基于可重复使用免疫磁珠的抗体检测方法建立及可重复使用磁性微流体蛋白芯片初步设计

摘要

抗体检测可用于评价人和动物免疫功能的指标，对于有关疾病的诊断具有重要意义。本课题基于可重复使用的免疫磁珠技术，抗原表位分析预测技术，多肽合成及筛选技术，建立了一种简捷快速高效的特异抗体检测方法。 首先应用Garnier-Robson方案，Chou-Fasman方案和Karplus-Schulz方案分析人类巨细胞病毒(Humancytomegaloviruses，HCMV)pp150蛋白二级结构中的柔性区域和可塑性区域，再按Kyte-Doolittle的氨基酸亲水性标准，预测其亲水性；按Emini方案预测蛋白质的表面可能性；按Jameson-Wolf方案预测抗原表位可能性。最后根据Kolaskar-Tongaonkar的方法进行抗原表位预测。根据以上预测结果，我们设计了7条pp150的抗原表位序列。 用Fmoc固相合成策略将设计的7条pp150抗原表位序列分别合成线性肽和8分枝多聚抗原肽。纯化后采用激光解析质谱鉴定，结果表明合成多肽质谱测定的分子量与预期相符。 分别称取适量各线性肽及多聚肽，用包被缓冲液分别稀释至2μg/L包被ELISA微孔板，每孔100μl，4℃过夜，用ELISA法检测20倍稀释的质控血清，结果单纯线性肽检测结果普遍偏低，对质控血清无分辨效果，而用八分枝多聚抗原肽[pp150-8MAPs(1～7)]检测15份阳性及10份阴性质控血清，检测结果均良好，其中弱阳性血清450nmOD值均大于阴性血清450nmOD值的2.1倍，表示该pp150-8MAPs(1～7)对质控血清具有较好的分辨率。 采用加福氏佐剂的方法用线性肽与多聚肽分别免疫Balb/c小鼠，收集免疫后小鼠抗血清，将pp150的重组蛋白抗原以1μg/ml的浓度溶于包被缓冲液中，分别以100μl/孔加于酶标板中，4℃包被过夜。用ELISA法检测免疫后抗血清滴度。结果用线性肽免疫的小鼠其血清中未检到相应的抗体，用八分枝多聚肽免疫的小鼠，血清抗体滴度平均为1∶3200，其中最高为pp150-8MAPs4和pp150-8MAPs5，分别达到1∶12800和1∶6400。 根据以上实验结果，选择免疫原性及抗原性最强的PP150-8MAPs4分枝肽采用加福氏佐剂的方法免疫新西兰兔制备标准抗血清，结果得到的标准抗血清滴度达到1∶12800。 将pp150-8MAPs4以共价结合形式包被于DynabeadsM-450Tosylactivated磁珠表面，制备特异性免疫磁珠。优化包被条件，选择最佳包被浓度。应用该免疫磁珠检测标准抗血清中的抗体，优化检测条件。在抗体检测反应结束后，洗脱抗体-二抗复合物，再生后的免疫磁珠重复用于标准抗血清样品的检测分析，并分析免疫磁珠可重复利用的次数。结果pp150-8MAPs4的最佳包被量为100μg/mL，此时包被效率为79％。用免疫磁珠法检测兔标准抗血清，免疫磁珠可重复进行20次以上的检测分析。 本课题最终拟建立可重复使用磁性微流体蛋白芯片，该芯片建成后将实现对已知抗体的快速，自动化，大规模检测，同时对已知抗体检测的灵敏度，特异性，可靠性均达到或高于ELISA法。我们已经对该蛋白芯片进行了初步设计，可以肯定，该芯片制备成功后，不仅会实现机片一体化，提高芯片检测的自动化程度，降低系统误差和芯片使用成本，更重要的是使芯片的远程侦检和无人侦检成为可能。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前 言

文献回顾

1.抗原表位的预测与设计

2 多聚抗原肽的合成

3 标准抗血清的制备

4 免疫磁珠制备与抗血清检测

5 可重复使用磁性微流体蛋白芯片的初步设计与制备

小 结

参考文献

附录：

研究成果

致 谢