通过使用半抗体生物传感器形成稳态环用于检测和调节血管内皮生长因子(VEGF)的方法和装置

摘要

用于检测血管内皮生长因子（VEGF）杂交的生物传感器使用并联电容器的阵列来检测循环的VEGF与固定的VEGF单克隆半抗体（a-VEGF mhAb）的电化学结合。结合a-VEGF mhAb可调节电路的阈值电压，从而改变所述电路的阻抗。涂敷有p-Si底物的电极可增强所述VEGF分子之间的亲和力。流体单元送递VEGF样品到所述芯片的活性表面上。以互相交叉模式排列的并联电容器的阵列可检测所述流体中的VEGF。所述检测器提供精确测量的和可计量速率的体内VEGF分子的变化，提供用于测量所述肿瘤对送递的化学治疗剂和生物反应调节剂（BRM）的反应的实时反馈，目的是确定肿瘤负荷和化学治疗的效力，作为治疗的稳态环的一部分。

说明书

技术领域

本发明涉及化学生物传感器，或者更具体地涉及固定并联板化学生 物传感器和电容阵列，以及使用固定的单克隆半抗体制造它们的方法。

背景技术

在正常生理发育中，VEGF是胚胎发生（血管生成（vasculogenesis）） 和成体血管形成（血管发生（angiogenesis））中血管发育的关键调节物。 VEGF和VEGF-受体蛋白家族的成员具有不同、但重叠的配体-受体特异 性、细胞类型表达和功能。VEGF-受体活化反过来又可调节身体中促进 内皮细胞生长、迁移和存活的信号传递过程网络。VEGF还在发生于多 种疾病（包括癌症）的病理性血管发生中起关键作用。VEGF和 Flk-1/KDR RTK已被认为是病理性血管发生（包括肿瘤新血管形成）所 需的关键的内皮细胞-特异性因子信号传递通路。在肿瘤发展中，激活 VEGF通路可促进肿瘤血管形成、加速肿瘤生长和转移。异常VEGF功 能还与包括动脉粥样硬化、银屑病、年龄相关性黄斑变性、糖尿病失明、 类风湿性关节炎和甲状腺功能亢进的其他疾病相关。

对血管发生的生物学理解的进展已经导致开发了数种治疗形式，用 于抑制VEGF酪氨酸激酶信号传递通路。在正在生长的肿瘤中，抑制 VEGF酪氨酸激酶信号传递通路可阻断新血管形成，导致肿瘤生长停滞 或消退。人肿瘤的生长和转移的发生依赖于血管的从新形成，以实现低 氧肿瘤微环境并向其提供养分。新血管形成受到靶向受体酪氨酸激酶 （RTK）的特异性生长因子的严格调控。通过使用人源化单克隆抗体贝 伐单抗（bevacizumab）（Genentech/Roche）以及靶向VEGF 受体（VEGF-R）酪氨酸激酶的两种激酶抑制剂索拉非尼（sorafenib, Nexavar;Bayer）和舒尼替尼（sunitinib,Sutent,Pfizer）阻断VEGF的 初步努力开始在人癌症患者中显示出希望，这凸显了优化VEGF阻断对 神经系统癌症的重要性。许多的这些形式正在临床研究中被调查以评价 它们治疗多种形式的人癌症的可能性，但这类研究的能力受限于这样的 事实，即不容易进行VEGF水平和VEGF转导趋向的局部实时体内测量。

已知可连续监测其周围环境以提供背景统计并对不健康状态提出警 示的生物传感器被用于医学技术中。在本申请中，寻求微量溶液以使所 述生物传感器的成本和影响最小，并使其使用寿命最大。在治疗持续期 间由于监控肿瘤生长和消除过程的内在需求，使用一次性使用的生物传 感器具有局限性。

现有技术对“生物传感器”主题的讨论是广泛和深远的。有许多生 物传感器的实例（例如重量分析生物传感器（gravimetric biosensor））。 检测基础是当各种分析物连接至共振元件时发生的共振器共振频率降 低。生物分析物的分析物特异性是通过用配体功能化（处理）所述共振 器的暴露表面而被赋予的，所述配体可识别并结合所述靶分析物。靶生 物分析物的合适结合实体的实例包括抗体、受体、凝集素、适体和寡核 苷酸。

现有技术中存在的一种类型的生物传感器是重量分析生物传感器， 其中固定的结合基团位于膜表面上的一个或多个区域。所述固定的结合 基团的位置、大小、区域和固定密度被设计为，使观察到的由所述靶分 析物结合引起的所述膜频率和/或幅度的改变最大化。这继而使通过随后 基于特异性和非特异性结合的所有组合的所述膜频率和/或幅度改变而 可观察到的区别最大化。该区别可以采取三种形式：（a）所述膜共振频 率的变化，（b）较高阶谐振的出现或消失，或者（c）振幅衰变率的变化。 在这类生物传感器中，单个的膜可以由多个用于驱动和用于传感目的的 可单独寻址元件组成。这使得可特异性激活所选择的较高阶振动模式并 且能够同时振动驱动警报电路或类似装置。声波分析——其可用于重量 分析传感器——的原理是公知的，其在文献中已经出现十年以上。

分子相互作用可以通过生物大分子的极化率而用电子方法检测，通 过使用荧光标签而用光学方法检测，通过使用放射性标记的标签而用放 射测量法检测，或者用声学方法检测。最近，基于MEMS的传感器已被 纳入生物技术和生物医学领域。声学生物传感器的应用包括细胞检测、 葡萄糖生物传感、抗体-抗原识别和蛋白质吸附检测。

20世纪50年代后期以来，压电石英晶体微天平（QCM）已经被用 于检测气相和液相分析物。QCM技术在最近被应用于生物分析物。QCM 已被用于跟踪蛋白质对未修饰的和修饰的石英晶体表面电极的非特异性 吸附。将抗体固定于所述晶体表面可赋予分析物以特异性。

需要一种装置，其具有的结构可用于构建用于无标记检测VEGF 杂交的固态生物传感器。

发明内容

提供如下本发明所列举的实施方案概要以帮助理解本发明特有的 一些创新特征，但不是意欲进行全面描述。可以通过将整个说明书、 权利要求书、附图和摘要作为一个整体而获得对本发明各个方面的全 面了解。对本领域普通技术人员来说，一旦阅读本说明书，本发明的 其他目标和优点就会明显。

本发明列举的实施方案的内容涉及通过使用固态制造技术的集成 平台连同与被称为人源化单克隆抗体的蛋白元件（被选择用于以高亲 和性力结合特定特异性靶蛋白靶标）的集成平台构建的生物传感器。 具体地，从转移区域取得的肿瘤流体中发现的VEGF分子和固定的 a-VEGF mhAb之间的杂交改变了传感器电极的电化学性质，这种改变 可通过所述装置的电路来检测。本发明列举的实施方案的目标是通过 测量VEGF分子与所述电容器极板的结合率而将肿瘤发生的生长速率 与所述肿瘤流体中的VEGF水平相关联，并用所述VEGF传感的向量 /趋势计划所述化学疗法的过程。所述电容器极板以互相交叉模式 （interdigitated pattern）排列以使给定传感器体积的检测表面积最大 化。

可精确提供对VEGF水平的实时反馈的植入体内装置对于任何精 细调节的抗血管发生治疗是至关重要的，使得系统可被逻辑地调节， 并减少或改变抗血管发生试剂的摄入。本发明列举的实施方案通过在 已知时间范围内模拟VEGF结合到VEGF单克隆抗体的过程来测量 VEGF水平，并提供适合的VEGF水平反馈，用于受调节的药物和化 学疗法反馈回路。

呈现了所提出的VEGF检测器的制造，使用了技术和设备中所取 得的显著改进用于制造微型装置，并因此概述了微机械设备的使用。 硅制造和高精机械的改进开辟了用于研究和开发应用的现称为微电子 机械系统（MEMS）的领域。随后开发的微型阀、泵、槽和热交换器 使得可操作极其小的流体体积。与集成电路（IC）和MEMS领域中改 善的大规模制造技术相结合，微流体和微化学系统被应用于实现本发明 列举的实施方案。

本发明列举的实施方案包括具有可在单个流体样品上操作的多个装 置的协同且可变通的传感器系统。所述装置可以借助板载处理逻辑块进 行全自动化学分析。

所述列举的实施方案包括一种具有如下结构的装置，所述结构可用 于构建用于无标记检测VEGF杂交的固态生物传感器。这个装置是通过 以下方式实现：形成以互相交叉模式排列的并联电容器的矩阵阵列，以 达到对于最小电化学变化的高比值信号，并伴随电等值，从而可实现低 成本、便携、完全集成的装置。

用于检测兴趣分子存在的生物传感器可应用于多个领域，包括医学 诊断、生物医学研究以及生物和化学战争中所用试剂的检测。存在对具 有高敏感性的廉价、袖珍传感器的需求，所述传感器用于实时地在体内、 无标记环境中检测VEGF分子，目的是报告状态例如浓度水平的趋势， 并进一步使得可以形成闭合反馈回路以使用药物有效地调节（减弱、改 变）所述生物活性。

一般而言，生物靶复合体由可通过催化表面增强底物（例如单克隆 抗体）形成的种子物质加上标签。然后，所述靶复合体可以结合至包括 有VEGF标记物的捕获剂。然后，通过还原固定的捕获分子例如VEGF 单克隆半抗体（a-VEGF mhAb）而在所述种子物质上生成所述底物。

因此，在一个实施方案中，提供了一种生物靶复合体，其包括与第 一特异性结合成员缔合的靶分析物。所述靶复合体进一步包括与所述第 一特异性结合成员结合形成靶复合体的第二特异性结合成员。所述第二 特异性结合成员包括适用于催化表面增强的a-VEGF mhAb底物形成的 种子颗粒（seed particle）。在另一个实施方案中，适于结合任何已知的 癌症标志物的任何种子颗粒都可使用本公开的方法被附着到所述靶复合 体上。随后，所述复合体底物可以借助所述电子电路而活化，以提供所 必需的阻抗效应变化。这些重要目标和其他重要目标根据如下对本发明 的描述将变得明显。

本发明的一个实施方案的目的是提供流体电池，所述流体电池被 配置以使VEGF样品可在芯片的活性表面流动。流体流过所述传感器 的速率是受控制的，使得可以实现VEGF分子在所述流体中与所述固 定的a-VEGF mhAb的杂交和去杂交。详细计算所述杂交能量是去杂 交并洗去所述VEGF分子以使所述传感器可重复用于进一步检测的计 划的一部分。

所述装置还需要通过使用基于适于结合VEGF单克隆抗体的电化 学结合机制来检测所述VEGF分子的存在。当血液或肿瘤流体流过所述 生物传感器时，漂浮的VEGF抗原将被所述表面固定的VEGF半抗体捕 获，其中所述半抗体的抗原结合位点（称为Fab）特异性结合到所述抗 原的表位位点。所述结合是由下述力的组合驱动和决定的：静电键、氢 键、范德华力、疏水力和芳香π键。

在具体的进一步开发中，本发明中至少一个实施方案的方法有利地 利用电化学检测的方法，特别是将氧化还原循环与单克隆抗体标记物结 合以产生半抗体。连接a-VEGF mAb的两条重链的二硫键可被选择性地 切割以产生两个a-VEGF mhAb，所述a-VEGF mhAb具有完整的结合位 点和反应性巯基并可以以位点特异的方式共轭结合到VEGF。

由单个VEGF mAb产生两个半抗体的目的是降低所述固定的 a-VEGF mhAb的Fab和VEGF之间的结合亲和力水平。该结合亲和力 水平小于报道的VEGF与a-VEGF mAb键之间的结合亲和力水平（Kd= 3.4±0.9nM）。

本发明进一步的目的是利用a-VEGF mhAb半抗体分子，因为 a-VEGF mhAb和VEGF结合亲和力低于所述生物传感器表面形成中所 产生的所有其他键的结合亲和力。因为aVEGF mhAb和VEGF之间的 键的亲和力具有高特异性但是其亲和力弱于本发明中呈现的其他键，所 以所述VEGF分子可从它们与aVEGF mhAb分子的键“释放”以使得 所述生物传感器表面可被重复使用多次。该“释放”是通过在所述生物 传感器板上引入小的电流以提供能源，并通过本发明公开的压电微流体 泵产生的流体流而产生的。

另一项开发是制备具有马来酰亚胺封端的自组装单层（SAM）的硅 表面，使得所述a-VEGF mhAb可直接结合到该表面并且以方向特异的 方式固定到所述SiO2表面。该化学反应将保持所述a-VEGF mhAb的抗 原结合位点朝向外部。所述a-VEGF mhAb在所述底物上的涂敷密度将 通过制备过程中hAb的浓度确定。

本发明的一个实施方案的目的是产生具有电极性的传感器，目的是 自然地吸引VEGF分子本身带的负电荷，同时进一步调整所述电路的阈 电压。所述新的传感器应该用优选涂敷有p-Si底物的绝缘电极构建，以 帮助将所述VEGF分子带到所述电极的表面并增强所述VEGF分子和抗 体之间的亲和力。本发明的另一个目的是能够反转所述电极性，目的是 从所述固定的a-VEGF mhAb排斥并释放VEGF。所述电极性产生的力 使得它可以克服VEGF与a-VEGF mhAb之间由于静电键、氢键、范德 华力、疏水作用力和芳香π键的结合，但小于多种连接分子之间的共价 键。

本发明实施方案之一的另一个目的是一种具有并联电极阵列的装 置，所述并联电极阵列以互相交叉模式排列，以最大化VEGF杂交的表 面面积并提高检测敏感度。

本发明的多个实施方案涉及用于多重生物测定的信号放大方法，所 述方法使用至少一个装置来监测所述芯片的矩阵阵列位置上的VEGF分 子杂交。所述装置应装配有计算装置，目的是在所述时间范围内提供传 感输出，从而检测、报告并形成稳态环以指导医药剂的治疗性介入。所 述装置周期性地测量、储存并报告传感输出电值，所述电值与VEGF分 子和固定的a-VEGF mhAb的杂交有关。

本发明的一个实施方案是体内检测VEGF分子，这不仅提供了肿瘤 负荷的当前状态信息，而且VEGF分子随时间的趋势可用于反映化学治 疗剂和生物学反应调节剂（BRM）的效力，用于肿瘤负荷降低和消除的 目的。

本发明一个实施方案的一个目标是通过无线电设备实时监测与肿瘤 负荷的当前状态信息相关的VEGF检测传感输出。所述装置应装配有被 批准用于经皮无线电频率（RF）通信的医学植入式通信服务（MICS） 无线电设备。

本发明的另一个实施方案是用泵控制所述VEGF分子在所述芯片的 矩阵阵列位置上的杂交。在本发明至少一个实施方案的排列上存在至少 一个用于控制液体流速的装置及相关控制装置。为此具体目的，在至少 一个实施方案中，所述传感器芯片被连接到包括精密泵的微流体系统。 所述液体流控制的一个具体能力是允许在检测完成后将所述去杂交的 VEGF分子从所述电极冲掉，这使得所述传感器可重复使用。

附图说明

附图——其中同样的参考数字在所有各个视图中是指相同或功能 相似的元件并且其被纳入说明书中并形成说明书的一部分——进一步 举例说明本发明，并且与具体实施方式一起用于解释本发明的原理。

图1是所述装置的正投影截面图，含所述电子检测模块的示意图。

图1A是本发明一个实施方案的电学示意图，描绘来自所述电容器 阵列的等效电极-电解质节点的一个单元。

图2是VEGF检测器的电容排列的横截面等轴视图。

图2A是电容VEGF传感器的正投影俯视图。

图3描绘了带有组成型杂交元件的VEGF传感器。

图3A描绘了被VEGF单克隆半抗体（a-VEGF mhAb）功能化之前 的马来酰亚胺封端的SAM。

图3B示出了将VEGF单克隆抗体（a-VEGF mAb）分裂成两个半 抗体的选择性还原过程。

图3C示出了包括马来酰亚胺-巯基共轭以产生a-VEGF mhAb功能 化的SiO₂底物的自发反应。

图4是所述生物传感器电容器阵列的横截面图，其矩阵阵列设计包 括包围腔（chamber containment）。

图4A为所述电容器矩阵阵列的示意图，其描绘了所述等效电路。

图5示出了配置在送递装置框图内的VEGF检测器的设计。

图5A是优选实施方案的示意性框图——生物传感器被纳入作为检 测、分析和报告系统的一部分。

图5B是使用所述生物传感器的优选实施方案时形成的稳态环的 示意性框图。

定义

本文使用的所有技术术语、科学术语或其他术语具有的含义与本 发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。提供下述定义意在阐明 或解释所定义术语的普通含义，而不应解释为限制或缩小这些术语含 义的范围。虽然与本文描述的方法和材料类似或等价的任何方法和材 料均可用于实施或测试本发明，但将还是描述所述方法、装置和材料。 本文提及的所有出版物通过引用的方式纳入本文，目的是为了描述并 公开所述出版物中报告的可能用于本发明的材料和方法。本文中任何 内容都不能被解释为承认本发明由于在先发明而没有资格早于这些公 开物。

本文使用的“人源化VEGF单克隆半抗体”是指通过三(2-羧乙基) 膦（TCEP）将连接两条重链的二硫键切割后所产生的两个单克隆抗体 片段。所产生的半抗体（hAb）具有完整的结合位点和反应性巯基。 这些hAb保留了它们的靶向能力，但其尺寸较小，可以以位点特异的 方式共轭以及与所述马来酰亚胺封端的SiO2表面反应。

本文使用的“VEGF-A和VEGF单克隆抗体杂交”是指VEGF1与 VEGF单克隆抗体11杂交的过程，是通过VEGF-A和VEGF单克隆半 抗体之间的分子识别来实现的。所述人源化VEGF单克隆抗体（rhuMab  VEGF;贝伐单抗;）与VEGF结合的亲和力与原始抗体与VEGF 结合的亲和力（Kd约0.5nM）非常相似。与其小鼠对应物相同，贝伐 单抗结合并中和所有的人VEGF-A同种型和生物活性的蛋白水解片段。 贝伐单抗的结合表位已通过Fab-配体复合体的晶体结构分析被确定。该 分析预测人VEGF中的Gly88对于结合贝伐单抗是必需的，并且该残基 还构成贝伐单抗结合的种特异性的基础，因为在小鼠和大鼠中VEGF的 相应位点发现的是丝氨酸残基。贝伐单抗不中和VEGF基因家族的其他 成员例如VEGF-B或VEGF-C。贝伐单抗在几个物种中的药物代谢动力 学性质此前已有记载，并且其与典型的人源化单克隆抗体一致。贝伐单 抗在人体内的终末半衰期是17-21天。重要地，迄今为止进行的任何临 床试验中都没有发现对贝伐单抗的抗体反应证据，这验证了其人源化的 成功。

本文使用的“VEGF单克隆半抗体固定”是指所述半抗体结合到所 述表面的过程，其中马来酰亚胺-巯基偶联快速并自发地发生。所述马来 酰亚胺封端的SiO2底物会与抗VEGF hAb溶液以需要的浓度孵育2小 时。所述hAb会以方向特异的方式自发地偶联到所述底物表面。如图3 所示，抗原结合位点将保持向外。所述VEGF hAb的浓度将被用于控制 所述底物上的hAb涂敷密度。孵育后，用PBS缓冲液冲洗所述底物以除 去所有未共轭的化合物。

本文使用的“表征VEGF半抗体固定”是指通过使用荧光测量来确 认并定量所述偶联反应的过程。在TCEP还原之前，用Alex-488荧光团 共价标记CEA mAb。为确认所保留的荧光是由于马来酰亚胺-巯基共轭 而不是VEGF hAb或未切割的mAb的非特异性吸收，使用完整的mAb 作为阴性对照以确保用PBS缓冲液冲洗之后mAB不会吸收并粘附到所 述底物。然后，VEGF蛋白将被用于进一步评估所述固定的VEGF hAb 的结合敏感度和特异性。

本文使用的“表面修饰”是指制备SiO2表面14的过程，其为， 首先用piranha溶液（H2SO4:H2O2=3:1(v/v)）处理20min，然后用 蒸馏水冲洗以完全清洁所述表面。然后，将所述底物浸入50%乙醇溶液 （EtOH:H2O=50:50(v/v)）2小时以完全水合所述表面。然后，再用 piranha溶液处理所述水合表面20min，并用蒸馏水洗涤。所述整个过 程将导致SiO2表面的完全羟基化以形成氢氧化硅（SiOH）表面。用氮 气干燥所得的SiOH底物并将其保存在-20℃用于后续使用。然后，在 SiOH底物上合成马来酰亚胺封端的SAM。简单地通过浸渍过程，用1M 3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液处理所述SiOH底物1hr。这将形 成胺（-NH2）封端的自组装单层（SAM）。该-NH2封端的SAM能够容 易地与活化的羧酸反应，用于进一步修饰所述表面。在优选的实施方案 中，将所述-NH2封端的SAM与1M琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲 基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)的二甲基亚砜（DMSO）溶液孵育2hr，然 后用蒸馏水洗去未反应的化合物。该过程将导致形成具有马来酰亚胺封 端的功能性表面基团的SAM。然后，这些马来酰亚胺封端的SAM可自 发地与具有一个或多个游离的巯基官能团的任何类型的生物分子（例如 蛋白质、肽、半抗体和其他抗体片段）反应，并因此将所述生物分子固 定到所述底物表面上。为制备清洁且高质量的SAM，需要用蒸馏水洗涤 所形成的SAM并将其在连续的氮气流下干燥，然后储存在-20℃用于后 续使用。将所述表面在室温下以MeOH/HCl（1/1）清洁30分钟，以超 纯水（Milli-Q Gradient A1018.2MΩ）冲洗，并以氩气干燥。在下一步 骤中，在气相或液相中通过使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）的 硅烷化步骤将所述表面用NH₂基团修饰。为了进行气相硅烷化，将所述 芯片置于含有几滴甲硅烷的干燥器中。将所述干燥器密封并加热至超过 100℃，使所述芯片在低压（约1mbar）下与甲硅烷蒸气反应1-2小时。

本文使用的“表面表征”是指例如原子力显微镜（AFM）、扫描电 镜（SEM）和X-射线光电子能谱（XPS）的方法。可通过使用傅里叶变 换红外（FT-IR）光谱法监测形成SAM的每一步的证据，该方法将提供 所述SAM中官能团的特征信号。

本文使用的“靶分析物”是指测试样品中有待于使用本发明检测 的物质。所述分析物可以是存在其天然捕获剂（例如抗体、多肽、 DNA、RNA、细胞、病毒等）或可制备其捕获剂的任何物质，并且 在测定中所述靶分析物可结合一个或多个捕获剂。“靶分析物”还包 括任何抗原性物质、抗体及其结合物。所述靶分析物可包括蛋白、肽、 氨基酸、碳水化合物、激素、甾体、维生素、药物（包括出于治疗目 的给予的药物以及出于非法目的给予的药物）、细菌、病毒和任意上 述物质的代谢物或抗体。

本文使用的“靶分析物类似物”是指可与分析物捕获剂交叉反应的 物质，尽管其反应程度可能较所述靶分析物本身更强或更弱。所述靶分 析物类似物可包括修饰的靶分析物以及所述靶分析物分子的片段部分或 合成部分，只要所述靶分析物类似物具有至少一个与所述兴趣靶分析物 相同的表位位点。

本文使用的“捕获剂”是能够结合靶分析物或靶试剂的分子或化合 物，其可直接或间接附着于基本上为固体的材料。所述捕获剂可以是存 在其天然靶分析物（例如抗体、多肽、DNA、RNA、细胞、病毒等）或 可制备其靶分析物的任何物质，并且在测定中所述捕获剂可结合一个或 多个靶分析物。

本文使用的“测试样品”是指含有有待于使用本发明检测和测定 的靶分析物的样品。除所述靶分析物以外，所述检测样品还可含有其 他组分，可具有液体或固体的物理属性，并可为任意大小或体积，所 述测试样品包括例如移动的液体流。所述测试样品可含有除所述靶分 析物以外的任何物质，只要所述其他物质不干扰所述靶分析物与所述 捕获剂的结合或第一结合成员与第二结合成员的特异性结合。测试样 品的实例包括但不限于：血清、血浆、痰、精液、尿、其他体液，以 及环境样本例如地下水或废水、土壤浸出物、空气和杀虫剂残留物。

本文使用的“方法和试剂”（出于分析和测试本发明装置的目的， 发明人采用并使用了HS Lee et al.,2008文章中提供的信息，目的是鉴 定所述方法）是指试剂，例如：3-氨基丙基二乙氧基硅烷（APDES）、 琥珀酐（SA）、碳酸钠（SC）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂、十 二烷基硫酸钠（SDS）、1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺（EDC）、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺（硫代-NHS）、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠 (NaCl)(Sigma-Aldrich Co.St.Louis,MO)。人VEGF165（Cell  Signaling Technology,Inc.Danvers,MA）作为检测蛋白。据报道，编 码人VEGF165的cDNA被亚克隆至表达载体中并在酵母中表达。据 报道，重组人VEGF165同型二聚体被进一步纯化并保存在含有0.1% BSA的磷酸盐缓冲盐水（PBS,pH7.4）中。

本文使用的“合成VEGF单克隆抗体”是指通过化学过程将人源 化的VEGF抗体切成两半。摩尔量超过所述VEGF单克隆抗体（mAb） 摩尔浓度3倍的三(2-羧乙基)膦(TCEP)将被用作还原剂。在室温下， 将所述TCEP还原剂与所述VEGF mAb在PBS缓冲液中混合2hr。 所述TCEP将选择性地切割连接mAB的两条重链的二硫键，并产生 两个VEGF半抗体（hAb）。所得的hAb具有完整的结合位点和反 应性巯基。这些hAb保留了它们的靶向能力，但其大小较小且能够以 位点特异的方式共轭。在本研究中，所得的hAb可直接（未经预先 纯化）用于与所述马来酰亚胺封端的SiO2表面反应。

本文使用的“表征VEGF单克隆半抗体”是指确定所合成的半抗 体。可使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）优化 所述选择性还原过程。为确认hAb的产生并优化所述选择性还原过 程，将VEGF mAb与不同摩尔量的过量TCEP混合2hr，然后分离 并可视化。具体地，使用NovexSureLockXcell电泳系统（Invitrogen） 在Tris-乙酸电泳缓冲液中在SDS-PAGE3-8%Tris-乙酸10孔迷你凝 胶上分离所述切割的mAb。所述样品将在150V电泳1hr，将所产 生的聚丙烯酰胺凝胶在SimplyBlueTM（Invitrogen）中过夜染色以可 视化。为定量所述hAb的浓度，可将Alexa Fluor488荧光探针预共 轭到所述mAb，然后进行还原。然后，可测量来自hAb的荧光强度， 并与标准曲线化比较。

本文使用的“合成的VEGF半抗体的结合亲和力”是指使用表面 等离子共振（SPR）分析（Kang et al.,2008）来分析两个生物分子之 间的相互作用。

本文使用的“稳态控制机制”是指这样的概念，即所述生物传感 器测量变量的至少三个相互依赖的组件是被调节的：受体是传感组 件，杂交的VEGF分子改变所述电容负荷，因此监测环境改变并对 其作出反应。所述受体感受刺激，其发送信息到控制电路——设定变 量维持范围的组件。所述控制电路决定对所述刺激的合适反应。然后， 所述控制电路发送信号至接收来自所述控制电路的信号的效应器。在 接收到所述信号后，发生变化，以通过用正反馈增强所述信号或者用 负反馈削弱所需信号来校正偏差。

本文使用的“血管发生”是指包括从已存在的血管生长新血管的 生理过程。尽管有一些对术语的争论，但是血管发生是用于自发血管 形成的术语，内填作用（intussusception）是用于通过分裂已存在的 血管而形成新血管的术语。

本文使用的“信号转导”是指将对细胞的机械/化学刺激转变为 特异性细胞反应的机制。信号转导始于到达接收器的信号，终于细胞 功能改变。

本文使用的“酪氨酸激酶”是指可将ATP中的磷酸基团转移到 蛋白的酪氨酸残基的酶。酪氨酸激酶是更大类的蛋白激酶的亚组。通 过激酶来磷酸化蛋白质是信号转导中的重要机制，用于调节酶活性。

本文使用的“微电子机械系统（MEMS）”是指非常小的技术， 其在纳米尺度合并到纳米电子机械系统（NEMS）和纳米技术。MEMS 由介于1微米到100微米（即0.001mm到0.1mm）大小的组件组成， 并且MEMS装置的大小通常介于20微米（百万分之二十米）到1毫 米。它们通常由处理数据的中枢单元、微处理器和数个与外部相互作 用的组件（例如微传感器）组成。

本文使用的“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物，通常具有20个 或更少的碱基。虽然它们可由更长的片段通过键断裂而形成，但是现 在更常见的是通过聚合单个的核苷酸前体来合成。自动化合成仪可合 成具有多达160到200个碱基的寡核苷酸。

本文使用的“凝集素”是指对自身糖基具有高度特异性的糖结合 蛋白。它们在涉及细胞和蛋白质的生物识别现象中发挥作用。例如， 一些病毒在感染期间使用凝集素将其自身附着到宿主生物的细胞。

本文使用的“适体”是指结合到具体靶分子的寡核酸分子或肽分 子。适体通常通过从大的随机序列库中选择它们而产生，但是天然适 体也存在于核糖开关中。适体可用于基础研究和作为大分子药物用于 临床目的。适体可在其靶分子的存在下与核酶结合以自切割。这些化 合物分子具有其他的研究、工业和临床用途。

本文使用的“肽”是指由α-氨基酸以确定的顺序连接而形成的短 的聚合物。一个氨基酸残基和下一个氨基酸残基之间的连接称为酰胺 键或肽键。

本文使用的“共振”是指系统在某些频率下比在其他频率下以更 大的振幅振动的趋势。这些频率被称为该系统的共振频率。在这些频 率下，甚至小的周期性驱动力可产生大振幅的振动。

本文使用的“石英晶体微天平（QCM）”是指通过测量石英晶 体共振器频率的改变来测量每单位面积的质量的装置。由于在共鸣器 表面的氧化物增加/下降或膜沉积，加入或移除小的质量可干扰所述 共振。

本文使用的“酶”是指催化化学反应（即增加化学反应速率）的 蛋白质。在酶促反应中，所述过程起始时的分子称为底物，所述酶将 它们转变成不同的分子，称为产物。生物细胞中几乎所有过程都需要 酶以在显著的速率进行。由于酶对其底物具有选择性且在许多可能的 反应中只加速某些反应，细胞中制备的酶集合决定在该细胞中发生哪 些代谢途径。

本文使用的“表位”是指抗原中被免疫系统（具体是抗体、B细 胞或T细胞）识别的部分。抗体中识别所述表位的部分称为互补位。 虽然通常认为表位源自非自身蛋白，但是可被识别的源自宿主的序列 也被分类为表位。

本文使用的“自组装单层（SAM）”是指两亲性分子的有组织的 层，其中所述两亲性分子的一个末端——“头部基团”——显示出对 底物的特异性亲和力。SAM的终端还包含具有官能团的尾部。SAM 是通过亲水的“头部基团”化学吸附到来自蒸汽或液相的底物，然后 通过疏水“尾部基团”的缓慢二维组织而形成的。最初，被吸附的分 子形成无序的分子团或者形成“下沉相（lying down phase）”，经 数小时的时间，开始在所述底物表面形成晶质结构或半晶质结构。所 述亲水性“头部基团”在所述底物上组装在一起，而疏水性的尾部基 团组装成远离所述底物。密集的分子区域成核并生长直到所述底物的 表面被单个的单层覆盖。

本文使用的“生物学反应调节剂（BRM）”是指人体天然产生 的物质，以及科学家可在实验室中制造的物质。这些物质激发身体对 感染的反应。这些物质的一些被用于治疗关节炎、癌症和一些其他疾 病。免疫治疗使用BRM来增强免疫系统活性以增加身体对癌症的天 然防御机制，而用于类风湿性关节炎的BRM目的是减少炎症。

本文使用的“医学植入物通信服务（MICS）”是指使用介于402 MHz和405MHz之间的频带与医学植入物通信的技术规范的名称。 其允许与起搏器或其他电子植入物的双向无线电通信。其最大发射功 率非常低，EIRP=25微瓦，目的是减少与其他使用相同频带的用户相 互干扰的风险。在任何一个时刻所使用的最大带宽是300kHz，这使 其成为一个低比特率的系统（与WiFi或蓝牙相比）。与之前使用的 需要外部收发器以接触患者皮肤的诱发技术相比，其主要优势为更具 灵活性。MICS的有效范围为数米。

本文使用的“电容器”是指由被电介质（绝缘体）分开的导体对 组成的无源电子组件。当所述导体之间存在电势差（电压）时，在所 述电介质中呈现电场。所述电场储存能量，并在所述导体之间产生机 械力。当在大面积的导体之间有窄的间隔时，所述效应最大，因此电 容器的导体通常被称为板。

具体实施方式

图1是所述装置的正投影截面视图，含所述电子检测模块的示意 图。生物传感器有其绝缘罩100。绝缘罩100，配置有流体入口101和 流体出口102。装置100包括形成电容性板103的涂有VEGF传感元 件的电极阵列并形成VEGF电容检测器电路，电容性板103与电子模 块200交界。所述VEGF电容检测器电路被连接到运算放大器 （OpAmp）缓冲器201，并且连接到电流电压放大器202，然后连接 到OpAmp集成电路203，包括偏置电阻器204、205和电容器206。 输入电压Vin207、电流输出I209和V1209代表杂交后各自的电势和 电路200中所得的电容变化的积分值。所述电极被设计成互相交叉模 式，以在小体积中最大化所述传感器的表面积。

图1A是图1的一个实施方案的示意图，描绘形成电容器阵列110 的等效电极-电解质节点的一个单元。电路图110可表示为：通过电阻105 和其电容负载Ca106描绘电极a/溶液界面的电阻（R_a）。所述传感器本 体100中的溶液的电阻由(R_s)107表示，而电极B/溶液界面的电阻表示 为(R_b)108，其电容负载为(C_b)109。形成生物传感器110的所述阵列电 容器的一节点单元与电容检测器电路200交界。方波发生器产生的输入 （V_in）信号207被OpAmp201缓冲，并产生电流208，电流208代表 VEGF与a-VEGF mhAb结合杂交后所述电路中各自的衰减值R₁204。 在等效电路节点110所示的由于VEGF分子与a-VEGF mhAb结合产生 电容改变之后，电流208耦合到所述OpAmp（充当电流电压放大器 202），以指示电容单元110各自的积分值。所述信号被OpAmp203和 与之相连的电阻器205、电容器206进一步整合，产生输出电压（V_out） 210。

图2是VEGF检测器的电容排列的横截面等轴视图。该图描绘了 图1和图1A标示的元件，其进一步解释并阐明了等效电子模块110 和支配VEGF检测器性能的传感原理之间的关系。所述VEGF生物传 感器基于电化学方法，据此使用具有几何形状G_x300的电容器，目的 是用以下述方程1中的电介质（ε_r）作为变量，并且还利用无标记检 测技术（基于生物修饰的电极/溶液界面的电容测量值）。传感器100 的功能可由所述传感器将成股的a-VEGF mhAb11有效固定在传导电 极表面16的能力来最好地定义。所述电解质溶液（电极之间的介质） 是体液，例如脑脊液3。电极16用p-Si底物15涂敷，以增强VEGF1 和a-VEGF mhAb11之间的亲和力。绝缘层（例如二氧化硅）14保护 带有正电荷的底物15，带正电的底物15经杂交物质(3-氨基丙基-三甲 氧基硅烷)13与连接体（琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1- 羧酸酯）12键合。然后，所述a-VEGF mhAb通过与所述连接体键合 而被固定。由于固定a-VEGF mhAb造成的总表面厚度增加是约10 nm。当将VEGF蛋白1引入至体液3中时，它们结合到涂敷有a-VEGF  mhAb的电极表面。所述VEGF分子和a-VEGF mhAb的结合可改变 所述电极-溶液界面的阻抗（即主要是其电容）。当所述VEGF分子在 其抗-VEGF片段（抗原结合(Fab)域界面10）与a-VEGF mhAb杂交 时，总厚度是约200nm。

所述电化学单元110的电容106和109可以如方程1中所示模拟。

$C_{\mathrm{cell}}=C_{\mathrm{geometry}}+C_{\mathrm{electrode}/\mathrm{solution}}---\left(1\right)$

其中，C_Geometry是由所述传感器的几何形状产生的电容，如方程2 所示。

$C_{\mathrm{geometry}}={ϵ}_r{ϵ}_{0}A/d---\left(2\right)$

其中，ε_r是由VEGF分子、体液、a-VEGF mhAb、琥珀酸酐连接 体(Succinic linker)、氨基杂交物质、SiO₂绝缘体和p-Si底物组成的介质 的组合相对电容率（杂交之前所述组合介质的介电值的介电常数，"ε_r=" [(ε_r)₁,(ε_r)₂,…(ε_r)_n],并考虑总电容值“C_cell”）；ε₀是自由空间的电容率 （8.854×10^-12F/m）；A是由宽52和长53的电极板103所得出的总面积； d是板103之间的间距51。选择A和d的值，使得所述电容变化可以用 如下技术有效地测量，但通过传感器单元100的体液环流不受限制。由 于VEGF结合时所述表面的厚度是约200nm的事实，所述间距可以小 至5000nm，而没有VEGF杂交所导致的限制所述流的风险。电极板103 以互相交叉的手指模式排列，以在小体积中最大化有效的表面积。体液 3经入口101流入所述传感器单元，并流过出口102，可能连接到图5将 进一步描述的泵和阀部件。

C_{electrode/solution}是两个电极的每一个和所述溶液之间形成的双层电容。 所述双层电容可以如下述方程3所示模拟。下面方程9和10中电极A 和电极B的C_{electrode/solution}分别由C_A和C_B表示。

$\frac{1}{C_{\mathrm{electrode}/\mathrm{solution}}}=\frac{1}{C_{\mathrm{insulator}}}+\frac{1}{C_{\mathrm{linker}}}+\frac{1}{C_{\mathrm{Macugen}}}+\frac{1}{C_{\mathrm{VEGF}}}$

当所有a-VEGF mhAb与VEGF键合时，C_cell的总值是约1μF/cm²， 其动态范围约0.3μF/cm²。

图2A是电容VEGF传感器的正投影俯视图，其中电容器板103被 表示为它们各自有效的几何术语G_x300。选择A和d的值，使得可以 用以下技术有效地测量电容变化。用于选择尺寸51[（d_cap），在计算 所述电容值中传感器板之间的距离]和52[（W_cap），用于计算所述电容 值的传感器板103的宽]的边界条件是通过提供所述体液穿过传感器 单元100的无限制环流，以及通过设置所述静态流速为恒定值来确定 的。

如图1、1A、2和2A所指出的，所述电化学单元的测量技术是基于 可变电容器单元的传感原理，其中电极/溶液界面模型110的电介质（ε_r） 是可变的。在该模型中，在a-VEGF mhAb11上停靠的VEGF蛋白1在 电极和溶液之间引入另外的绝缘层14，导致所述界面模型的电容组件的 可测量的变化。基于电荷的电容测量（CBCM）技术，可以测量电容组 件中的这种电极-溶液界面阻抗的变化。该CBCM技术的测量原理是以 合适频率充电和放电所述VEGF电化学单元，并从半周期的平均电流测 量其等效电容，如方程4所示。

$I_{\mathrm{avg}}=\frac{\mathrm{\Delta Q}}{T/2}=\frac{\mathrm{C\Delta V}}{T/2}=2\mathrm{C\Delta Vf}$

其中ΔV和f为已知，I_avg可测量。该测量技术在由两个单独的电路 组成的电路200中示出。OpAmp电压跟随器（follower）201可增加所 述电化学单元的输入阻抗，使得所述单元可以被几乎完美的方波207驱 动，方波207来自微控制器401的数字输出信号线。选择所述方波的频 率（f）作为半周期中完全充电和放电所述电化学单元中电容器的最大频 率。

电路200的第二部分用已知电阻器值R₁204，将I_avg208转换成电压 值，并通过Op-Amp202将所述电压值放大。在Op-Amp202的输出处 的V₁209可如方程5所示进行计算。

$V_1=-C_{\mathrm{cell}}{R}_1\frac{{\mathrm{dV}}_{\mathrm{in}}}{\mathrm{dt}}---\left(5\right)$

Op-Amp集成电路203将瞬时电压值209转换成方波210，如方程6 所示。

$V_{\mathrm{out}}=-\frac{1}{C_2}\int \frac{V_1}{R_2}\mathrm{dt}$

将方程2代入方程3，电路200的输出作为其输入的函数，可以如 方程7计算，得出方程8。

$V_{\mathrm{out}}=-\frac{1}{C_2{R}_2}\int -C_{\mathrm{cell}}{R}_1\frac{{\mathrm{dV}}_{\mathrm{in}}}{\mathrm{dt}}\mathrm{dt}---\left(7\right)$

$V_{\mathrm{out}}=\frac{C_{\mathrm{cell}}{R}_1}{C_2{R}_2}{V}_{\mathrm{in}}---\left(8\right)$

由ADC402取样的电路200的输出电压与C_cell的值成比例。

图3示出带有组成型杂交元件的VEGF传感器，和其中固定的 a-VEGF mhAb11（通过被选择用于高亲和力地结合到分子靶的Fab片 段），使用单链抗体作为蛋白结合的亲和分子的概念，最初在1998年描 述（YA Muller et al,1998），并且其是基于短序列在存在靶下折叠成独特 三维结构的能力，所述三维结构可以高亲和力和特异性结合所述靶。可 使用a-VEGF mAb21的一半（例如），因为其被证明具有对 VEGF分子1的结合亲和力。a-VEGF mhAb11被附着到连接体12[琥 珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，也称为4-(N-马来 酰亚胺甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，是具有分子式 C₁₆H₁₈N₂O₆的有机化合物]。所述连接体12被附着到杂交物质（3-氨基 丙基-三甲氧基硅烷），这采用生物相容的支架以提供可行的替代物来形 成用于粘附的假体材料。用马来酰亚胺封端的SAM20作为支架来生长 连接体12是有利的，因为其具有大的表面积，这使得大量位点用于琥珀 酸酐12的粘附和生长。该NH2封端的SAM可容易地与活化的羧酸反应 用于进一步修饰所述表面。所述连接体12还与杂交物质（3-氨基丙基- 三甲氧基硅烷）13结合。将石英或玻璃晶片（SiO₂14）的表面以不同的 氨基硅烷溶液处理，其中表面密度随反应时间而急剧增大并产生多层。 氨基-硅烷化13是支架，其提供可行的替代物，形成用于粘附到SiO₂绝 缘体表面14的假体材料。可使用固定的a-VEGF mhAb11复合体检测循 环的VEGF同种型1。

硅绝缘体表面的制造详细描述于HS Lee et al.,2008中，其描述了在 绝缘罩17内部被沉积Au层（100μm）以形成电极103的交错阵列。在 50Torr气压下和530℃下，在SiH4前体的恒流中，p型掺杂的硅晶体15 在Au导体表面16上生长。在该过程中，在SiH₄:B₂H₆的相对压力比为 10:1×10^-3下，硅晶体与作为p型掺杂剂的B₂H₆原位掺杂。当p型底物 15达到1μm时，继续SiH₄流但停止B₂H₆。在添加的Si层达到10nm 后，停止SiH₄流；将温度升高至820℃并将气室向大气压开放，使得在 干燥气氛中氧化以形成SiO₂绝缘层14。

因此，一个传感器板的组合厚度是102.02μm（电极、两层p-底物 和两层绝缘体的厚度之和）。宽d（所述板之间的距离51）为50μm，每 个电极对需要的总空间是152.02μm。因为1cm²的板面积可提供大约1 μF的足够电容，所以选择A为1cm²，任意选择W（板的宽52）为0.5 cm，这导致所述板的总长为2cm或20000μm。选择L（板的长53）为 1000μm，以互相交叉的手指模式排列20个匝或电极对。因此，所述传 感器的总体积是5000μm×1000μm×3040.4μm。

图3A示出在通过VEGF单克隆半抗体（a-VEGF mhAb）功能化之 前马来酰亚胺封端的SAM。SAM的基本表征可通过使用表面表征技术 例如原子力显微镜（AFM）、扫描电镜（SEM）和X-射线光电子能谱（XPS） 来完成。形成SAM的每一步的证据可通过使用傅里叶变换红外（FT-IR） 光谱法监测，该方法提供所述SAM中官能团的特征信号。

图3B示出将VEGF单克隆抗体（a-VEGF mAb）分裂成两个半抗 体的选择性还原过程。该图显示，用摩尔量超过所述VEGF单克隆抗体 （mAb）21摩尔浓度3被的三(2-羧乙基)膦(TCEP)作为还原剂。在室 温下将所述TCEP还原剂与所述VEGF mAb在PBS缓冲液中混合2hr。 所述TCEP可选择性地切割连接mAB的两条重链的二硫键，并产生两 个VEGF半抗体（hAb）22。所得的hAb具有完整的结合位点和反应性 巯基。这些hAb保留了它们的靶向能力，但其大小较小且能够以位点 特异的方式共轭。在一个实施方案中，所得的hAb可直接（未经预先纯 化）用于与所述马来酰亚胺封端的SiO2表面反应。

在一个实施方案中，所述选择性还原过程可通过使用十二烷基硫酸 钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）优化。为确认hAb的产生并优化 所述选择性还原过程，将含有a-VEGF mAb的溶液与不同摩尔量的过量 TCEP混合2hr，然后分离并可视化。具体地，使用NovexSureLockXcell 电泳系统（Invitrogen）在Tris-乙酸电泳缓冲液中在SDS-PAGE3-8% Tris-乙酸10孔迷你凝胶上分离所述切割的mhAb。将所述样品在150V 电泳1hr，并将所产生的聚丙烯酰胺凝胶在SimplyBlueTM（Invitrogen） 中过夜染色以可视化。为定量所述hAb的浓度，可将Alexa Fluor488 荧光探针预共轭到所述mAb，然后进行还原。然后，可测量来自hAb 的荧光强度，并与标准曲线化比较。

图3C示出了包括马来酰亚胺-巯基共轭以产生a-VEGF mhAb功能 化的SiO₂底物25的自发反应。马来酰亚胺-巯基偶联快速且自发地发生。 将所述马来酰亚胺封端的SiO₂底物20与a-VEGF mhAb22溶液以需要 的浓度孵育2小时。所述a-VEGF mhAb22以方向特异的方式自发地偶 联到所述底物表面。如该图所示，抗原结合位点将保持向外。a-VEGF  mhAb22的浓度被用于控制所述底物上的hAb涂敷密度。孵育后，用 PBS缓冲液冲洗所述底物以除去所有未共轭的化合物。

在一个实施方案中，通过使用荧光测量来确定并定量化所述偶联反 应。在TCEP还原之前，用Alex-488荧光团共价标记a-VEGF mhAb。 为确认所保留的荧光是由于马来酰亚胺-巯基共轭而不是a-VEGF mhAb 或未切割的mAb的非特异性吸收，使用完整的mAb作为阴性对照以确 保用PBS缓冲液冲洗之后mAb不会吸收并粘附到所述底物。然后，VEGF 蛋白将被用于进一步评估所述固定的VEGF hAb的结合敏感度和特异 性。

图4是生物传感器100的横截面俯视图，以其电极矩阵阵列103形 成为电容器，并且其设计包括包围罩17。所述生物传感器含有涂敷有 VEGF传感器的电极阵列，其形成电容板103，目的是通过在所述生物 芯片罩17的参数内提供最大表面面积而使对所述电路的电容变化的响 应最大化。该图还描述了，流体入口101和出口102、电接口16，并且 绝缘罩17被描述为本发明装置的参数。

图4A示出VEGF生物传感器100的等效电路110，以及所述电路 可以怎样分解以模拟所述电容器矩阵阵列中的每对电容板103。每对电 容板103与所述溶液形成电极-电解质界面，其可以用等效电路120表示。 因为所述溶液介质是动态的，所以每对板的电路在所述电极/溶液界面处 短路。因此，整个传感器110的等效电路可书写为每对板的组合电路， 每对板与其相邻的对是电并联的。方程9-13使得110的参数可以由每对 板120的参数得出。

$C_A=C_{\mathrm{al}}\left|\right|C_{a2}|···||C_{\mathrm{aN}}=\underset{N}{\Sigma }{C}_{\mathrm{ai}}---\left(9\right)$

$C_B=C_{b1}\left|\right|C_{b2}\left|\right|···\left|\right|C_{\mathrm{bN}}=\underset{N}{\Sigma }{C}_{\mathrm{bi}}---\left(10\right)$

$R_A=R_{a1}\left|\right|R_{a2}\left|\right|···\left|\right|R_{\mathrm{aN}}=\frac{1}{\underset{N}{\Sigma }\frac{1}{R_{\mathrm{ai}}}}---\left(11\right)$

$R_B=R_{b1}\left|\right|R_{b2}\left|\right|···\left|\right|R_{\mathrm{bN}}=\frac{1}{\underset{N}{\Sigma }\frac{1}{R_{\mathrm{bi}}}}---\left(12\right)$

$R_s=R_{s1}\left|\right|R_{s2}\left|\right|···\left|\right|R_{\mathrm{sN}}=\frac{1}{\underset{N}{\Sigma }\frac{1}{R_{\mathrm{si}}}}---\left(13\right)$

图5是包括VEGF生物传感器100的送递装置800的可能设计的框 图。该图显示VEGF生物传感器100沿导管管道104与其他生理传感器 （包括压力传感器406、pH传感器407和SpO₂408）串联。压电泵404 使来自肿瘤位点600的脑脊液环流通过所述传感器系列。来自所述传感 器的数据通过TI-ADS8344模数转换器402获取，用于通过TI-MSP430 微控制器401处理，TI-MSP430微控制器401控制来自容器500的抗癌 药物经泵组405的送递。MICS收发器使得植入的送递装置800经MICS 基站702与医师计算机701通信。

图5A描述了图5中送递装置800的可能设计中的数据流和控制机 制。对肿瘤位点600处血管发生可用的VEGF1量进行调节是通过循环 泵404完成的，所述循环泵404可控制流体流404.2，从肿瘤位点带出测 试样品404.1，并送递注入的抗癌药物404.4。另外的泵组405可调节来 自容器500的抗癌药物的注入404.3。从所述肿瘤位点带回的测试样品被 循环通过传感器系列，以获得与肿瘤生长以及抗癌药物治疗进展相关的 信息。所述传感器（例如压力传感器406、pH传感器407、SpO₂408和 VEGF生物传感器100）将物理和生物信息转换成电信号402.1、402.2、 402.3和402.4。所述信号被ADC402转换成数据数字401.1，用于通过 微控制器401加工。通过将控制信号发送至泵404和405401.3，微控制 器401关闭所述稳态环（在图5B中描述）的反馈途径，导致抗癌药物 的注入404.3。注入方案编程在所述微控制器内的“查找表”或模型中， 并可经Zarlink-70101医学植入物通信服务（MICS）收发器403进行升 级401.5。所述MICS收发器还用于将传感器数据和装置状态无线传输至 医师计算机701403.1，用于实时监测和数据记录701.1。

图5B是本发明的实施方案形成的稳态环801的正投影视图。所述稳 态方法被用于实现稳态平衡，所述稳态平衡可限制肿瘤生长而又不危及 所述肿瘤位点附近的周围组织。所述稳态方法在微控制器401内部编程， 其输入来自传感器例如VEGF生物传感器100、压力406、pH407和SpO₂408。提取与肿瘤生长有关的信息例如生长因子、颅内压、组织状态和代 谢率，以基于所述“查找表”中的参数确定治疗的进展。所述传感器信 息还可用于计算内部状态，这可使得可对所述系统调整以实现所需参数。 所述“查找表”产生驱动参数，以控制影响肿瘤位点600状态的泵。经 无线收发器403，基于医师的外部输入可更新所述内部状态。

下表1示出了与数种癌症参考数据库（例如，美国国家癌症研究所、 英国癌症研究院）中所列的不同癌症相关的标志物的对照表。已知这些 在人血清中发现的生物标志物对于所述疾病的诊断和预后是可靠的。利 用本发明公开的程序和方法可使生物化学领域技术人员以多种抗体产生 类似的结果。因此，例如，表1中所呈现的每种生物标志物的特异性抗 体可被用于形成对所述生物标志物特异的生物传感器。生物传感器领域 技术人员将能够预见本发明中所用技术可被扩展到构建依赖但不限于表 1中所呈现的癌症标志物的生物传感器。

因此，必须理解，说明性实施方案的描述只是为了举例，而不应 被视为对本发明的限制，本发明由下文的权利要求书限定。例如，尽 管权利要求书的要素在下面以某种组合的形式进行陈述，然而必须清 楚地理解本发明包括如上公开的更少、更多或不同要素的其他组合， 即使当最初没有要求保护这些组合时也如此。两个要素组合在一个要 求保护的组合中的讲授应理解为也包括所述两个要素未相互组合，但 可单独使用或在其他组合中组合的情形。本发明任何公开的要素的分 割明确地被认为在本发明的范围之内。

在本说明书中用于描述本发明及其多个实施方案的词语应理解为不 应有它们通常限定的含义，还应包括超出通常限定含义范围的本说明书 结构、材料或作用中的特殊定义。因此，如果要素在本说明书的上下文 中可理解为包括一种以上的含义，那么其在权利要求书中的使用必须理 解为，对本说明书和所述词语自身支持的所有可能的含义都是通用的。

因此，在本说明书中所确定的以下权利要求书的词语或要素的定义 不仅包括字面上描述的要素组合，而且包括以基本相同的方式、行使基 本相同的功能以获得基本相同结果的所有等同结构、材料或作用。因此， 在这个意义上，应考虑到可将下面权利要求书中的任一要素等同替换为 两个或多个要素，或者可将权利要求书中的两个或多个要素替换为单个 要素。尽管要素可在上面被描述为在某些组合中起作用，甚至最初也这 样要求保护，然而应清楚地理解所要求保护的组合的一个或多个要素可 在某些情况下从所述组合中分割，以及所要求保护的组合可涉及子组合 或子组合的变化。

本领域普通技术人员认为的所要求保护主题的非实质性变 化——现在已知的或将来设计的——被明确地认为等同在本权利要 求书的范围内。因此，本领域普通技术人员现在或将来所知的明显替 换被确定为在本限定要素的范围内。

因此，本权利要求书应被理解为包括上述具体说明和描述的内 容、在概念上等同的内容、可被明显替换的内容以及本质上包含本发 明本质构思的内容。