可调多激光脉冲扫描显微镜和操作该显微镜的方法

摘要

描述了一种可调多激光脉冲扫描显微镜及操作该显微镜的方法，使用两个不同波长的脉冲激光光束同时地或以特定的时间延迟来照射待测样本上的扫描点。显微镜包括发射不同波长的激光的至少两个脉冲激光光源，用于调节至少一个激光脉冲的声光可调滤波器（AOTF），设置在声光可调滤波器上游的延迟台，以及用于基于时间延迟移动延迟台的致动器。从而，至少一种脉冲的波长被调节且至少两个不同波长的脉冲之间的延迟被调节。

说明书

背景技术

应用脉冲激光光束的显微镜在本领域是已知的，特别地是使用两个或 多个不同波长的脉冲激光光束的共焦显微镜。这两个或多个激光脉冲被临 时地空间同步化，但波长不同。基于特定类型的显微镜，激光脉冲或者同 时地到达待测样本上的特定扫描点，或者不同波长的激光脉冲之间间隔特 定的时间延迟到达该特定扫描点。应用两个不同激光脉冲的显微镜比如为 相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜，受激拉曼散射（SRS）显微镜， 拉曼感应科尔效应散射（RIKES）显微镜，和频振荡（SFG）显微镜以及 受激发射损耗（STED）显微镜。应用三个不同的波长以明显的预定义的 时间延迟或相重叠地照射样本的显微镜比如为非退化反斯托克斯拉曼散 射（CARS）显微镜。

对于这些类型的显微镜的不同的应用，期望的是从一个或多个不同波 长的激光脉冲中选出透射的波长。已知有使用声光可调滤波器（AOTF） 来选择波长。将射频应用至透射特定波长的激光脉冲的AOTF晶体，通过 改变射频，仅有与该特定、改变的射频相关的特定波长的激光被晶体透射。

AOTFs的一个特性是通过AOTF的不同中心波长的激光脉冲将经历 不同的时间延迟，即这些光以不同的速度通过AOTF。换句话说，不同波 长的两个激光脉冲具有不同的有效折射率，因而在不同的时间离开AOTF。 “离散（walk-off）”的时间量基于两个激光光束的波长差。对于上述的显 微镜，两个或多个脉冲激光光束需要以给定的时间延迟或时间重叠到达样 本，以生成强的信号。该时间延迟可以是零或者非零，但对于每一特定应 用该值都是特定的。波长差在几纳米至几百纳米的范围之间。调节至少一 个波长会导致脉冲之间时间延迟发生变化，因而如果所引起的时间延迟非 最佳，则会导致非最佳的成像。

发明内容

本发明的目的是提供可调多激光脉冲扫描显微镜，其允许调节至少一 个激光脉冲的波长，且允许调节不同波长的两个激光脉冲之间的特定时间 延迟。该时间延迟可为零或非零。

本发明的另一目的是提供一种用于操作上述可调多激光脉冲扫描显 微镜的方法，从而调节至少一个激光脉冲的波长，且将两个激光脉冲之间 的时间延迟调节至一特定值。基于特定类型的显微镜和应用，该时间延迟 可为零或非零。

根据本发明，借由一可调多激光脉冲扫描显微镜来实现上述目的，其 使用两个不同波长的脉冲激光光束以同时或以特定的时间延迟来照射待 测样本上的扫描点，该显微镜包括：提供第一不同波长的第一激光脉冲的 第一脉冲激光光源；提供第二不同波长的第二激光脉冲的第二脉冲激光光 源；声光可调滤波器（AOTF），用于调节第一和第二激光脉冲中的至少一 个；在声光可调滤波器上游的延迟台，用于延迟第一和第二激光脉冲中的 至少一个；在声光可调滤波器下游探测第一和第二激光脉冲之间的时间延 迟的延迟探测器；致动器，用于基于延迟探测器所探测的时间延迟来移动 延迟台。

根据用于操作本发明的显微镜的本发明的第一方法，该方法包括：打 开第一和第二脉冲激光光源；将第一和第二激光脉冲中之一的波长调节至 期望的波长；使用延迟探测器探测第一和第二激光脉冲之间的时间延迟并 生成表示该时间延迟的延迟信号；处理该延迟信号以生成用于移动延迟台 的控制信号；根据控制信号移动延迟台；以及对样本进行成像。

可以理解，本发明并不仅限于两个不同波长的脉冲，还可应用于三个 或更多的波长。应用三个不同的波长以明显的预定义的时间延迟照射样本 的显微镜比如为非退化相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜。为此， 显微镜可包含两个延迟台和三个激光光源。这三个激光光源并不必然需要 有三个不同的激光器，也可由一个或两个激光器结合一个或多个将发射的 激光分离成闲频信号和信号波长的光学参量振荡器来制造这三个激光光 源。根据本发明，用于操作包含有三个不同波长的激光脉冲的显微镜的方 法包括打开第一和第二脉冲激光光源并关闭第三脉冲激光光源；将第二激 光脉冲的波长调节至期望的波长；使用延迟探测器探测第一和第二激光脉 冲之间的时间延迟并生成表示该时间延迟的第一延迟信号；处理该第一延 迟信号以生成用于移动第一延迟台的第一控制信号；根据第一控制信号移 动第一延迟台；打开第一和第三脉冲激光光源并关闭第二脉冲激光光源； 将第三激光脉冲的波长调节至期望的波长；使用延迟探测器探测第一和第 三激光脉冲之间的时间延迟并生成表示该时间延迟的第二延迟信号；处理 该第二延迟信号以生成用于移动第二延迟台的第二控制信号；根据第二控 制信号移动第二延迟台；以及打开第一、第二和第三脉冲激光光源以对样 本进行成像。

该方法可类推至四个或更多不同波长的激光脉冲，例如，在第一步骤 中，打开激光光源1和2、关闭激光光源3和4，随后打开激光光源1和3、 关闭激光光源2和4，此后再打开激光光源1和4、关闭激光光源2和3。 如果使用TPA探测器测量激光脉冲之间的时间延迟，则仅需要一个TPA 探测器，其可探测上述连续步骤中第一激光光源和其它激光光源之间的各 个时间延迟。在所有延迟台的位置被设定后再进行成像，在具有4个激光 光源的该例中，是在3个延迟台的位置被设定后再进行成像。

调节一个或多个延迟台的位置的最简单的方法是在监视显微样本的 成像质量时手动地移动该台。然而，通过测量脉冲之间的延迟并根据可从 查询表读取的位置来调节延迟台的位置，可获得更好的性能。该表包含相 关参数，例如，调节脉冲的波长，应用的显微镜类型以及AOTF的特性。 可选地，对一组特定的波长执行测量，对其它波长则是计算并调节其特征 延迟。

另外，延迟台可以是机动的，且可提供控制以基于延迟探测器所探测 的时间延迟对机动的延迟台进行控制。控制单元接收来自TPA探测器的延 迟信号并生成用于移动延迟台的控制信号，其引起了被TPA探测器再次探 测的另一时间延迟，而该时间延迟则再次使得控制单元生成控制信号，该 控制信号被传输至延迟台的驱动机构，因而通过测量此时再次调节的时间 延迟引起了另一反馈，等等，因此甚至实现了闭环控制。控制单元可以是 一个简单的CPU或商用个人电脑PC。除了TPA探测器的其它探测器也是 可用的，但TPA探测器对超速激光应用是特别合适的，其性价比高且耐用， 特别是设计作为基于LED的TPA探测器。

通过在声光可调滤波器下游的、且提取部分光束至延迟探测器的分束 器向TPA探测器提供激光脉冲的选出的样本。优选地，该分束器从声光可 调滤波器的下游转移第一和第二激光脉冲约5%的光强至延迟探测器，并 允许95%的光强入射至样本用于对其进行成像。为恰当地探测激光脉冲之 间的时间延迟，提取的5%的光强量即是充足的，但提取出1%至10%之间 的任一光强量皆可行，即，虽然较低百分比的光强即已足够，但同样接受 并可使用较高的光强。

第一脉冲激光光源包括第一激光器，第二脉冲激光光源包括第二激 光。优选地，这些激光光源被设计为发射预啁啾激光光束。可选地，第一 和第二脉冲激光光源可包括一泵浦激光，其结合一光学参量振荡器以将泵 浦激光转换成不同波长的第一和第二激光脉冲。鉴于仅需一台激光器、节 省了用于第二激光的成本且将失败的风险降低至一台激光器，因而后者特 别地耐用且性价比高。

根据另一优选实施例，第一二向色装置是在延迟台的上游空间地分离 第一和第二激光脉冲；第二二向色装置是在延迟台的下游再次合并第一和 第二激光脉冲。根据本发明的实施例，仅由一种类型的激光脉冲，例如第 一激光脉冲被AOTF透射且调节，而另一激光脉冲，例如第二激光脉冲整 个绕过AOTF并在AOTF的下游与第一激光脉冲再次空间地合并。因而， 声光可调滤波器是单通道声光可调滤波器，第一和第二激光脉冲中仅有一 个透射穿过该声光可调滤波器。可选地，声光可调滤波器是多通道声光可 调滤波器，第一和第二激光脉冲皆可透射穿过该声光可调滤波器。

优选地，根据本发明的可调多激光脉冲扫描显微镜是共焦显微镜，但 本发明同样适用于其他类型的显微镜，例如线扫描显微镜。特别地对于共 焦显微镜，优选地应用形式为相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜， 受激拉曼散射（SRS）显微镜，拉曼感应科尔效应散射（RIKES）显微镜， 和频振荡（SFG）显微镜以及受激发射损耗（STED）显微镜。

附图说明

图1示意性地示出本发明的第一实施例，其中手动地调节延迟台。

图2示意性地示出本发明的第二实施例，其中受控地调节延迟台。

图3示意性地示出本发明的第三实施例，其中受控地调节延迟台，且 仅包含一个具有两个输出波长的激光光源。

图4示意性地示出本发明的第四实施例，其中手动地调节延迟台，且 仅有一个波长被AOTF透射且调节。

具体实施方式

图1示出本发明第一实施例的基本设计。该实施例包括第一激光器1 和第二激光器2。两个激光器优选地皆为脉冲激光器，但同样可以采用连 续激光器，其合并脉冲发生器以将连续激光转换成脉冲激光。第一激光器 1发射的激光具有第一波长，第二激光器2发射的激光具有与第一波长不 同的第二波长。第一激光器发射的激光的光路由附图标记3示出，第二激 光器发射的激光的光路由附图标记4示出。光路3和4可与AOTF8的光 轴7一致，或可如图1所示偏离光轴7并被平面镜5和6反射以在进入所 述AOTF之前与光轴7一致。在该实施例中，AOTF被设计为多通道AOTF， 其透射来自第一激光器1和第二激光器2的激光。第二激光器2发射的激 光脉冲在AOTF的输入侧由附图标记9示出，在AOTF的输出侧由附图标 记10示出，且输入和输出都发生在AOTF的光轴7上。

并行地，第一激光器沿光路3发出激光脉冲，被平面镜11反射至可 如箭头13所示前后移动的延迟台12。延迟台12包括反射元件14，在该 实施例中其包含彼此之间成90度的两个反射表面15和16。这使得入射在 表面15上的光束被反射至反射表面16，并被反射表面16反射成相反的方 向，产生了横向偏移但平行于入射至反射表面15的光束。沿着箭头13移 动延迟台可延长或缩短第一激光器1和AOTF之间的整个光程，因而使得 源自第一激光器1的激光脉冲延迟到达。如果该整个光程延长了，则激光 脉冲较迟地到达AOTF，如果缩短则较早地到达。二向色装置20合并来自 延迟台12的光路和来自平面镜6的光路，其允许来自平面镜6并源自激 光器2的激光脉冲透过二向色装置20，而源自第一激光器1并来自延迟台 12的激光脉冲被反射90度至光路7。

在示意性示出的实施例中，为展示延迟台12的功能，调节延迟台12 的位置从而来自第一激光器1的激光脉冲17与源自第一激光器1的激光 脉冲9同时到达AOTF8的输入侧。由于激光脉冲9和激光脉冲17的波长 不同，因而以不同的速度传播通过AOTF8，因此根据该实施例，来自第一 激光器1的激光的激光脉冲18比源自第二激光器2的激光脉冲10更早地 到达AOTF的输出侧。来自第二激光器2的结果激光脉冲10和来自第一 激光器1的结果激光脉冲18之间的时间延迟由△t示出。激光脉冲10和 18都入射在样本19上。为了生成样本19的全像，如本领域已知的，根据 典型扫描显微镜那样对样本进行扫描，例如共焦扫描显微镜。

基于特定的显微镜，例如相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜、 受激拉曼散射（SRS）显微镜、拉曼感应科尔效应散射（RIKES）显微镜、 和频振荡（SFG）显微镜以及受激发射损耗（STED）显微镜，且基于特定 应用的参数，例如波长或两个不同脉冲之间的波长差，一特定的时间差和 两个脉冲之间的△t产生出最佳的成像结果。基于上述因素的最佳时间差 可为零或非零，但无论如何为一特定值。调节△t的最简单的机构是允许 沿箭头13手动地移动延迟台12的机构，例如采用可旋转的调节旋钮，其 基于旋转调节旋钮驱动移动延迟台12的传动装置。在调节延迟台12的位 置时，通过观察成像可获得延迟台12的最佳位置。可选地，使用独立的 外部探测器测量延迟△t，并从基于特定应用参数的表中读取延迟台的最佳 位置。随后可手动地调节延迟台，将其位置调节至从查询表中读出的位置。 可选地，以开环控制的方式使用动力致动器进行调节。

附图2展示了对延迟台12的调节进行改进的实施例。除附图1示出 的实施例以外，附图2中的实施例还包含延迟探测器21。在该特殊实施例 中，延迟探测器21设计为基于LED的双光子吸收探测器，通常缩写为TPA。 也可以使用其它类型的探测器，但TPA探测器具有简单、便宜的优点且可 使用用于超快激光应用的耐用且性价比高的自相关器的结构。TPA探测器 可探测激光脉冲10和18之间的延迟△t，生成表示延迟△t的信号，并通 过延迟信号线23将该信号发送至控制单元22。控制单元22可以是能够处 理通过延迟信号线23输入的延迟信号、且通过控制信号线24输出控制信 号的任何控制单元。延迟台12可以是机动的，例如使用结合有适当传动 机构的步进马达来移动延迟台，这里由啮合齿条26的齿轮25示出。其他 合适的驱动机构可包括蜗轮。

通过具有5%的反射率和95%的透射率,通常称为95%(T)-5%(R)的分束 器27将样本激光脉冲传输至TPA探测器，其在AOTF8的下游将激光脉冲 10和18光强的5%转移至TPA探测器21。TPA探测器仅探测脉冲10和 18之间的时间延迟△t，因此仅需相对较低的光强。附图2示出的实施例 允许闭环控制且可微调作为反馈至闭环控制环的控制变量的延迟△t。控制 单元22可为简单的中央处理单元CPU，或商用个人电脑PC，其被配置为 执行期望的控制步骤。为了进行控制，可在PC中预存储校准表，以查询 相应于波长和可调激光光源的延迟台的最佳位置。通常，对于AOTF的特 定模型仅需实施一次校准程序并构成AOTF晶体的群延迟（group delay） 特性。如果群延迟特性是已知的，则该步骤完全可以避免，不需执行校准 程序即可在校准表中存储适当的数据。

附图3示出附图2所示出的实施例的变型，设法仅使用一个激光器1。 激光器1发射的激光被光学参量振荡器36分离成两个不同波长的激光脉 冲，光学参量振荡器36将发射的激光分离成具有“闲频”波长的激光和 具有“信号”波长的激光。使用二向色装置28将这两个不同波长的激光 脉冲空间地分离。平面镜29、30和31将相应于“信号”波长的脉冲组引 导至将空间分离的脉冲再次合并的二向色装置32，同时在再合并二向色装 置32的上游，平面镜33将对应于闲频波长的另外的脉冲组引导至延迟台 12，随后上述二向色装置32将其再次合并。布置另外的平面镜34和35 将这两个激光脉冲沿相同的光路引导至AOTF8。其他元件与附图2中示出 的实施例相同，包括分束器27、TPA探测器21、延迟线23、控制单元22 和控制信号线24。为保持抽样，附图3中省略了驱动激动延迟台12的驱 动机构元件，可以理解其与附图2中示出的实施例相同。

附图4示出上述实施例的另一变型，为简化示出了附图1的实施例的 变型。然而可以理解，包含有结合控制的机动延迟台12的附图2和3的 实施例可应用同样的变型。在附图4示出的实施例中，第一激光器1产生 的激光脉冲沿与附图1的实施例完全相同的光路经过延迟台12进入 AOTF8。而第二激光器产生的激光脉冲并未被引导穿过AOTF8，而是在 AOTF8的下游与源自第一激光器1的未调节脉冲、且当时已被AOTF8调 节的调节输出脉冲再次合并。这种情况下，使用平面镜37和二向色装置 38完成再合并，其中后者在AOTF8的下游将激光脉冲10和18再次合并。 该实施例中，其中仅调节一个波长，即源自第一激光器1的激光脉冲，由 于仅需知道AOTF8的参数比如基于特定应用和基于波长的激光传播通过 AOTF8的速度，可基于调节的激光脉冲的波长预存储延迟台的位置，因而 可特别容易地实施控制。这种情况下，甚至无需闭环反馈控制，由于用于 确定最佳延迟的所有参数都是已知的，因而简单的开环控制即已足够。

附图标记列表

1 第一激光器

2 第二激光器

3 第一激光的光路

4 第二激光的光路

5 平面镜

6 平面镜

7 光轴

8 AOTF

9 在AOTF输入侧的激光脉冲

10 在AOTF输出侧的激光脉冲

11 平面镜

12 延迟台

13 箭头

14 反射元件

15 反射表面

16 反射表面

17 在AOTF输入侧的激光脉冲

18 在AOTF输出侧的激光脉冲

19 样本

20 二向色装置

21 延迟探测器

22 控制单元

23 延迟信号线

24 控制信号线

25 齿轮

26 齿条

27 分束器

28 二向色装置

29 平面镜

30 平面镜

31 平面镜

32 二向色装置

33 平面镜

34 平面镜

35 平面镜

36 光学参量振荡器

37 平面镜

38 二向色装置