亚洲玉米螟OfGSTe1基因及其编码蛋白和OfGSTe1基因RNAi干扰菌株构建

摘要

亚洲玉米螟OfGSTe1基因及其编码蛋白和OfGSTe1基因RNAi干扰菌株构建，它涉及玉米螟OfGSTe1基因片段及其RNAi干扰载体，本发明提供的是亚洲玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶的部分cDNA序列及其RNAi干扰载体工程菌株构建，目的为降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的耐受性，减少田间高效氯氰菊酯的使用量。本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因序列如序列表SeqIDNo：1所示。本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo：3所示。本发明构建出OfGSTe1基因RNAi干扰菌株，降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的耐受性，满足绿色农业、安全农业的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及玉米螟OfGSTe1基因片段及其编码蛋白和RNAi干扰载体。以及干扰工程菌产物dsRNA对高效氯氰菊酯的增效作用。

背景技术

亚洲玉米螟分布广泛，分布于在我国华北、东北、西北地区等粮食产区。据推测，春玉米受玉米螟危害减产量达7-10%，夏玉米减产达15%左右。在东北，玉米螟的危害尤其严重。据统计2011年，齐齐哈尔玉米螟发生面积为79.84万hm²，占全市玉米播种面积的72.58%，造成玉米产量损失8.4万吨。同时亚洲玉米螟的危害也显著加重了玉米病害的发生。

谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferase,GSTs,EC2.5.1.18）是一个古老的酶家族，催化还原性谷胱甘肽与多种亲电子物质反应，通过增加产物的可溶性，并加速其外排，以保护生命体。作为昆虫体内一类重要的保护酶系，GST参与昆虫对不利环境的适应过程。目前大量的研究揭示在昆虫体内，GST蛋白参与昆虫体内农药解毒代谢并与昆虫抗药性密切相关。GST基因在昆虫分解代谢拟除虫菊酯和有机磷类杀虫剂过程中其重要作用。

高效氯氰菊是菊酯类农药的一种。主要用于对鳞翅目害虫的防治。目前运用于高效氯氰菊酯是亚洲玉米螟防治的主要农药品种之一。目前在昆虫防治中，最低剂量的使用杀虫剂已成为绿色农业、安全农业的要求之一。

发明内容

本发明提供的是亚洲玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶的部分cDNA序列及其RNAi干扰载体工程菌株构建，目的为降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的耐受性，减少田间高效氯氰菊酯的使用量，为绿色农业和昆虫防治提供一条新的途径。

本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：1所示。

本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo：3所示。

本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的构建，其特征在于它的构建方法如下：

一、OfGSTe1基因克隆

以由亚洲玉米螟三龄幼虫总RNA反转录而成的cDNA为模板，通过如下引物，进行PCR扩增：

P1，5’-CAAAATCGACGCCAGCC-3’；

P2，5’-TGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

回收纯化PCR产物，即得OfGSTe1基因；

二、OfGSTe1基因RNAi干扰载体的构建

以步骤一得到的OfGSTe1基因为模板，通过以下引物，进行PCR扩增：

RNAiE1-P1：5’-TCGCTGCAGTCGAGGCAATGTGTATTCAGT-3’；

RNAiE1-P2：5’-GACAAGCTTTGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

纯化回收PCR产物，利用PstⅠ和HindⅢ对回收后的PCR产物和L4440载体进行双酶切，连接并构建RNAi干扰载体L4440-OfGSTe1；

三、OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的构建

将步骤二构建出的RNAi干扰载体L4440-OfGSTe1导入大肠杆菌HT115中，即完成亚洲玉米螟OfGSTe1基因RNAi干扰菌株构建。

本发明包含以下有益效果：

本发明克隆得到了亚洲玉米螟GSTe1基因的部分编码区，并利用操作简单、成本低廉的自然饲喂RNAi干扰技术，探索了新的杀虫技术。不仅有可用于研究亚洲玉米螟GSTe1基因功能对高效氯氰菊酯的相互作用，还可用于降低田间高效氯氰菊酯的使用量，达到绿色、环保农业的目的。

本发明通过重组工程菌株，构建出OfGSTe1基因RNAi干扰菌株，产生的dsRNA片段降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的解毒作用，降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的耐受性，从而降低田间高效氯氰菊酯的使用量，满足绿色农业、安全农业的要求。

附图说明

图1亚洲玉米螟幼虫各龄期OfGSTe1基因表达情况的电泳图；其中1为一龄期的电泳图，2为二龄期的电泳图，3为三龄期的电泳图，4为四龄期的电泳图，5为五龄期的电泳图；

图2为亚洲玉米螟三龄幼虫对茉莉酸甲酯诱导的植物抗性取食响应过程中OfGSTe1基因的表达情况的电泳图；其中1为OfGSTe1基因未诱导表达的电泳图；2为OfGSTe1基因诱导的电泳图；

图3为干扰载体L4440-OfGSTe1的电泳图；其中M为DL2000，1为干扰载体L4440-OfGSTe1的电泳图；

图4为干扰载体L4440-OfGSTe1经双酶切验证的电泳图；其中M为DL5000，1为干扰载体L4440-OfGSTe1双酶切后的电泳图；

图5为阳性克隆子HT115-OfGSTe1的PCR验证的电泳图，M为DL2000，1-6均为阳性克隆子HT115-OfGSTe1的PCR扩增电泳图；

图6为低致死量高效氯酸菊酯饲喂试验柱状图；其中，1为去离子水组柱状图；2为HT115-OfGSTe1组柱状图，3为高效氯氰菊酯柱状图；4为L4440+高效氯酸菊酯组柱状图；5为HT115-OfGSTe1组+高效氯酸菊酯组柱状图；

图7为低致死量溴虫腈喂试验柱状图；其中，1为去离子水组柱状图；2为HT115-OfGSTe1组柱状图，3为溴虫腈组柱状图；4为L4440+溴虫腈组柱状图；5为HT115-OfGSTe1组+溴虫腈组柱状图；

图8为低致死量氯虫腈喂试验柱状图；其中，1为去离子水组柱状图；2为HT115-OfGSTe1组柱状图，3为氯虫腈组柱状图；4为L4440+氯虫腈组柱状图；5为HT115-OfGSTe1组+氯虫腈组柱状图；

图9为低致死量丁醚脲喂试验柱状图；其中，1为HT115-OfGSTe1组柱状图，2为丁醚脲组柱状图；3为L4440+丁醚脲组柱状图；4为HT115-OfGSTe1组+丁醚脲组柱状图；

图10为Ht115-OfGSTe1RNAi干扰工程菌干扰效果RT-PCR验证电泳图；1为高效氯氰菊酯的干扰效果RT-PCR验证电泳图；2为溴虫腈的干扰效果RT-PCR验证电泳图；3为氯虫腈的干扰效果RT-PCR验证电泳图；4为丁醚脲的干扰效果RT-PCR验证电泳图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的亚洲玉米螟OfGSTe1基因的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：1所示。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：亚洲玉米螟OfGSTe1基因的RNAi干扰DNA片段的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：2所示。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式的亚洲玉米螟OfGSTe1基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo：3所示。

具体实施方式四：本实施方式的亚洲玉米螟OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的构建方法如下：

一、OfGSTe1基因克隆

以由亚洲玉米螟三龄幼虫总RNA反转录而成的cDNA为模板，通过如下引物，进行PCR扩增：

P1，5’-CAAAATCGACGCCAGCC-3’；

P2，5’-TGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

回收纯化PCR产物，即得OfGSTe1基因；

二、OfGSTe1基因RNAi干扰载体的构建

以步骤一得到的OfGSTe1基因为模板，通过以下引物，进行PCR扩增：

RNAiE1-P1：5’-TCGCTGCAGTCGAGGCAATGTGTATTCAGT-3’；

RNAiE1-P2：5’-GACAAGCTTTGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

纯化回收PCR产物，利用PstⅠ和HindⅢ对回收后的PCR产物和L4440载体进行双酶切，连接并构建RNAi干扰载体L4440-OfGSTe1；

三、OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的构建

将步骤二构建出的RNAi干扰载体L4440-OfGSTe1导入大肠杆菌HT115中，即完成亚洲玉米螟OfGSTe1基因RNAi干扰菌株构建。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中所述的PCR反应条件如下：

PCR反应体系为：

PCR程序如下：94℃预变性10min，94℃变性1min，55.8℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。其它与具体实施方式四相同。

本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因及其编码蛋白和OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的构建方法，具体操作方法如下：

1、OfGSTe1基因克隆

依据欧洲玉米螟的cDNA文库为模板，设计引物如下：

P1，5’-CAAAATCGACGCCAGCC-3’；

P2，5’-TGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

以由亚洲玉米螟三龄幼虫总RNA利用反转录试剂盒反转录成的cDNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增的反应体系为50μL，反应体系由下列成分组成：

PCR程序如下：94℃预变性10min，94℃变性1min，55.8℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保存；

对PCR产物进行胶回收后，与pMD18-T载体（市售）连接，得pMD18-T-OfGSTe1载体，然后将其转入DH5α（市售）中，将验证为阳性的克隆送于上海生工公司测序，得OfGSTe1基因，OfGSTe1基因的序列如SeqIDNo：1所示，OfGSTe1基因的cDNA片段共计615bp，与预期一致；保守结构域分析表明此基因片段包括GST基因的N端和C端保守结构域，Blast分析表明此基因片段的阅读框为+2，共编码204个氨基酸，OfGSTe1基因表达的氨基酸序列如SeqIDNo：3所示。

2、亚洲玉米螟幼虫不同虫龄阶段的OfGSTe1表达特异性分析

分别提取亚洲玉米螟幼虫各时期中整虫的总RNA及取食正常玉米叶片的亚洲玉米螟中肠的总RNA和取食经茉莉酸诱导亚洲玉米螟三龄幼虫中肠的总RNA，分别进行半定量PCR反应，每个样品设三次重复，检测OfGSTe1基因表达情况（结果如图1和图2所示）。

通过图1可以得出，在不同虫龄的亚洲玉米螟幼虫中，OfGSTe1基因表达水平随着虫龄的增长而增长。由图2可以得知，亚洲玉米螟OfGSTe1基因在植物取食响应中上调表达。

3、OfGSTe1干扰菌株的构建

使用NCBI在线blast比对，依据OfGSTe1基因的非保守区设计引物，设计引物如下：

RNAiE1-P1：5’-TCGCTGCAGTCGAGGCAATGTGTATTCAGT-3’；

RNAiE1-P2：5’-GACAAGCTTTGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

其中，RNAiE1-P1引物中下划线表示PstⅠ酶切位点；RNAiE1-P2引物中下划线表示HindⅢ酶切位点。使用上述实验中获得的pMD-18T-OfGSTe1载体，经过稀释的纯化后作为模板进行PCR扩增，纯化PCR产物，得亚洲玉米螟OfGSTe1基因的RNAi干扰DNA片段，其核苷酸序列如序列表SeqIDNo：2所示；将纯化后的PCR产物与L4440载体（源自农科院植保所）分别采用HindⅢ和PstⅠ进行酶切，将酶切产物与L4440载体相连，即得干扰载体L4440-OfGSTe1；

将干扰载体L4440-OfGSTe1转入大肠杆菌HT115感受态细胞（源自农科院植保所）中，经过Tet,Amp抗性平板筛选后，挑选阳性克隆子，使用T7引物经PCR验证（见图5所示）（PCR程序如下：94℃预变性10min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保存），同时提取重组质粒进行HindⅢ和PstⅠ双酶切验证后（见图4所示），将阳性克隆子送往上海生工公司测序，经测序后验证含有阳性克隆OfGSTe1重组工程菌株，即为重组工程菌株HT115-L4440-OfGSTe1，并保存备用；

其中，T7引物序列如下：

T7p1：5′-TAA GTT GGG TAA CGC GAG GGT TTT CCC AGT GAC-3′；

T7p2：5′-GGC CAG TGA ATT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CG-3′；

所述的获得亚洲玉米螟OfGSTe1基因的RNAi干扰DNA片段的PCR扩增的反应体系为50μL，反应体系由下列成分组成：

PCR程序如下：94℃预变性10min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保存。

通过以下试验验证本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因及其编码蛋白和OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的相关性能，具体操作如下：

1、dsRNA的诱导表达

使用ITPG诱导HT115-OfGSTe1RNAi干扰工程菌产生dsDNA；具体诱导方法如下：

一、将上步得到的HT115-OfGSTe1RNAi干扰工程菌在2×YT培养基中（2×YT培养基中含有0.1mg/mL的Amp和25μg/mL的Tet），在温度为37℃，转速为220rpm的条件下培养至OD595为0.5，向100mL的2×YT培养基内加入IPTG，使IPTG终浓度达到0.15mmol/L后，在温度为30℃的条件下进行dsRNA诱导表达4h；

二、将步骤一诱导表达后的菌液在转速为5000rpm、温度为4℃的条件下，离心10min，去上清，收集菌体，按照ddH₂O：培养基体积比为1:50的比例加入Rnase-freeddH₂O，然后进行超声破碎，在转速为10000rpm、温度为4℃的条件下，离心10min，收集上清，向上清液中加入氯仿：异戊醇，其中，氯仿：异戊醇与上清的体积比为1:1，氯仿：异戊醇的体积比为24:1，反复混合，然后在转速为12000rpm、温度为4℃的条件下离心20min，吸取上清，将上清与异丙醇按体积比为1:1的比例混合，在-20℃温度下放置30min后，在转速为12000rpm、温度为4℃的条件下离心10min，收取沉淀放于1mLddH₂O中。加无水乙醇20mL至乙醇终浓度为75%，在-20℃温度下放置过夜后，在转速为12000rpm、温度为4℃的条件下离心10min，收集沉淀，按照Rnase-freeddH₂O：培养基的体积比为1:50的比例加入Rnase-freeddH₂O，得诱导表达的dsRNA溶液。

2、dsRNA对几种农药的增效作用

挑选生长一致的亚洲玉米螟三龄幼虫饥饿过夜后，分别进行亚致死量高效氯酸菊酯、溴虫腈、丁醚脲和氯虫腈自然饲喂试验，检测OfGSTe1基因农药的降解作用，将上述得到的dsRNA溶液按浓度为0.3mL/g（菌液/饲料）加到切碎烘干的人工饲料（周大荣所公开的玉米螟专业饲料，可通过购买得到）中，对下述五组亚洲玉米螟三龄幼虫进行饲喂取食；

将亚洲玉米螟三龄幼虫进行单头饲养实验，共分为五组，每组为20头亚洲玉米螟三龄幼虫，具体分组如下：ddH₂O组、HT115-OfGSTe1组（干扰组）、农药组、L4440+农药组和HT115-OfGSTe1+农药组。

以自然饲喂取食法对上述5组进行不同农药的RNAi效果检测，检测结果如图6至图9所示。由图6至图9发现取食高效氯酸菊酯组的亚洲玉米螟死亡率明显高于其他（P<0.05）。初步证明了OfGSTe1在昆虫中可能具有抗逆功能。

采用上述饲料饲喂24小时后，统计各组亚洲玉米螟幼虫死亡率，使用excel软件绘图，并进行统计分析。同时提取ddH₂O组、农药组、HT115-OfGSTe1组亚洲玉米螟幼虫总RNA，以检测干扰效率，结果如图10所示。由图10可知，通过对干扰组和农药组及ddH₂O组个条带的分析发现，干扰组中OfGSTe1的表达情况明显低于其他两组。这表明我们构建的干扰载体成功干扰亚洲玉米螟幼虫OfGSTe1基因的表达。同时，在高效氯氰菊酯和氯虫腈处理中，OfGSTe1基因在干扰组和农药组的表达都高于其他几种农药。