防治畜禽隐孢子虫感染的中药复方及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种防治畜禽隐孢子虫感染的中药复方及其制备方法与应用。所述中药复方由以下重量份的原料组成：川楝子10-20重量份、槟榔10-20重量份、常山5-15重量份、石榴皮5-15重量份和地榆5-15重量份。本发明中药复方中的川楝子、槟榔、常山、石榴皮等具有的体内驱虫作用，地榆具有凉血止血清热解毒作用，对机体提高免疫力也有相应的效果，能有效防治畜禽隐孢子虫感染。

说明书

技术领域

本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种防治畜禽隐孢子虫感染的中药复 方及其制备方法与应用。

背景技术

隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是由隐孢子虫引起的呈世界性分布的人畜共 患原虫病，是一种引起人与动物急性腹泻或慢性致死性腹泻的重要致病因素。 仅次于轮状病毒的主要肠道疾病。隐孢子虫广泛寄生于哺乳动物、禽类、两栖 类、鱼类及人的消化道及其它器官，并在寄生处进行大量的繁殖，造成消化吸 收功能障碍，引起动物腹泻和隐性感染。现已发现于106个国家的人体病例， 是人体急性腹泻或慢性致死性腹泻的重要致病因素。隐孢子虫感染包括人在内 的260多种动物，研究表明，隐孢子虫主要通过接触、饮水、食物和飞沫等传 播途径传播，而隐孢虫的卵囊对外界环境，特别是对氯消毒（包括O₃等）有非 常强的抵抗力，使得传统工艺很难将其去除或杀灭（冯利红.隐孢子虫病研究进 展[J].预防医学情报杂志,2006(1):46-48.）。自1976年首次报道此病以来，已 在全世界各大洲有爆发的案例，其中已在美国的爆发最具代表性。溯源研究证 实，至少有2次大爆发的隐孢子虫为人隐孢子虫，1次为小球隐孢子虫，但有多 次引起该病爆发的隐孢子虫来源于猪和牛、伴侣动物、以及来源于家禽。这些 结果充分显示了动物源隐孢子虫对人类健康的威胁。

广东省地处亚热带，畜禽养殖密度大，目前对于畜禽养殖所产生的污水、 粪便的处理由于缺泛经济有效的处置技术，致使其对生产、生活环境和河流水 体造成了严重污染；另外，珠三角地区人口密度极大，据了解，广东省用水来 源比较单一，主要是地表水。在城市中，河道供水占88%，水库仅占12%。由 于隐孢子虫的卵囊对外界环境，特别是对氯消毒有非常强的抵抗力，传统消毒 工艺很难将其杀灭，一旦畜禽污染水源，城市人口面临大爆发的风险。再次， 由于珠三角区经济较为发达，伴侣动物的数量也正在急剧增加，而来源于伴侣 动物的C.felis和C.canis正是造成人感染的2个重要隐孢子虫虫种（Dubey, 2009）。

虽然有文献报道，一些药物对隐孢子虫病有一定的治疗效果，国外目前有 用螺旋霉素、巴龙霉素治疗患者，用人工高免疫牛初乳(hyperimmune bovine  colostrμm,HBC)、牛乳球蛋白、牛转移因子治疗也获得疗效。例如：（1）Okhuysen  P C,Chappell C L,Kettner C,et al.（Cryptosporidium parvum  metalloaminopeptidase inhibitors prevent in vitro excystation.[J].Antimicrobial  Agents and Chemotherapy,1996,40(12):2781-2784.）、（2）Forney J R,Yang S,Du C, et al.Efficacy of serine protease inhibitors against Cryptosporidium parvum infection  in a bovine fallopian tube epithelial cell culture system[J].The Journal of  parasitology,1996:638-640.（3）Keithly J S,Zhu G,Upton S J,et al.Polyamine  biosynthesis in Cryptosporidium parvum and its implications for chemotherapy[J]. Mol Biochem Parasitol,1997,88(1-2):35-42.在上述3份文献中提到，可以使用 soybean trypsin inhibitor-sbti(大豆胰蛋白酶抑制剂)等西药进行隐孢子虫的防治。

国内用大蒜素治疗人隐孢子虫病、当归补血汤及其多糖对小鼠的隐孢子虫 感染有一定效果。复方中药在近代临床观察和药理研究中证明:苦楝皮的乙醇提 取物、槟榔碱、川楝素、南瓜子、青蒿琥酯、使君子等药物具有较好的驱虫效 果，且副作用小。同时配合健胃消食的药材，健运脾胃、补养气血，能大大缓 解寄生虫导致的肠胃等器官损伤、功能紊乱以及营养不良和消瘦。目前临床上 应用的驱虫中药采用多味药材复合而成，既有植物驱虫药，又有健胃和诱食成 分（刘宗虎,夏伟新,张妍.规模猪场中西药结合驱虫的时代已来临[J].北方牧 业,2008(18).）。

但时至今日，对于隐孢子虫病尚无确切有效的药物、疫苗面世。因该病严 重影响到动物的生长和发育以及人类的健康，会造成巨大经济损失。对于隐孢 子虫病的防控最有效的方式莫过于明确其流行病学背景，减少感染机会（饶春 山,李雨来.隐孢子虫病的防控[J].畜牧与饲料科学,2010(Z2):201-202.）。因 此，目前迫切需要研究一种能够防治畜禽隐孢子虫感染的药物。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种防治 畜禽隐孢子虫感染的中药复方。

本发明的另一目的在于提供上述防治畜禽隐孢子虫感染的中药复方的制备 方法。

本发明的再一目的在于提供上述防治畜禽隐孢子虫感染的中药复方的应 用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种防治畜禽隐孢子虫感染的中药复方，所述中药复方由以下重量份的原 料组成：川楝子10-20重量份、槟榔10-20重量份、常山5-15重量份、石榴皮 5-15重量份和地榆5-15重量份。

本发明中药复方中的川楝子、槟榔、常山、石榴皮等具有的体内驱虫作用， 地榆具有凉血止血清热解毒作用，对机体提高免疫力也有相应的效果，能有效 防治隐孢子虫。

本发明所用的中药原料均可从中医药店购得，其规格符合国家医药标准。

优选的，所述中药复方由以下重量份的原料组成：川楝子18重量份、槟榔 12重量份、常山18重量份、石榴皮10重量份和地榆10重量份。

上述防治畜禽隐孢子虫感染的中药复方的制备方法，将川楝子、槟榔、常 山、石榴皮和地榆粉碎、过120目筛，混合均匀得到所述中药复方。

上述防治畜禽隐孢子虫感染的中药复方在制备畜禽饲料中的应用，所述中 药复方添加到畜禽饲料中，添加量为畜禽饲料质量的0.5%。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明为全中药配方，无抗生素残留和耐药特性，对隐孢子虫病防治具有 显著疗效。并且本发明配方主要以驱虫和提高机体免疫效果两个方面进行综合 考虑，运用微量打粉技术使药物有效混合，相对于现有驱虫西药，具有药物应 激性小，吸收度好的优点。

附图说明

图1为感染对照组雏鸡DPI12的粪便图；

图2为感染对照组雏鸡DPI8的法氏囊中隐孢子虫卵囊放大400倍检测图；

图3为各实验组雏鸡DPI1-15的排卵囊规律图；

图4为复方组、感染对照组和空白对照组雏鸡DPI1-15的排卵囊规律图；

图5为西药组、感染对照组和空白对照组雏鸡DPI1-15的排卵囊规律图；

图6为复方1组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图7为复方2组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图8为复方3组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图9为复方4组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图10为西药1组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图11为西药2组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图12为西药3组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图13为西药4组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图14为感染对照组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图15为空白对照组雏鸡DPI15的气管切片放大100倍和400倍的电镜图；

图16为复方1组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图17为复方2组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图18为复方3组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图19为复方4组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图20为西药1组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图21为西药2组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图22为西药3组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图23为西药4组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图24为感染对照组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图；

图25为空白对照组雏鸡DPI15的法氏囊切片放大100倍和400倍的电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

本发明实施例中用到的主要仪器有：烘干机、中药微量打粉机、血细胞计 数板（Hawksley BS.748）、台式高速冷冻离心（德国Eppendorf 5804R）、电子显 微镜（Leica 512661）、石蜡切片机。

本发明实施例中所述的饲料原料的购于广东省农科院畜牧所，中药原料购 于广州天河区五山路利康堂大药房。

实施例1

将30重量份的柴胡、18重量份的陈皮、30重量份的青蒿、30重量份的常 山、30重量份的苦参和20重量份的仙鹤草混匀，通过中药微量打粉机打粉制备， 得到中药复方1。

将中药复方1添加到饲料原料中，混合均匀，得到1号饲料；其中中药复 方1的添加量为饲料原料质量的0.5%。

实施例2

将30重量份的青蒿、30重量份的常山、30重量份的苦参、18重量份的百 部、30重量份的蛇床子、10重量份的三七混匀，通过中药微量打粉机打粉制备， 得到中药复方2。

将中药复方2添加到饲料原料中，混合均匀，得到2号饲料；其中中药复 方2的添加量为饲料原料质量的0.5%。

实施例3

将重量份的18川楝子、12重量份的槟榔、18重量份的常山、10重量份的 石榴皮和10重量份的地榆通过中药微量打粉机粉碎、过120目筛，混合均匀， 得到中药复方3。

将中药复方3添加到饲料原料中，混合均匀，得到3号饲料；其中中药复 方3的添加量为饲料原料质量的0.5%。

实施例4

将30重量份的青蒿、30重量份的常山、18重量份的川楝子、10重量份的 石榴皮、30重量份的苦参、30重量份的柴胡和20重量份的仙鹤草混匀，通过 中药微量打粉机打粉制备，得到中药复方4。

将中药复方4添加到饲料原料中，混合均匀，得到4号饲料；其中中药复 方4的添加量为饲料原料质量的0.5%。

实施例5

将soybean trypsin inhibitor-sbti(大豆胰蛋白酶抑制剂CAS：9035-81-8)按 50ppm的剂量加入饲料原料中，混合均匀，得到5号饲料。

实施例6

将Amastatin（氨肽酶抑制剂CAS No.67655-94-1）按75ppm的剂量加入饲 料原料中，混合均匀，得到6号饲料。

实施例7

将Pinacol（频那醇CAS No：76-09-5）按100ppm的剂量加入饲料原料中， 混合均匀，得到7号饲料。

实施例8

将DL-α-(Difluoromethyl)arginine(DL-a-（二氟甲基）精氨酸CAS No： 69955-43-7)按50ppm的剂量加入饲料原料中，混合均匀，得到8号饲料。

实施例9（效果实施例）：

本实施例中所用的实验材料如下：

研究对象：

CSO（Cryptosporidiμm Oocysts隐孢子虫卵囊）由本实验室采样所得，为鸽 源C.baily种，本实验室保存，使用前用清洁级（无特定病原体，Specific pathogen  Free,SPF）小鸡扩增传代，（SPF鸡购于广东大华农清单有限公司，报告编号： 20130216001，品种：BWEL-SPF鸡）。

供试验雏鸡：岭南黄鸡，1日龄，公母兼用，由广东省农科院畜牧所动物实 验中心提供。购买时为1日龄，2日龄开始做实验。

免疫功能正常的禽类，隐孢子虫感染往往是自限性的，2周龄的鸡经口感染 隐子虫卵囊后，产生的免疫反应可将体内的虫体清除，而且几乎完全可以抵抗 再次感染。另外，鸡对隐孢子虫的抵抗力具有年龄依赖性，大龄鸡对隐孢子虫 的易感性较小，表现为潜隐期延长，显露期缩短，症状较轻，饲料转化率和增 重也基本不受影响（戴亚斌等，禽隐孢子虫病，中国禽业导刊[J]，2002,19（24）： 2-4）。所以本试验选择试验动物年龄用刚孵化出来的2日龄雏鸡，首先排除其他 病原体的干扰影响，防止有其他寄生虫的感染，其次，雏鸡的免疫系统不成熟， 感染C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）的效果相对 好很多。

本实施例所采用的试验方法为：将供试验雏鸡分为10组，每组10只。根 据《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》，以推荐的临床用药剂量为基 础，统一对其中9组供试验雏鸡进行人为感染1×10⁶个卵囊/只剂量的隐孢子虫 （雏鸡2日龄时进行拌料喂药，3日龄时进行人为感染贝氏隐孢子虫），余下1 组为空白对照组不感染隐孢子虫。饲养环境用高锰酸钾和氨水熏蒸消毒，各组 雏鸡分别隔离饲养于经火焰喷灯消毒的鸡笼内。在9组感染组中取8组在自由 饮水感染前一天进行药物治疗，余下的感染组作为感染对照组不进行药物治疗。 具体方案如表1所示。

药物治疗具体方法为：以实施例1～8配制的1～8号饲料进行自由采食饲喂， 连续饲喂直到排卵高峰期结束。

其中空白对照组和感染对照组以不加药的饲料原料进行自由采食饲喂和自 由饮水，连续饲喂直到排卵高峰期结束。

表1实验方案表

（1）试验前后饲料平均采食量和各试验雏鸡组平均体重：

实验给药前一天进行分组称重。分别在DPI0，DPI15和DPI25对各试验组 的雏鸡逐只称重、记录，计算平均体重和增重；测量DPI0和DPI15平均采食量。 结果如表2所示：

表2DPI0，DPI15，DPI25时各组雏鸡平均体重和各组平均采食量

表2中“*”为统计学符号：差异显著（P<0.05），本试验运用SPSS软件进 行数据分析。其中n表示每组每次称取鸡的只数。DPI:Days post inoculated接种 卵囊后天数，例如DPI15为接种卵囊后15天；DPI25为接种卵囊后25天。

从表2的数据中可以看到，C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi， 贝氏隐孢子虫）的感染使雏鸡的采食量和体重都呈现下降趋势，4组复方组与感 染对照组相比都有一定程度的增重，复方1组的平均体重最高，不过也都低于 空白对照组。采食量上，C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐 孢子虫）感染对照组明显低于各复方组，复方1组和复方4组最接近空白对照 组。DPI15复方1～4组、西药1～2组与空白对照组差异性显著（P<0.05）；DPI25 复方4组、西药1组、感染对照组与空白对照组差异性显著（P<0.05）。复方1～4 组即实施例1～4制备的添加有中药复方的饲料在一定程度上能改善感染 C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）雏鸡机体的机能， 促使采食量和体重都有所增长。综合比较，中药组中复方3组效果最好，也就 是本发明所要保护的复方组。

（2）感染后粪便卵囊计数：

雏鸡感染后每天收集粪便，并保存于4℃冰箱中，于24h之内检查和计数。 用饱和蔗糖溶液漂浮法检查卵囊。若检查结果表明隐孢子虫为阳性，则称取5g 粪便用30mL自来水稀释，经60目和100目铜筛过滤，滤液3000rpm离心10min， 弃上清，沉淀加15mL饱和蔗糖溶液搅匀，3000rpm离心10min。取饱和蔗糖溶 液和离心的卵囊沉淀混匀，用血细胞计数板计数，平均计算五个大方格取平均 值，计算卵囊数。

经观察，感染对照组临床症状：DPI9-DPI14为C.baileyi（Cryptosporidium  baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）高峰期，表现出呼吸道症状，个别为咳嗽和 啰音，精神状态稍差，不喜动。DPI12-DPI15时各感染组发现粪便中有血样粪便， 个别雏鸡有脱肛现象，感染对照组感染后第12天粪便如附图1所示。DPI15时 各感染组试验雏鸡呼吸道症状减轻，剖检各感染组雏鸡可见气管环粘膜轻度出 血，有粘性分泌物；法氏囊肿大、出血，内有较多粘性分泌物。

对各感染组雏鸡取气管环粘膜分泌物和法氏囊分泌物，经饱和蔗糖溶液漂 浮镜检，法氏囊可见大量隐孢子虫卵囊，气管环卵囊数相对少，附图2为感染 对照组第8天法氏囊400倍镜检照。

连续观察各组雏鸡在第1至15天的排卵囊数，结果如附图3、附图4和附 图5所示。从附图3～5中可看到，贝氏隐孢子虫的潜伏期为4d，高峰期集中在 9-12d。复方1～4组与感染对照组相比，排卵囊数上均有一定程度的降低，特别 是复方3组，卵囊数上有明显的下降趋势。其中机理推测是由于复方3组中药 复方中的川楝子、槟榔、常山、石榴皮等具有的体内驱虫作用，地榆具有凉血 止血清热解毒作用，对机体提高免疫力也有相应的效果。法氏囊是禽类的中枢 免疫器官，可产生B淋巴细胞，从而产生特异性抗体来完成特定的免疫应答。 而法氏囊为C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）的主 要寄生器官之一，雏鸡感染后，可导致免疫抑制和缺陷，一方面破坏机体的免 疫系统，导致雏鸡机体免疫力下降，容易激发其他病原体引起的继发感染，另 一方面，C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）本身的 作用，使雏鸡表现一系列的临床症状。本发明中药复方（即复方3组）的作用 主要从增强机体免疫力和体内驱虫这两方面入手，综合结果起到一定作用。

（3）免疫器官指数：

雏鸡感染贝氏隐孢子虫，于DPI0，DPI15和DPI25，每组随机采样，取其 法氏囊和脾脏分别称其质量，计算法氏囊指数［法氏囊质量(mg)/体重(g)］及 脾脏指数［脾脏质量(mg)/体重(g)］，取平均值。脾脏指数结果如表3所示， 法氏囊指数如表4所示：

表3DPI0，DPI15，DPI25时各组雏鸡脾脏指数

表2中“*”为统计学符号：差异显著（P<0.05），本试验运用SPSS软件进 行数据分析。其中n表示每组选取的鸡的数量。DPI:Days post inoculated接种卵 囊后天数，例如DPI15为接种卵囊后15天；DPI25为接种卵囊后25天。

表4DPI0，DPI15，DPI25时各组雏鸡法氏囊指数

表2中“*”为统计学符号：差异显著（P<0.05），本试验运用SPSS软件进 行数据分析。其中n表示每组选取的鸡的数量。DPI:Days post inoculated接种卵 囊后天数，例如DPI15为接种卵囊后15天；DPI25为接种卵囊后25天。

从表3和表4中的数据可看出，复方1～4组对隐孢子虫卵囊雏鸡的脾脏和 法氏囊发育均有不同程度的作用。复方1～4组在感染前期对雏鸡脾脏发育无明 显促进作用，脾脏指数DPI25中复方3组、感染对照组与空白对照组差异性显 著（P<0.05）；法氏囊指数DPI25中复方4组与空白对照组差异性显著（P<0.05）。 复方2组和西药1组脾脏值跟空白对照组最接近。复方1～4组在感染前期对雏 鸡法氏囊发育均有不同程度的促进作用，由于法氏囊为贝氏隐孢子虫的主要寄 生器官，DPI25时，复方1～4组雏鸡法氏囊指数与空白对照组相比，均表现法 氏囊指数降低。但与感染对照组相比较，除复方2组外，各剂量组均有促进法 氏囊的增长。

免疫器官指数是机体免疫器官生长发育程度的重要指标，一定程度上可以 反映机体的免疫水平（岳道友,赵金凤,李家诚,等.重组鸡$\alpha$干扰素对 雏鸡试验性贝氏隐孢子虫病的治疗效果[J].河南农业大学学报, 2011,45(1):102-106.）。试验结果显示，贝氏隐孢子虫感染雏鸡后，使雏鸡法氏囊 萎缩变小，脾脏病理性增生肿大，通过复方1～4组的拌料喂食，与感染对照组 有对比，均有一定程度的好转。

C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）感染后不同 时期雏鸡脾脏占体重的百分比变化(表3)表明:感染前各组雏鸡脾脏指数无统计 学差异(P>0.05),感染后15、25d感染试验组脾脏占体重的百分比不同程度高于 空白对照组，感染对照组高于其他各试验组。其中，DPI25中复方3组、感染对 照组与空白对照组差异性显著（P<0.05）。可见，感染早期似乎刺激了脾脏的发 育，让脾脏出现一定程度的增生，这与游忠明的试验结果向吻合（游忠明,蒋金 书.贝氏隐孢子虫感染雏鸡免疫器官的形态学观察[J].中国农业科学, 1998,31(4).）。正如感染与抗感染免疫的关系一样,在C.baileyi侵袭过程中，雏鸡 脾脏对C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）感染的免 疫组织学反应与C.baileyi（Cryptosporidium baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫） 感染对雏鸡脾脏的免疫组织学损害相伴发生。感染早期在造成一定的免疫组织 学损害的同时，刺激了雏鸡脾脏的发育，引起了一定程度的免疫组织学反应， 导致感染组脾脏增重。另外，感染前各组雏鸡脾脏指数无统计学差异(P>0.05)， 感染后15d、25d感染试验组法氏囊占体重的百分比低于空白对照组，除DPI25 复方2组外，感染对照组法氏囊指数均低于其他各实验组，DPI25复方4组与空 白对照组呈差异性显著（p>0.05），可见感染后1～25d C.baileyi（Cryptosporidium  baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）对法氏囊的正常发育产生了明显的抑制作用， 这与游忠明的报告相悖，与岳道友研究的结论相同（岳道友,赵金凤,李家诚,等. 重组鸡$\alpha$干扰素对雏鸡试验性贝氏隐孢子虫病的治疗效果[J].河南农业 大学学报,2011,45(1):102-106.）。

（4）切片病理变化：

根据感染雏鸡试验排卵囊规律，得出在DPI15左右时候为排卵囊高峰末期， 此时贝氏隐孢子虫对免疫器官的侵害最大，故取DPI15时候的气管环和法氏囊 组织做组织切片，观察病理变化。

切片制作的具体步骤如下：

①取材及固定：取新鲜法氏囊组织、气管环组织，10%甲醛溶液固定；

②冲洗：固定后的组织块在进行脱水前须用流水洗去固定液，甲醛固定液 固定的组织一般水洗6小时以上，也可水洗过夜；

③脱水：透明及浸蜡常用不同浓度的酒精脱水，所用的酒精浓度及过程如 下：70%（一夜）——80%（2小时）——90%（1小时）——95%（1小时）— —100%(Ⅰ)（30分钟）——100%(Ⅱ)（15分钟）——二甲苯（15分钟）——二 甲苯（10分钟）——石蜡（2～2.5小时）

④包埋：包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂（石蜡）中，并做 好编号标记；

⑤切片：在蜡块成型后进行切片；

⑥展片和粘片：切片厚度4μm，42℃的温水进行展片，等到蜡片充分展 平后捞取蜡片，置45℃烘片机烘干，然后即可进行染色；

⑦染色和封固：染色采用HE（苏木素-伊红）染色，过程如下：

取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右，脱完蜡后 的切片即可进行染色，具体染色过程和时间如下：（1）100％酒精2～5min，（2） 95％酒精2～5min，（3）90％酒精2～5min，（4）80％酒精2～5min，（5）70％ 酒精2～5min，（6）蒸馏水洗1～2min，（7）苏木素染液10～20min，（8）普通 水洗1min，（9）盐酸酒精分化数秒，（10）自来水冲洗30min，（11）70％酒精2～ 5min，（12）80％酒精2～5min，（13）95％酒精2～5min，（14）伊红染色20s， （15）无水酒精Ⅰ3min，（16）无水酒精Ⅱ3min，（17）无水酒精加等量二甲苯 2min，（18）二甲苯数分钟到透明为止，（19）自二甲苯中取出切片，放在格板 内，滴少量的树胶于组织片中央，（20）取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近 载玻片，然后迅速放下盖玻片，树胶即迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向。 将封好的切片放置在恒温箱中干燥。

最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组 织切片的名称、染色方法、固定方法及年月日。

观察结果如附图6至附图25所示。从附图6至附图25可看到，除了空白 对照组，其他各感染试验组法氏囊和气管环均受到不同程度损失，感染对照组 表现严重。

感染对照组气管环环粘膜脱落严重，粘膜表层的上皮发生萎缩，微绒毛几 乎没有，只剩下很薄的一层，且有炎性细胞浸润现象。空白对照组气管环环内 部粘膜完整，厚度均匀，粘膜表层的微绒毛排列整齐，无炎性细胞浸润。复方 1～4组均有不同程度的病理变化，严重的是复方2组和复方4组，粘膜表层部分 脱落，呈现不规则的波浪状。复方3组和复方4组气管环表面粘膜相对完整， 微绒毛基本还在，复方1组气管环薄厚不均匀，表面粘膜呈古城墙状，复方4 组也是残缺不全。西药1～2组病理变化严重，粘膜层出现脱落，呈现古城墙状。 西药3～4组相对表现的不明显。

从法氏囊切片图可看到，复方1～4组相对西药1～4组效果要好。感染对照 组法氏囊切片样可看到，400倍下法氏囊表面粘膜附着着许多隐孢子虫，局部上 皮因细胞增生而变厚，另一部分上皮则发生萎缩；因而上皮高低不平，呈不规 则波浪状，进而演变成凸起与下凹交替的古城墙状；上皮下方可见巨噬细胞。 间质结缔组织增生，部分结缔组织进入滤泡，把滤泡分割；血管充血出血，部 分血管出现透明血栓。

综上所述，中药治疗效果相对优于西药，推测跟西药的耐药性使用有关， 并且西药的使用会加重免疫器官的伤害，使病理表现更明显，复方3组和西药4 组病理变化最微弱，侧面反应了治疗效果最优。

本实施例是通过多个试验指标对4种复方中药进行评价，其中雏鸡体重变 化和采食量、法氏囊和气管检测贝氏隐孢子虫卵囊数、组织切片病理变化三个 指标表示复方3组效果优于其他复方组，免疫器官指数指标数据分析表现不显 著，不过有一定的治疗趋向。

本实施例通过四种中药复方和四种西药分别对C.baileyi（Cryptosporidium  baileyi，C.baileyi，贝氏隐孢子虫）的感染模型进行治疗试验，摸索其治疗有效 药物，分别从雏鸡不同时期采食量和增重量、临床症状症状观察和排卵囊规律、 免疫指标、病理切片等方面进行观察，综合发现，各组药物都有一定的作用， 其中复方3组即本发明的中药复方综合表现最优，排卵囊数和采食量增重量上 都有明显好转，西药组中西药4组综合表现最优。

西药组4种药物均在隐孢子虫的酶活性试验和体外细胞培养试验中有所研 究，均表现出一定的治疗效果，本次试验取这4种西药进行机体体内治疗效果 研究，一方面是回归动物实验评价药物治疗效果，一方面也是对复方中药效果 的的对比评价。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。