳病病毒，无法判断是否有感染经典猪蓝耳病病毒，或两者共同感染。中国专利（申请号）200910077704.8公开了PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法，该方法使用的引物对为：由序列为CGCACCAGATGGRACCTACTT的上游引物PRRSV-F2和序列为ACGGTGTTCAGTGAGGGCTTT的下游引物PRRSV-R3组成的引物对，以及由上游引物的反向互补序列AAGTAGGTYCCATCTGGTGCG和下游引物的反向互补序列AAAGCCCTCACTGAACACCGT组成的引物对，该引物对经一次反应便能鉴别样本是否是经典猪蓝耳病病毒感染,或者是高致病性猪蓝耳病病毒,或者是两者共同感染。但上述方法未能进一步将高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）与猪蓝耳病其他流行病毒加以鉴别。

发明内容

本发明的目的是提供一对检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病疫苗天津株（TJ株）的RT-PCR引物及试剂盒，经一次反应便能检测样本是否呈高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）阳性，或者呈猪蓝耳病流行病毒阳性，或者上述病毒均呈阳性，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。

本发明的技术方案为：

一对检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-CGTCCGTGTCATCAAGCAGCTC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-AAAAGAGGCACAATAGAGTAAAAGC-3′。

一种检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）的试剂盒,所述试剂盒包括以上所述的引物。

以上所述检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）的试剂盒,还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、电泳检测试剂、阴性对照和阳性对照。

所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；

所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和Pc；

所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和DNA；

所述电泳检测试剂包括：50倍稀释的TAE电泳缓冲液；

所述阴性对照包括：DEPC水；

所述阳性对照包括：猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）。

试验结果表明：高致病性猪蓝耳病病毒江西株（JXA1-R株）、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株（HuN4-F112株）、经典猪蓝耳病病毒及猪群自然感染的其他蓝耳病病毒均出现804bp扩增带。所述猪蓝耳病流行病毒优选为高致病性猪蓝耳病病毒江西株（JXA1-R株）、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株（HuN4-F112株）或经典猪蓝耳病病毒（CH-1R株）。

所述高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）优选为高致病性猪蓝耳病活疫苗天津株。

所述高致病性猪蓝耳病病毒江西株（JXA1-R株）优选为高致病性猪蓝耳病活疫苗江西株，所述高致病性猪蓝耳病病毒湖南株（HuN4-F112株）优选为高致病性猪蓝耳病活疫苗湖南株，所述经典猪蓝耳病病毒优选为经典猪蓝耳病疫苗CH-1R株。

本发明的具体原理是利用高致病性猪蓝耳病和经典猪蓝耳病病毒的Nsp2基因的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，通过RT-PCR扩增后分别产生不同长度的目的片段，扩增高致病性猪蓝耳病疫苗天津株特异性核酸目的片段长度为443bp，扩增猪蓝耳病流行病毒（包括经典猪蓝耳病病毒、除了天津株以外的高致病性猪蓝耳病病毒及猪群自然感染的蓝耳病病毒）特异核酸目的片段为804bp，从而达到检测样本是否呈高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）阳性，或者呈猪蓝耳病流行病毒阳性，或者上述病毒均呈阳性的目的。试验方法及过程如下：

1.引物设计：

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物长度一般为16-25bp左右，引物之间、引物内无互补序列。通过对经典猪蓝耳病病毒代表株（CH-1R）、高致病性猪蓝耳病病毒典型株江西株（JXA1株）、天津株（TJ株）、湖南株（HuN4-F112株）及美洲型的代表株VR2332基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的片段，设计多对引物，通过匹配、筛选最优引物组合如下：

上游引物核苷酸序列Pa：5′-CGTCCGTGTCATCAAGCAGCTC-3′

下游引物核苷酸序列Pc：5′-AAAAGAGGCACAATAGAGTAAAAGC-3′

2.反应体系的建立和优化：

将灭活的待检样品用Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于-20℃备用。

2.1引物用量的优化在反应体系其他条件相同的情况下，将引物对的用量分别从0.1μL至1.8μL加入体系，通过实验结果分析比较，确定最优引物用量为0.3μL好热0.4μL。

2.2氯化镁浓度的优化在反应体系其他条件相同的情况下通过实验结果分析比较，确定氯化镁的浓度为25mM最佳。

2.3反转录酶（M-MLV）的优化通过实验结果对比分析，选择200U/μL反转录酶作为反应体系最佳用量。

2.4Taq DNA聚合酶（Taq酶）的优化通过实验结果对比分析，选择5U/μL酶作为反应体系最佳用量。

2.5dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，反转录时选择10mM，PCR扩增时选择2.5mM作为反应体系最佳用量。

利用上述引物和各成分的最终浓度，最后确定采用的RT-PCR反应体系为25μL，所需各组及相应浓度见表1。

表1检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株的RT-PCR引物反应体系

3.RT-PCR反应条件优选如下：

反转录体系：42℃45min，94℃3min；

扩增条件：94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的引物检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

2.本发明提供的引物对于无猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）的检测样品无扩增带，说明引物对目的基因具有良好的特异性。

3.本发明是针对高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）、江西株（JXA1-R株）、湖南株(HuN4-F112株)和经典猪蓝耳病流行病毒的典型代表毒株（CH-1R株）以及高度保守区域进行引物设计，避免了假阴性结果的产生。

4.本发明设计的引物可以同时对样本进行两种类型病毒基因的鉴别检测，经一次反应便能检测样本是否呈高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）阳性，或者呈猪蓝耳病流行病毒阳性,或者上述病毒均呈阳性，进行35个循环扩增只需2个小时左右，节约了大量的人工时间、实验耗材，提高实验室工作效率，降低了检测成本。

附图说明

图1是本发明检测猪蓝耳病流行毒株与高致病性猪蓝耳病活疫苗毒株(天津株)的RT-PCR扩增图。

M.DNA Marker(DL2000)1.高致病性猪蓝耳病活疫苗（JXA1-R株）阳性对照2.经典猪蓝耳病疫苗（CH-1R）株阳性对照3.高致病性猪蓝耳病活疫苗(HuN4-F112株)阳性对照4.高致病性猪蓝耳病活疫苗（TJ株）阳性对照5.阴性对照6.高致病性猪蓝耳病病毒（JXA1-R株）阳性样品7.经典猪蓝耳病病毒（CH-1R株）阳性样品8.高致病性猪蓝耳病病毒(HuN4-F112株)阳性样品9.高致病性猪蓝耳病病毒（TJ株）阳性样品10.阴性样品对照

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围：

一、检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株的试剂盒

一种检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株的试剂盒，包括以下试剂，详见表2，所用试剂均可从市场上购买。

表2检测猪蓝耳病流行病毒与高致病性猪蓝耳病病毒天津株的试剂盒

二、试剂盒的使用方法

试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1.病毒RNA的提取

①取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；

②加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟；

③低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；

④缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管；

⑤加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟；

⑥低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃上清液；

⑦用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；

⑧将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；

⑨加入25μL DEPC水，-20℃保存备用。

2.RT操作程序

取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs2μL、M-MLV0.5μL、HIR0.5μL、Pc2μL，RNA15μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：42℃45min，94℃3min。

3.PCR操作程序

上游引物PRru0.4μL、下游引物PRrd0.3μL、Taq DNA酶0.1μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs2μL、MgCl₂2μL、ddH₂O12.7μL,反转录产物5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。

4.电泳

称1g琼脂糖放于锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液100mL，于微波炉中熔解。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将7μL PCR扩增产物加上2μL染色液混匀后点样于琼脂糖凝胶孔中，以120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

5.结果判定

试验结果详见图1。阳性对照出现443bp、804bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。

被检样品出现443bp扩增带，表明被检样品呈高致病性猪蓝耳病病毒天津株（TJ株）阳性；被检样品出现804bp扩增带，表明被检样品呈猪蓝耳病流行病毒（包括经典猪蓝耳病病毒、除了天津株以外的高致病性猪蓝耳病病毒及猪群自然感染的蓝耳病病毒）阳性；被检样品同时出现443bp、804bp扩增带，表明被检样品呈上述两类病毒阳性；否则为阴性。本方法敏感性高、特异性强、快速简便、检测成本低，具有良好的市场应用前景。