一种耐热链霉菌发酵生产乙酰异戊酰泰乐菌素的培养基和发酵方法

摘要

本发明涉及一种耐热链霉菌发酵生产乙酰异戊酰泰乐菌素的培养基及发酵方法。本发明确认培养基配方和生产工艺，实现乙酰异戊酰泰乐菌素稳定、高效的生产。同时利用该培养基和生产工艺，可提高发酵单位、缩短发酵周期、提高乙酰异戊酰泰乐菌素产量。

说明书

技术领域

本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种耐热链霉菌发酵生产乙酰异戊酰泰乐菌素的培养基及发酵方法。

背景技术

乙酰异戊酰泰乐菌素(Acetylisovaleryltylosin，AIV)又称泰万菌素，是在泰乐菌素基础上经生物发酵半合成而得到的一种大环内酯类禽畜专用抗生素，生产菌种为耐热链霉菌（Streptomyces thermotolerans）的突变菌株，属于一种放线菌。作为一种新型大环内酯类抗生素，克服了许多大环内酯类药物的不足，具有高效、广谱、不易产生耐药性、毒副作用小等特点，成为目前临床上防治急性呼吸道系统和消化道系统疾病的良好抗生素，具有广泛的应用前景。市场上常见的为乙酰异戊酰泰乐菌素的酒石酸盐，商品名为爱乐新或爱福乐新。

目前，乙酰异戊酰泰乐菌素的生产工艺主要有两种：一种是耐热链霉菌通过生物转化泰乐菌素，在泰乐菌素的3′-羟基位置乙酰基化和4″-羟基位置异戊酰基化，得到乙酰异戊酰泰乐菌素；另一种是以泰乐菌素为原料，通过5步合成反应，选择性的乙酰基化、异戊酰化而得到乙酰异戊酰泰乐菌素。两种工艺存在的问题主要是：

1 采用发酵法生产乙酰异戊酰泰乐菌素，发酵单位较低，其发酵单位平均在15000-18000ug/ml；发酵周期长，能耗较高，其发酵周期一般在200h左右。

    2 采用合成的方法生产乙酰异戊酰泰乐菌素，生产过程中使用的有机溶媒毒性大，容易污染环境，并且生产成本较高，不适用于工业化大生产。

发明内容

 本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，并且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，提供实现乙酰异戊酰泰乐菌素稳定、高效的生产。

本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产乙酰异戊酰泰乐菌素的发酵方法。

为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种耐热链霉菌发酵生产乙酰异戊酰泰乐菌素的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述的种子培养基组成为：

玉米淀粉、小麦淀粉或甘薯淀粉20～25g/L、豆粉25～30g/L、酵母粉15～20g/L、玉米浆30～40ml/L、硫酸铵或硝酸铵6～8g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸镁3～5g/L、有机硅0.1～0.2ml/L；

所述发酵培养基组成为：

豆油或玉米油或菜籽油10～15g/L、玉米淀粉或小麦淀粉或甘薯淀粉20～30g/L、低温黄豆饼粉5～10g/L、配方鱼粉20～30g/L、花生饼粉15～20g/L、酵母粉8～10g/L、硫酸铵或硝酸铵3～4g/L、磷酸二氢钾3～4g/L、硫酸镁4～6g/L、硫酸锌0.01～0.03g/L、氯化铁0.06～0.08g/L、氯化钴0.001～0.003g/L和聚醚改性硅0.1～0.2ml/L，其中配方鱼粉是由鱼粉70～75%、骨粉10～15%和豆粕粉10～20%组成。

一种耐热链霉菌发酵生产乙酰异戊酰泰乐菌素的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述的种子培养基组成为：

可溶性淀粉15～20g/L、豆粉25～30g/L、酵母粉15～20g/L、玉米浆30～40ml/L、硫酸铵或硝酸铵6～8g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸镁3～5g/L、有机硅0.1～0.2ml/L；

所述发酵培养基组成为：

豆油或玉米油或菜籽油10～15g/L、玉米淀粉或小麦淀粉或甘薯淀粉20～30g/L、低温黄豆饼粉5～10g/L、配方鱼粉20～30g/L、花生饼粉15～20g/L、酵母粉8～10g/L、硫酸铵或硝酸铵3～4g/L、磷酸二氢钾3～4g/L、硫酸镁4～6g/L、硫酸锌0.01～0.03g/L、氯化铁0.06～0.08g/L、氯化钴0.001～0.003g/L和聚醚改性硅0.1～0.2ml/L，其中配方鱼粉是由鱼粉70～75%、骨粉10～15%和豆粕粉10～20%组成。

一种耐热链霉菌发酵生产乙酰异戊酰泰乐菌素的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述的种子培养基组成为：

葡萄糖20～30g/L、可溶性淀粉5～7g/L、豆粉25～30g/L、酵母粉15～20g/L、玉米浆30～40ml/L、硫酸铵或硝酸铵6～8g/L、磷酸二氢钾2～3g/L、硫酸镁3～5g/L、有机硅0.1～0.2ml/L；

所述发酵培养基组成为：

豆油或玉米油或菜籽油10～15g/L、玉米淀粉或小麦淀粉或甘薯淀粉20～30g/L、低温黄豆饼粉5～10g/L、配方鱼粉20～30g/L、花生饼粉15～20g/L、酵母粉8～10g/L、硫酸铵或硝酸铵3～4g/L、磷酸二氢钾3～4g/L、硫酸镁4～6g/L、硫酸锌0.01～0.03g/L、氯化铁0.06～0.08g/L、氯化钴0.001～0.003g/L和聚醚改性硅0.1～0.2ml/L，其中配方鱼粉是由鱼粉70～75%、骨粉10～15%和豆粕粉10～20%组成。

采用上述培养基发酵生产乙酰异戊酰泰乐菌素的方法，其特征在于其工艺步骤为：首先将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，至菌体浓度30～40%时全部移入发酵罐进行发酵培养，发酵培养过程中每6～8h取样检测发酵效价，待前、后检测的发酵单位相差在500u/ml以内、发酵单位在23000u/ml以上时停止发酵。

所述耐热链霉菌母瓶发酵液的接种量控制在种子培养基体积的15～20％。

所述种子培养条件为：罐压0.05～0.06MPa；罐温32～34℃；空气流量：0～20h，20～30m³/h；20h～移种：50～60m³/h；搅拌转速100r/min；pH6.8～8.2。

7、按照权利要求4所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为：

1) pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.5～7.5，发酵过程中pH控制在7～8；

   2）温度：采用变温控制方法，其中发酵培养0～60h，培养温度控制在30～31℃，发酵培养60～100h，培养温度控制在31～32℃，发酵培养100h～发酵结束，培养温度控制在30～31℃；

   3）搅拌转速：90～130r/min；

   4）压力控制：罐压0.05～0.06MPa；

   5）空气流量：发酵培养0～60h，空气流量控制在150～200m³/h；发酵培养60～100h，空气流量控制在300～400m³/h；发酵培养100h～发酵结束，空气流量控制在250～300m³/h。

在发酵过程中采用流加法进行补料，包括补葡萄糖、补水、补酒石酸泰乐菌素、补亮氨酸、补入磷酸盐和补甘油。

所述补葡萄糖工艺控制为：

发酵前40h不用进行补糖；

发酵时间在40～80h，如果总糖含量低于30g/L，补入20%的葡萄糖，控制总糖含量为30～50g/L；

发酵时间在80～130h，如果总糖含量低于10%，补入20%的葡萄糖，控制总糖含量为10～20g/L；

发酵时间在130h～发酵结束，停止补糖。

所述补水工艺控制为： 

发酵前40h不用进行补水；

发酵时间在40～100h，如果菌体浓度高于50%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～50%；

发酵时间在100～130h，如果菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在30～40%；

发酵时间在130h～发酵结束，停止补水。

所述补酒石酸泰乐菌素工艺控制为： 

 发酵前20h不用补入酒石酸泰乐菌素精制液；

发酵时间在20～135h，先补入酒石酸泰乐菌素精制液，控制其在发酵液中的含量10～15%，发酵过程中，每隔4～6ｈ检测其含量，当含量低于10%，补加酒石酸泰乐菌素，维持其浓度，补料过程中，pH控制在6.5～7.5； 

上述酒石酸泰乐菌素精制液，为经0.2um规格的滤芯过滤除菌。

所述补亮氨酸工艺控制为：

发酵前40h不用补入亮氨酸；

发酵时间在40h、90h、120h、130h，分别补入0.05～0.1%的亮氨酸，其补入量为发酵液体积的0.1～0.3%。

所述补磷酸盐工艺控制为：

发酵前40h不用补入磷酸盐；

发酵时间在40h、90h、120h、130h，分别补入磷酸盐，其补入量为发酵液体积的0.02～0.03%；

上述磷酸盐为磷酸钾盐或磷酸铵盐，其浓度控制在0.03mmol/L。

所述补甘油工艺控制为：

发酵时间在40h时补入已灭菌的甘油，其补入量为发酵液体积的0.02～0.03%；

发酵时间在90h、120h时分别补入已灭菌的甘油，其补入量为发酵液体积的1.2～1.4%。

   本发明的技术优势：

1 本发明确认了种子培养基、发酵培养基C/N最佳配伍比例，细化影响其发酵水平的关键物料。

2 本发明对种子培养、发酵培养和补料控制等生产工艺进行了详细的阐述，明确了工艺控制参数，确认了最佳的发酵工艺路线。

3 本发明中乙酰异戊酰泰乐菌素发酵水平达到23000～25000ug/ml以上，同常规发酵水平15000～20000ug/ml相对比，发酵单位提高了15%；发酵周期低于常规的发酵水平，其生产周期控制在140h，同常规发酵工艺相比，生产周期缩短30%，提高了生产效率，达到节能降耗的目的。

4 本发明适用于乙酰异戊酰泰乐菌素工业化大生产，能够满足年产1000吨以上的技术需求。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例的菌种选用耐热链霉菌：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量：pH6～8，摇瓶发酵单位5000～10000u/ml。

实施例1

    种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中加入玉米淀粉20kg、豆粉25kg、酵母粉15kg、玉米浆30L、硫酸铵6kg、磷酸二氢钾2kg、硫酸镁3kg、有机硅0.1L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入豆油100kg、玉米淀粉200kg、低温黄豆饼粉50kg、配方鱼粉200kg，花生饼粉150kg、酵母粉80kg、硫酸铵30kg、磷酸二氢钾30kg；硫酸镁40kg、硫酸锌0.1kg、氯化铁0.6kg、氯化钴0.01kg；聚醚改性硅1L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉140kg、骨粉20kg和豆粕粉40kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量100L。种子培养条件为罐压0.05MPa、罐温32℃、空气流量：0～20h，2m³/h；20h～移种：5m³/h；搅拌转速100r/min；种子培养结束，pH为7.1；菌体浓度为31.8%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.7；采用变温控制方法，0～60h：培养温度30℃；60～100h：培养温度31℃；100h～发酵结束：培养温度30℃；搅拌转速：90r/min；罐压0.05MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；空气流量：0～60h：15m³/h；60～100h：30m³/h；100h～发酵结束：25m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间140h；发酵单位在23824ug/ml。

实施例2

    种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中加入小麦淀粉22kg、豆粉28kg、酵母粉17kg、玉米浆35L、硝酸铵7kg、磷酸二氢钾2.5kg、硫酸镁4kg、有机硅0.15L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入玉米油120kg、小麦淀粉250kg、低温黄豆饼粉75kg、配方鱼粉250kg，花生饼粉180kg、酵母粉90kg、硝酸铵35kg、磷酸二氢钾35kg；硫酸镁50kg、硫酸锌0.2kg、氯化铁0.7kg、氯化钴0.02kg；聚醚改性硅1.5L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉180kg、骨粉25kg和豆粕粉45kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量150L。种子培养条件为罐压0.055MPa、罐温33℃、空气流量：0～20h，2.5m³/h；20h～移种：5.5m³/h；搅拌转速100r/min；种子培养结束，pH为7.3；菌体浓度为35.3%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.9；采用变温控制方法，0～60h：培养温度30.5℃；60～100h：培养温度31.5℃；100h～发酵结束：培养温度30.5℃；搅拌转速：110r/min；罐压0.055MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；空气流量：0～60h：18m³/h；60～100h：35m³/h；100h～发酵结束：28m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间144h；发酵单位在24341ug/ml。

实施例3

    种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中加入甘薯淀粉25kg、豆粉30kg、酵母粉20kg、玉米浆40L、硫酸铵8kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸镁5kg、有机硅0.2L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入菜籽油150kg、甘薯淀粉300kg、低温黄豆饼粉100kg、配方鱼粉300kg，花生饼粉200kg、酵母粉100kg、硝酸铵40kg、磷酸二氢钾40kg；硫酸镁60kg、硫酸锌0.3kg、氯化铁0.8kg、氯化钴0.03kg；聚醚改性硅2L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉220kg、骨粉33kg和豆粕粉47kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量200L。种子培养条件为罐压0.06MPa、罐温34℃、空气流量：0～20h，3m³/h；20h～移种：6m³/h；搅拌转速100r/min；种子培养结束，pH为7.2；菌体浓度为38.7%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

    发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.6；采用变温控制方法，0～60h：培养温度31℃；60～100h：培养温度32℃；100h～发酵结束：培养温度31℃；搅拌转速：130r/min；罐压0.06MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；空气流量：0～60h：20m³/h；60～100h：40m³/h；100h～发酵结束：30m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间147h；发酵单位在24297ug/ml。

实施例4

种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中加入可溶性淀粉15kg、豆粉25kg、酵母粉15kg、玉米浆30kg、硫酸铵6kg、磷酸二氢钾2kg、硫酸镁3kg、有机硅0.1L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入豆油100kg、玉米淀粉200kg、低温黄豆饼粉50kg、配方鱼粉200kg，花生饼粉150kg、酵母粉80kg、硫酸铵30kg、磷酸二氢钾30kg；硫酸镁40kg、硫酸锌0.1kg、氯化铁0.6kg、氯化钴0.01kg；聚醚改性硅1L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉150kg、骨粉25kg和豆粕粉25kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量100L。 种子培养条件为罐压0.05MPa、罐温32℃、空气流量：0～20h，2m³/h；20h～移种：5m³/h；搅拌转速100r/min。种子培养结束，pH为6.8；菌体浓度32.3%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.7；采用变温控制方法，0～60h：培养温度30℃；60～100h：培养温度31℃；100h～发酵结束：培养温度30℃；搅拌转速：90r/min；罐压0.05MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；空气流量：0～60h：15m³/h；60～100h：30m³/h；100h～发酵结束：25m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间140h；发酵单位在24391ug/ml。

实施例5

种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中加入可溶性淀粉18kg、豆粉27kg、酵母粉17kg、玉米浆35kg、硝酸铵7kg、磷酸二氢钾2.5kg、硫酸镁4kg、有机硅0.15L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入玉米油125kg、小麦淀粉250kg、低温黄豆饼粉70kg、配方鱼粉250kg，花生饼粉180kg、酵母粉90kg、硝酸铵35kg、磷酸二氢钾35kg；硫酸镁50kg、硫酸锌0.2kg、氯化铁0.7kg、氯化钴0.02kg；聚醚改性硅1.5L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉185kg、骨粉39kg和豆粕粉26kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量150L。 种子培养条件为罐压0.055MPa、罐温33℃、空气流量：0～20h，2.5m³/h；20h～移种：5.5m³/h；搅拌转速100r/min。种子培养结束，pH为7；菌体浓度35.4%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.6；采用变温控制方法，0～60h：培养温度30.5℃；60～100h：培养温度31.5℃；100h～发酵结束：培养温度30.5℃；搅拌转速：110r/min；罐压0.055MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；空气流量：0～60h：18m³/h；60～100h：35m³/h；100h～发酵结束：27m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间140h；发酵单位在24305ug/ml。

实施例6

种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中加入可溶性淀粉20kg、豆粉30kg、酵母粉20kg、玉米浆40kg、硫酸铵8kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸镁5kg、有机硅0.2L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入菜籽油150kg、甘薯淀粉300kg、低温黄豆饼粉100kg、配方鱼粉300kg，花生饼粉200kg、酵母粉100kg、硫酸铵40kg、磷酸二氢钾40kg；硫酸镁60kg、硫酸锌0.3kg、氯化铁0.8kg、氯化钴0.03kg；聚醚改性硅2L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉220kg、骨粉40kg和豆粕粉60kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量200L。 种子培养条件为罐压0.06MPa、罐温34℃、空气流量：0～20h，3m³/h；20h～移种：6m³/h；搅拌转速100r/min。种子培养结束，pH为7.3；菌体浓度38.7%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.8；采用变温控制方法，0～60h：培养温度31℃；60～100h：培养温度32℃；100h～发酵结束：培养温度31℃；搅拌转速：130r/min；罐压0.06MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；空气流量：0～60h：20m³/h；60～100h：40m³/h；100h～发酵结束：30m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间140h；发酵单位在24426ug/ml。

实施例7

     种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中种子罐中加入葡萄糖20kg，可溶性淀粉5kg，豆粉25kg、酵母粉15kg、玉米浆30L、硫酸铵6kg、磷酸二氢钾2kg、硫酸镁3kg、有机硅0.1L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入豆油100kg、玉米淀粉200kg、低温黄豆饼粉50kg、配方鱼粉200kg，花生饼粉150kg、酵母粉80kg、硫酸铵30kg、磷酸二氢钾30kg；硫酸镁40kg、硫酸锌0.1kg、氯化铁0.6kg、氯化钴0.01kg；聚醚改性硅1L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉140kg、骨粉30kg和豆粕粉30kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量100L。 种子培养条件为罐压0.05MPa、罐温32℃、空气流量：0～20h，2m³/h；20h～移种：5m³/h；搅拌转速100r/min；种子培养结束，pH6.8；菌体浓度32.7%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.7；采用变温控制方法，0～60h：培养温度30℃；60～100h：培养温度31℃；100h～发酵结束：培养温度30℃；搅拌转速：90r/min；罐压0.05MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；发酵过程中进行菌检，空气流量：0～60h：15m³/h；60～100h：30m³/h；100h～发酵结束：25m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间140h；发酵单位在23843ug/ml。

实施例8

     种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中种子罐中加入葡萄糖25kg，可溶性淀粉6kg，豆粉27kg、酵母粉18kg、玉米浆35L、硝酸铵7kg、磷酸二氢钾2.5kg、硫酸镁4kg、有机硅0.15L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入玉米油120kg、小麦淀粉250kg、低温黄豆饼粉70kg、配方鱼粉250kg，花生饼粉180kg、酵母粉90kg、硝酸铵35kg、磷酸二氢钾35kg；硫酸镁50kg、硫酸锌0.2kg、氯化铁0.7kg、氯化钴0.02kg；聚醚改性硅1.5L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉180kg、骨粉30kg和豆粕粉40kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量150L。 种子培养条件为罐压0.055MPa、罐温33℃、空气流量：0～20h，2.5m³/h；20h～移种：5.5m³/h；搅拌转速100r/min；种子培养结束，pH7.1；菌体浓度34.6%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.5；采用变温控制方法，0～60h：培养温度30.5℃；60～100h：培养温度31.5℃；100h～发酵结束：培养温度30.5℃；搅拌转速：110r/min；罐压0.055MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；发酵过程中进行菌检，空气流量：0～60h：18m³/h；60～100h：35m³/h；100h～发酵结束：27m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间145h；发酵单位在24095ug/ml。

实施例9

     种子培养基配制过程：在1.5m³种子罐中种子罐中加入葡萄糖30kg，可溶性淀粉7kg，豆粉30kg、酵母粉20kg、玉米浆40L、硝酸铵8kg、磷酸二氢钾3kg、硫酸镁5kg、有机硅0.2L，种子液体积为1m³。

发酵培养基配制过程：在15m³发酵罐中加入菜籽油120kg、甘薯淀粉250kg、低温黄豆饼粉100kg、配方鱼粉300kg，花生饼粉200kg、酵母粉100kg、硫酸铵40kg、磷酸二氢钾40kg；硫酸镁60kg、硫酸锌0.3kg、氯化铁0.8kg、氯化钴0.03kg；聚醚改性硅2L，发酵液体积为10m³。其中配方鱼粉按照鱼粉220kg、骨粉40kg和豆粕粉40kg配制。

将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的耐热链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量200L。 种子培养条件为罐压0.06MPa、罐温34℃、空气流量：0～20h，3m³/h；20h～移种：6m³/h；搅拌转速100r/min；种子培养结束，pH7；菌体浓度37.6%。

发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养，发酵液体积为11m³。

发酵培养条件为灭菌后pH控制在6.7；采用变温控制方法，0～60h：培养温度31℃；60～100h：培养温度32℃；100h～发酵结束：培养温度331℃；搅拌转速：130r/min；罐压0.06MPa；发酵过程中，pH控制在5.5～6.5；发酵过程中进行菌检，空气流量：0～60h：20m³/h；60～100h：40m³/h；100h～发酵结束：30m³/h。发酵过程中采用流加法进行补料，补入糖、水、酒石酸泰乐菌素精致液、亮氨酸、磷酸盐和甘油。培养时间147h；发酵单位在24257ug/ml。

上述实施例1-5中补料控制按照下述方式实现：

1、补葡萄糖工艺控制：发酵前40h不用进行补糖。发酵时间在40～80h，如果总糖含量低于30g/L。补入20%的葡萄糖，控制总糖含量为30～50g/L。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。发酵时间在80～130h，如果总糖含量低于10%。补入20%的葡萄糖，控制总糖含量为10～20g/L。每隔6h检测发酵液总糖含量。发酵时间在130h～发酵结束，停止补糖。

2、补水工艺控制：发酵过程中，按照工艺要求必须定时补入一定量的水，其目的是控制发酵液的粘度和菌体浓度，有利于代谢产物的生成。发酵前40h不用进行补水。发酵时间在40～100h，如果菌体浓度高于50%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～50%。每隔6h检测发酵液菌体浓度。发酵时间在100～130h，如果菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在30～40%，每隔6h检测发酵液菌体浓度。发酵时间在130h～发酵结束，停止补水。

3、补酒石酸泰乐菌素工艺控制：选用酒石酸泰乐菌素精制液，经0.2um规格的滤芯过滤除菌。发酵前20h不用补入酒石酸泰乐菌素精制液。发酵时间在20～135h，补入酒石酸泰乐菌素精制液。补料过程中，pH控制在6.5～7.5。发酵时间在135h～发酵结束，停止补入酒石酸泰乐菌素精制液。

4、补入亮氨酸工艺控制：发酵前40h不用补入亮氨酸。发酵时间在40h、90h、120h、130h，分别补入0.05～0.1%的亮氨酸，其补入量为发酵液体积的0.1～0.3%。

5、补入磷酸盐：包括磷酸钾盐或磷酸铵盐，其浓度控制在0.03mmol/L。发酵前40h不用补入磷酸盐。发酵时间在40h、90h、120h、130h，分别补入磷酸盐，其补入量为发酵液体积的0.02～0.03%。

6、补甘油工艺控制：发酵时间在40h补入已灭菌的甘油，其补入量为发酵液体积的0.02～0.03%。发酵时间在90h、120h分别补入已灭菌的甘油，其补入量为发酵液体积的1.2～1.4%。