作为脯氨酰羟化酶抑制剂的4-氨基喹唑啉-2-基-1-吡唑-4-羧酸化合物

摘要

本发明描述了式(I)的氨基喹唑啉基化合物，其可用作脯氨酰羟化酶抑制剂。

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2010年8月13日提交的系列号为61/373,664的美国临时 专利申请的权益。

技术领域

本发明涉及某些氨基喹唑啉基化合物、含有它们的药物组合物，以及 使用它们处理由脯氨酰羟化酶活性介导的疾病状态、障碍和病症的方法。

背景技术

细胞通过激活涉及细胞存活、氧递送和利用、血发生、细胞代保存的 基因的转录，来对低氧作出响应。低氧诱导因子(HIF)是这些基因的主要转 录调节物(Semenza et al.，1992，Mol Cell Biol.，12(12)：5447-54(Semenza等 人，《分子与细胞生物学》1992年，第12卷第12期，第5447-5454页)； Wang et al.，1993，J Biol Chem.，268(29)：21513-18(Wang等人，《生物化学 杂志》1993年，第268卷第29期，第21513-21518页)；Wang et al.，1993， Proc Natl Acad Sci.，90：4304-08(Wang等人，《美国国家科学院院刊》1993 年，第90卷，第4304-4308页)；Wang et al.，1995，J Biol Chem.， 270(3)：1230-37(Wang等人，《生物化学杂志》1995年，第270卷第3期， 第1230-1237页))。已描述了HIF-α的三种形式：HIF-1α、HIF-2α和HIF- 3α(Scheuermann et al.，2007，Methods Enzymol.，435：3-24(Scheuermann等 人，《酶学方法》2007年，第435卷，第3-24页))。HIFα亚基与HIF-1β 配对可形成功能性异型二聚蛋白质，该蛋白质随后会募集其他转录因子如 p300和CBP(Semenza，2001，Trends Mol Med.，7(8)：345-50(Semenza，《分 子医学发展趋势》2001年，第7卷第8期，第345-350页))。

有一家族的高度保守的氧、铁和2-氧代戊二酸依赖性脯氨酰羟化酶 (PHD)通过HIF的翻译后修饰来介导细胞对低氧的响应(Ivan et al.，2001， Science，292：464-68(Ivan等人，《科学》2001年，第292卷，第464-468 页)；Jaakkola et al.，2001，Science，292：468-72(Jaakkola等人，《科学》第 2001年，第292卷，第468-472页))。在常氧条件下，PHD催化HIF当 中的两个保守脯氨酸残基的羟基化。Von Hippel Lindau(VHL)蛋白能选择性 结合羟基化的HIF。VHL的结合使HIF成为E3遍在蛋白连接酶复合体对其 进行多遍在蛋白化的靶标，并使HIF随后被26S蛋白酶体降解(Ke et al.， 2006，Mol Pharmacol.70(5)：1469-80(Ke等人，《分子药理学》2006年，第 70卷第5期，第1469-1480页)；Semenza，Sci STKE.，2007，407(cm8)：1-3 (Semenza，《信号转导知识环境》2007年，第407卷第cm8期，第1-3 页))。由于PHD对氧的亲和力在氧的生理范围内，且氧是该反应的必要 辅因子，因此当氧张力降低时PHD失活。这样，HIF在常氧条件下被快速 降解，而在低氧条件下或者当PHD被抑制时在细胞中积累。

已描述了四种PHD同种型：PHD1、PHD2、PHD3和PHD4(Epstein et al.，2001，Cell，107：43-54(Epstein等人，《细胞》2001年，第107卷，第 43-54页)；Kaelin，2005，Annu Rev Biochem.，74：115-28(Kaelin，《生物化 学年评》2005年，第74卷，第115-128页)；Schmid et al.，2004，J Cell Mol  Med.，8：423-31(Schmid等人，《细胞与分子医学期刊》2004年，第8卷， 第423-431期))。不同的同种型都得到遍在表达，但却受到差异调节，并 且在细胞对低氧的响应中具有独特的生理作用。有证据证明各种同种型对三 种不同的HIFα亚型具有不同的选择性(Epstein等人，出处同上)。就细胞 定位而言，PHD1主要定位在细胞核，PHD2主要定位在细胞质，而PHD3 似乎在细胞质和细胞核中都存在(Metzen E，et al.2003，J Cell Sci.， 116(7)：1319-26(Metzen E等人，《细胞科学杂志》2003年，第116卷第7 期，第1319-1326页))。在常氧条件下，PHD2似乎是主要的HIFα脯氨 酰羟化酶(Ivan et al.，2002.Proc Natl Acad Sci.USA，99(21)：13459-64(Ivan 等人，《美国国家科学院院刊》2002年，第99卷第21期，第13459-13464 页)；Berra et al.，2003，EMBO J.，22：4082-90(Berra等人，《欧洲分子生物 学组织杂志》2003年，第22卷，第4082-4090页))。这三种同种型具有 高度的氨基酸同源性，并且酶的活性位点高度保守。

HIF靶基因产物参与到多种生理过程和病理生理过程，包括但不限于： 红血球生成、血管发生、能量代谢的调节、血管收缩功能和细胞凋亡/增 殖。第一种被描述为HIF靶标的基因是编码促红细胞生成素(EPO)的基因 (Wang等人，1993年，出处同上)。已认识到，血液携氧能力下降会在肾 脏中被感受到，而肾脏和肝脏通过释放更多的EPO作出响应，EPO是刺激 红细胞增殖和成熟的激素。EPO对非造血细胞类型具有多种其他的重要作 用，已作为主要的组织保护性细胞因子脱颖而出(Arcasoy，2008，BrJ Haematol.，141：14-31(Arcasoy，《英国血液学杂志》2008年，第141卷， 第14-31页))。因此，现已知EPO涉及伤口愈合和血管发生以及组织对 缺血伤害的响应。大多数参与厌氧糖酵解作用的酶是由HIF靶标基因所编码 的，因此在低氧组织中糖酵解作用增加(Shaw，2006，Curr Opin Cell Biol.， 18(6)：598-608(Shaw，《细胞生物学新见》2006年，第18卷第6期，第 598-608页))。这个途径中已知的HIF靶标基因产物包括但不限于：葡萄 糖转运蛋白如GLUT-1(Ebert et al.，1995，J Biol Chem.，270(49)：29083-89 (Ebert等人，《生物化学杂志》1995年，第270卷第49期，第29083- 29089页)、参与葡萄糖向丙酮酸的降解的酶如己糖激酶和磷酸甘油酸激酶 1(Firth et al.，1994，Proc Natl Acad Sci.USA，91：6496-6500(Firth等人，《美 国国家科学院院刊》1994年，第91卷，第6496-6500页))以及乳酸脱氢 酶(Firth等人，出处同上)。HIF靶基因产物还参与细胞代谢的调节。例 如，丙酮酸脱氢酶激酶-1是一种靶标HIF基因产物，它通过籍由磷酸化作 用降低丙酮酸脱氢酶的活性来调节丙酮酸向Kreb循环中的进入(Kim et al.， 2006，Cell Metab.，3：177-85(Kim等人，《细胞代谢》2006年，第3卷，第 177-185页)；Papandreou et al.，2006，Cell Metab.，3：187-197(Papandreou等 人，《细胞代谢》2006年，第3卷，第187-197页))。HIF靶基因产物还 涉及血管发生。例如，血管内皮生长因子(VEGF)(Liu et al.，1995，Circ Res.， 77(3)：638-43(Liu等人，《循环研究》1995年，第77卷第3期，第638-643 页))是血管发生和血管生成的已知调节物。HIF靶标基因产物在血管紧张 度的调节中也起到作用，这类产物包括血红素加氧酶-1(Lee et al.，1997，J Biol Chem.，272(9)：5375-81(Lee等人，《生物化学杂志》1997年，第272 卷第9期，5375-5381页))。有多种HIF调节的基因产物如血小板衍生生 长因子(PDGF)(Yoshida et al.，2006，J Neurooncol.，76(1)：13-21(Yoshida等 人，《神经肿瘤学杂志》2006年，第76卷第1期，第13-21页))、血管 内皮生长因子(Breen，2007，J Cell Biochem.，102(6)：1358-67(Breen，《细胞 生物化学杂志》2007年，第102卷第6期，第1358-1367页))和EPO (Arcasoy，出处同上)在对创伤愈合的协同响应中也起到作用。

通过小分子对脯氨酰羟化酶(PHD)酶活性的靶向破坏在氧传感和氧分布 障碍的治疗中具有潜在实用性。例子包括但不限于：贫血；镰状细胞贫血； 周围血管性疾病；冠状动脉疾病；心力衰竭；保护组织免于在诸如心肌局部 缺血、心肌梗塞和中风的病症中发生局部缺血；保存用于移植的器官；通过 调节和/或恢复血流、氧输送和/或能量利用来治疗组织局部缺血；加速创伤 愈合，尤其是糖尿病和老年患者的创伤愈合；烧伤治疗；感染治疗；骨愈合 和骨生长。此外，预期PHD的靶向破坏可用于治疗诸如糖尿病、肥胖症、 溃疡性结肠炎、炎性肠疾病的代谢疾病以及诸如克罗恩病的相关疾病。 (Recent Patents on Inflammation&Allergy Drug Discovery，2009，3，1-16 (《最新炎症与过敏症药物发现专利》，2009年第3卷，第1-16页))。

已证实HIF是导致低氧条件下促红细胞生成素产生量增加的主要转录 因子(Wang等人，1993年，出处同上)。虽然已证明用重组人促红细胞生 成素治疗是治疗贫血的有效方法，但小分子介导的PHD抑制预期会比用促 红细胞生成素治疗有优势。具体地讲，其他HIF基因产物的功能为造血所必 需，对这些因子的调节能提高造血效率。对造血重要的HIF靶标基因产物的 例子包括：转铁蛋白(Rolfs et al.，1997，J Biol Chem.，272(32)：20055-62 (Rolfs等人，《生物化学杂志》1997年，第272卷第32期，第20055- 20062页))、转铁蛋白受体(Lok et al.，1999，J Biol Chem.，274(34)：24147- 52(Lok等人，《生物化学杂志》1999年，第274卷第34期，第24147- 24152页)；Tacchini et al.，1999，J Biol Chem.，274(34)：24142-46(Tacchini等 人，《生物化学杂志》1999年，第274卷第34期，第24142-24146页)) 和血浆铜蓝蛋白(Mukhopadhyay et al.，2000，J Biol Chem.，275(28)：21048-54 (Mukhopadhyay等人，《生物化学杂志》2000年，第275卷第28期，第 21048-21054页))。铁调素(hepcidin)表达也被HIF所抑制(Peyssonnaux et  al.，2007，J Clin Invest.，117(7)：1926-32(Peyssonnaux等人，《临床研究杂 志》2007年，第117卷第7期，第1926-1932页))，已证实PHD的小分 子抑制剂能减少铁调素产生量(Braliou et al.，2008，J Hepatol.，48：801-10 (Braliou等人，《肝脏病学杂志》2008年，第48卷，第801-810页))。 铁调素是造血所必需的铁的利用度的负调节物，因此铁调素产生量的下降预 期对贫血症的治疗有益。PHD抑制当与其他贫血症治疗法(包括补铁和/或 外源促红细胞生成素)联合使用时也是有用的。对人群中自然发生的PHD2 基因的突变的研究，为PHD抑制剂治疗贫血症的用途提供了进一步的证 据。最近两份报告已证实，在PHD2基因中存在功能异常突变的患者表现出 红血球增多现象增加和血液血红蛋白升高(Percy et al.，2007，PNAS， 103(3)：654-59(Percy等人，《美国科学院院报》2007年，第103卷第3 期，第654-659页)；Al-Sheikh et al.，2008，Blood Cells Mol Dis.，40：160-65 (Al-Sheikh等人，《血细胞、分子和疾病》2008年，第40卷，第160-165 页))。另外，已在健康志愿者和慢性肾病患者中评估了小分子PHD抑制 剂(美国专利申请US2006/0276477，2006年12月7日)。血浆促红细胞生 成素以剂量依赖性方式增加，而慢性肾病患者中血液血红蛋白浓度增加。

组织的代谢适应和保存受到局部缺血的危害。PHD抑制剂能提高可导 致出现在局部缺氧条件下有利的代谢变化的基因的表达(Semenza，2007， Biochem J.，405：1-9(Semenza，《生物化学杂志》2007年，第405卷，第1- 9页))。许多编码参与厌氧糖酵解作用的酶的基因是通过HIF调节的，通 过抑制PHD可提高糖酵解作用(Shaw，出处同上)。这个途径中已知的 HIF靶标基因包括但不限于：GLUT-1(Ebert等人，出处同上)、己糖激 酶、磷酸甘油酸激酶1、乳酸脱氢酶(Firth等人，出处同上)、丙酮酸脱氢 酶激酶-1(Kim等人，出处同上；Papandreou等人，出处同上)。丙酮酸脱 氢酶激酶-1能抑制丙酮酸进入Kreb循环。HIF介导参与线粒体中电子传递 的细胞色素的表达的转变(Fukuda et al.，2007，Cell，129(1)：111-22(Fukuda等 人，《细胞》2007年，第129卷第1期，第111-122页))。细胞色素组成 的这种变化能优化低氧条件下的ATP产生效率，减少有害的氧化磷酸化副 产物如过氧化氢和超氧化物的产生。在长时间暴露于低氧的情况下，HIF驱 动线粒体的自噬作用，导致它们的数量下降(Zhang H et al.，2008，J Biol  Chem.283：10892-10903(Zhang H等人，《生物化学杂志》2008年，第283 卷，第10892-10903页))。对长期低氧的这种适应可减少过氧化氢和超氧 化物的产生，同时细胞依赖糖酵解作用产生能量。由HIF升高产生的另一适 应性响应是细胞存活因子的上调。这些因子包括：胰岛素样生长因子(IGF) 2、IGF结合蛋白2和3(Feldser et al.，1999，Cancer Res.59：3915-18(Feldser 等人，《癌症研究》1999年，第59卷，第3915-3918页))。HIF在低氧 条件下的总积累支配着糖酵解作用的适应性上调，氧化磷酸化的下降可导致 过氧化物和超氧化物产生量下降，氧化磷酸化的优化能保护细胞免受局部缺 血损害。因此，PHD抑制剂预期可用于器官和组织移植物的保存 (Bernhardt et al.，2007，Methods Enzymol.，435：221-45(Bernhardt等人，《酶 学方法》2007年，第435卷，第221-245页))。虽然该有益效果可通过在 收获器官以供移植之前先施用PHD抑制剂来实现，但在收获之后在保藏 (例如停搏液)中或在移植后将抑制剂施用给器官/组织也会有治疗效果。

PHD抑制剂预期能有效保存组织，使其免受局部缺血和/或低氧影响。 这包括与心绞痛、心肌缺血、中风、骨骼肌缺血等有关的局部缺血/低氧。 有多种实验证据支持这样的想法，即PHD抑制和随后的HIF升高是保存局 部缺血组织的有用方法。最近，已证明局部缺血预适应(ischemic pre- conditioning)是一种依赖于HIF的现象(Cai et al.，2008，Cardiovasc Res.， 77(3)：463-70(Cai等人，《心血管研究》2008年，第77卷第3期，第463- 470页))。局部缺血预适应是一种众所周知的现象，其中短时间的低氧和/ 或局部缺血能保护组织免于随后发生更长时间的局部缺血(Murry et al.， 1986，Circulation，74(5)：1124-36；Das et al.，2008，IUBMBLife，60(4)：199-203 (Murry等人，《循环》1986年，第74卷第5期，第1124-1136页；Das等 人，《国际生物化学与分子生物联合会生命》2008年，第60卷第4期，第 199-203页))。已知局部缺血预适应在人类及实验动物中出现(Darling et  al.，2007，Basic Res Cardiol.，102(3)：274-8(Darling等人，《心脏病学基础研 究》2007年，第102卷第3期，第274-278页)；Kojima I et al.，2007，J Am  Soc Nephrol.，18：1218-26(Kojima I等人，《美国肾脏病杂志》2007年，第 18卷，第1218-1226页))。虽然预适应的想法最为人所知的是预适应在心 脏中的保护作用，但这个想法也可适用于其他组织，包括但不限于：肝脏、 骨骼肌、肝脏、肺、肾脏、肠和大脑(Pasupathy et al.，2005，Eur J Vasc  Endovasc Surg.，29：106-15(Pasupathy等人，《欧洲血管与血管内外科杂 志》2005年，第29卷，第106-115页)；Mallick et al.，2004，Dig Dis Sci.， 49(9)：1359-77(Mallick等人，《消化疾病与科学》2004年，第49卷第9 期，第1359-1377页))。在多个动物模型中已获得了PHD抑制和HIF升 高对组织的保护作用的实验证据，包括：PHD1的种系敲除赋予了对骨骼肌 的保护，使其免受局部缺血伤害(Aragonés et al.，2008，Nat Genet.， 40(2)：170-80(Aragonés等人，《自然遗传学》2008年，第40卷第2期，第 170-180页))；用siRNA使PHD2沉默保护了心脏免受局部缺血伤害 (Natarajan et al.，2006，Circ Res.，98(1)：133-40(Natarajan等人，《循环研 究》2006年，第98卷第1期，第133-140页))；通过给予一氧化碳抑制 PHD保护了心肌免受局部缺血损伤(Chin et al.，2007，Proc NatlAcad Sci. U.S.A.，104(12)：5109-14(Chin等人，《美国国家科学院院刊》2007年，第 104卷第12期，第5109-5114页))；大脑中低氧增加了对局部缺血的耐受 (Bernaudin et al.，2002，J Cereb Blood Flow Metab.，22(4)：393-403(Bernaudin 等人，《脑血流与代谢杂志》2002年，第22卷第4期，第393-403 页))。另外，PHD的小分子抑制剂在实验性中风模型中能保护大脑 (Siddiq et al.，2005，J Biol Chem.，280(50)：41732-43(Siddiq等人，《生物化 学杂志》2005年，第280卷第50期，第41732-41743页))。此外，已证 实HIF上调能保护糖尿病小鼠(在这种小鼠中结局通常较差)的心脏 (Natarajan et al.，2008，J Cardiovasc Pharmacol.，51(2)：178-187(Natarajan等 人，《心血管药理杂志》2008年，第51卷第2期，第178-187页))。这 些组织保护作用在伯格病、雷诺病和手足发绀中也可观察到。

对通过线粒体中Kreb循环进行的有氧代谢依赖性下降，和对通过PHD 抑制来产生的厌氧糖酵解的依赖性提高，这在常氧组织中可具有有益作用。 要着重指出的是，还证实PHD抑制在常氧条件下能升高HIF。因此，PHD 抑制会伴随出现HIF引发的低氧响应而产生假低氧状况，但组织供氧仍保持 正常。由PHD抑制所产生的代谢变化预期还可为糖尿病、肥胖症和相关疾 病(包括并存疾病)提供治疗范例。

综合来看，由PHD抑制所产生的一批基因表达变化可减少每单位葡萄 糖所产生的能量数量，会刺激身体燃烧更多的脂肪以保持能量平衡。糖酵解 增加的机理在上文讨论了。其他的观察结果将低氧响应与预期对糖尿病和肥 胖症治疗有益的作用关联起来。因此，众所周知在高海拔地区训练能减少体 脂肪(Armellini et al.，1997，Horm Metab Res.，29(9)：458-61(Armellini等人， 《激素代谢研究》1997年，第29卷第9期，第458-461页))。已证实低 氧和低氧模拟物如去铁胺能防止脂肪细胞分化(Lin et al.，2006，J Biol Chem.， 281(41)：30678-83(Lin等人，《生物化学杂志》2006年，第281卷第41 期，第30678-30683页)；Carrière et al.，2004，J Biol Chem.，279(39)：40462- 69(Carrière等人，《生物化学杂志》2004年，第279卷第39期，第 40462-40469页))。当恢复到常氧条件时，该作用是可逆的。在脂肪生成 的初期各阶段中抑制PHD活性，能抑制新的脂肪细胞的形成(Floyd et al.， 2007，J Cell Biochem.，101：1545-57(Floyd等人，《细胞生物化学杂志》2007 年，第101卷，第1545-1557页))。低氧、氯化钴和去铁胺升高了HIF和 抑制了PPARγ2核激素受体转录(Yun et al.，2002，Dev Cell.，2：331-41(Yun 等人，《发育细胞》2002年，第2卷，第331-341页))。由于PPARγ2是 脂肪细胞分化的重要信号，PHD抑制预期可抑制脂肪细胞分化。这些作用 被证实是通过HIF调节的基因DEC1/Stra13介导的(Yun等人，出处同 上)。

已证明PHD的小分子抑制剂在糖尿病和肥胖症的动物模型中具有有益 作用(国际专利申请公开WO2004/052284，2004年6月24日； WO2004/052285，2004年6月24日)。在小鼠膳食诱导肥胖症、db/db小鼠 模型和Zuckerfa/fa大鼠模型中证明的PHD抑制剂的作用有：血液葡萄糖浓 度下降、腹部脂肪垫和内脏脂肪垫中的脂肪物质下降、血红蛋白A1c下 降、血浆甘油三酯下降、体重下降，以及确立的疾病生物标记的变化，如肾 上腺髓质素和瘦蛋白水平增加。瘦蛋白是已知的HIF靶标基因产物 (Grosfeld et al.，2002，J Biol Chem.，277(45)：42953-57(Grosfeld等人，《生 物化学杂志》2002年，第277卷第45期，第42953-42957页))。参与脂 肪细胞中的代谢的基因产物被证明是通过PHD抑制以HIF依赖性方式调节 的(国际专利申请公开WO2004/052285，出处同上)。这些产物包括载脂 蛋白A-IV、酰基CoA硫酯酶、肉碱乙酰转移酶和胰岛素样生长因子结合蛋 白(IGFBP)-1。

PHD抑制剂预期在治疗上可作为血管生成、血管发生和动脉生成的刺 激剂使用。这些过程在局部缺血和/或低氧条件下建立或恢复对组织的血液 流动和供氧(Semenza et al.，2007，J Cell Biochem.，102：840-47(Semenza等 人，《细胞生物化学杂志》2007年，第102卷，第840-847页)；Semenza， 2007，Exp Physiol.，92(6)：988-91(Semenza，《实验生理学》2007年，第92 卷第6期，第988-991页))。在实验动物模型中和在人类中已证实身体锻 炼能增加HIF-1和血管内皮生长因子(Gustafsson et al.2001，Front Biosci.， 6：D75-89(Gustafsson等人，《生物科学前沿》2001年，第6卷，第D75-89 页))，从而增加骨骼肌中的血管数量。VEGF是众所周知的HIF靶标基因 产物，是血管发生的主要驱动物(Liu等人，出处同上)。虽然各种形式的 VEGF受体激活物的施用是血管发生的强效刺激物，但从这种潜在的治疗形 式产生的血管却是渗漏的。这被认为限制了VEGF用于治疗氧递送方面的 疾病的潜在效用。单单一种血管生成因子表达的增加对于功能性血管形成可 能并不足够(Semenza，2007年，出处同上)。PHD抑制比其他此类血管生 成疗法具有潜在的优势，因为它能以HIF依赖性方式刺激多种血管生成生长 因子的控制表达，包括但不限于：生长因子(PLGF)、促血管生成素-1 (ANGPT1)、促血管生成素-2(ANGPT2)、血小板衍生生长因子β(PDGFB) (Carmeliet，2004，J Intern Med.，255：538-61(Carmeliet，《内科学杂志》 2004年，第255卷，第538-561页)；Kelly et al.，2003，Circ Res.，93：1074- 81(Kelly等人，《循环研究》2003年，第93卷，第1074-10781页))和 基质细胞衍生因子1(SDF-1)(Ceradini et al.，2004，Nat Med.，10(8)：858-64 (Ceradini等人，《自然医学》2004年，第10卷第8期，第858-864 页))。相比于单独给予VEGF所产生的血管，在血管发生过程中促血管 生成素-1的表达会产生抗渗漏血管(Thurston et al.，1999，Science，286：2511- 14(Thurston等人，《科学》1999年，第286卷，第2511-2514页)； Thurston et al.，2000，Nat Med.，6(4)：460-3(Thurston等人，《自然医学》 2000年，第6卷第4期，第460-463页)；Elson et al.，2001，Genes Dev.， 15(19)：2520-32(Elson等人，《基因和发育》2001年，第15卷第19期，第 2520-2532页))。已证实基质细胞衍生因子1(SDF-1)对于内皮祖细胞募集 到组织损伤部位的过程是重要的。SDF-1表达增加了循环的CXCR4阳性祖 细胞向局部缺血组织的黏附、迁移和归巢。此外，对局部缺血组织中SDF-1 的抑制或者对循环的细胞上CXCR4的封锁会防止祖细胞向损失部位的募集 (Ceradini等人，2004年，出处同上；Ceradini et al.，2005，Trends  Cardiovasc Med.，15(2)：57-63(Ceradini等人，《心血管医学趋势》2005年， 第15卷第2期，第57-63页))。重要的是，在老龄小鼠中内皮祖细胞向 损失部位的募集减少，而通过在损失部位增加HIF进行干预可以对此进行校 正(Chang et al.，2007，Circulation，116(24)：2818-29(Chang等人，《循环》 2007年，第116卷第24期，第2818-2829页))。PHD抑制所提供的优势 不仅在于增加多种血管发生因子的表达，而且对这些因子在整个血管发生过 程中的表达和内皮祖细胞向局部缺血组织的募集进行协调。

以下观察结果提供了PHD抑制剂作为促血管发生疗法的效用的证据。 已证明在成体动物的非局部缺血组织中腺病毒介导的HIF过量表达能诱导血 管发生(Kelly et al.，2003，Circ Res.，93(11)：1074-81(Kelly等人，《循环研 究》2003年，第93卷第11期，第1074-1081页))，这提供了证据证明能 升高HIF的疗法(如PHD抑制)会诱导血管发生。胎盘生长因子(PLGF)也 是HIF靶标基因，已证实它在局部缺血组织中的血管发生中起到关键作用 (Carmeliet，2004，J Intern Med.，255(5)：538-61(Carmeliet，《国际医学杂 志》2004年，第255卷第5期，第538-561页)；Luttun et al.，2002，Ann NY  Acad Sci.，979：80-93(Luttun等人，《纽约科学院年志》2002年，第979 卷，第80-93页))。在骨骼肌中(Pajusola et al.，2005，FASEB J.， 19(10)：1365-7(Pajusola等人，《美国实验生物学联合会会刊》2005年，第 19卷第10期，第1365-1367页)；Vincent et al.，2000，Circulation，102：2255- 61(Vincent等人，《循环》2000年，第102卷，第2255-2261页))和在 心肌中(Shyu et al.，2002，Cardiovasc Res.，54：576-83(Shyu等人，《心血管 研究》2002年，第54卷第576-583页))，通过HIF过量表达，已证明了 能升高HIF的疗法的强效促血管发生作用。内皮祖细胞被HIF靶标基因 SDF-1募集到局部缺血心肌，这也已得到证明(Abbott et al.，2004， Circulation，110(21)：3300-05(Abbott等人，《循环》2004年，第110卷第 21期，第3300-3305页))。这些发现支持了这样的一般见解，即PHD抑 制剂在组织局部缺血特别是肌肉局部缺血的情况中将能有效地刺激血管发 生。预期由PHD抑制剂所产生的治疗性血管发生将可用于恢复向组织的血 液流动，因此可用于治疗包括但不限于以下疾病：心绞痛、心肌局部缺血和 心肌梗塞、外周局部缺血疾病、跛行、胃溃疡和十二指肠溃疡、溃疡性结肠 炎以及炎性肠疾病。

PHD和HIF在组织修复和再生(包括伤口和溃疡的愈合)中起到核心 作用。最近的研究已证明，在老龄小鼠中的伤口部位所有三种PHD表达增 加，导致HIF积累下降(Chang等人，出处同上)。因此，通过施用去铁胺 升高老龄小鼠中的HIF，结果使伤口愈合程度提升恢复到了年轻小鼠中观察 到的水平。类似地，与非糖尿病的同胎仔鼠相比，在糖尿病小鼠模型中HIF 升高受到了抑制(Mace et al.，2007，Wound Repair Regen.，15(5)：636-45 (Mace等人，《创伤修复与再生》2007年，第15卷第5期，第636-645 页))。氯化钴(一种低氧模拟物)的局部施用或者缺乏氧依赖性降解结构 域的鼠HIF(从而提供组成型活性形式的HIF)的过表达，导致了伤口部位 HIF增加，HIF靶基因如VEGF、Nos2和Hmox1的表达增加，以及伤口愈 合加速。PHD抑制的有益作用并不限于皮肤，最近已证明PHD的小分子抑 制剂在结肠炎的小鼠模型中提供好处(Robinson et al.，2008， Gastroenterology，134(1)：145-55(Robinson等人，《肠胃病学》2008年，第 134卷第1期，第145-155页))。

PHD抑制导致HIF积累，这预期通过以下至少四种机制起作用以有助 于伤口的加速且更完全的愈合：1)保护受低氧和/或局部缺血危害的组织，2) 刺激血管发生以建立或恢复向伤口部位的适当血液流动，3)募集内皮祖细胞 到伤口部位，4)刺激能特异性刺激愈合和再生的生长因子的释放。

重组人血小板衍生生长因子(PDGF)以贝卡普勒明(Regranex^TM)的名称市 售，已被美国食品与药物管理局批准用于“治疗延伸到皮下组织或更下层并 具有充足血液供应的下肢糖尿病性神经性溃疡”。已证实贝卡普勒明能有效 加速糖尿病患者的创伤愈合(Steed，2006，Plast Reconstr Surg.，117(7 Suppl)：143S-149S(Steed，《整形与改造外科学》2006年，第117卷副刊第 7期，第143S-149S页)；Nagai et al.，2002，Expert Opin Biol Ther.， 2(2)：211-8(Nagai等人，《生物疗法专家评论》2002年，第2卷第2期，第 211-218页))。由于PDGF是HIF基因靶标(Schultz et al.，2006，Am J  Physiol Heart Circ Physiol.，290(6)：H2528-34(Schultz等人，《美国生理学杂 志：心脏与循环生理学》2006年，第290卷第6期，第H2528-2534页)； Yoshida et al.，2006，J Neurooncol.，76(1)：13-21(Yoshida等人，《神经肿瘤 学杂志》2006年，第76卷第1期，第13-21页))，预期PHD抑制可增加 内源PDGF的表达，并且所产生的有益作用与单独用贝卡普勒明所产生的有 益作用相似或更好。在动物中进行的研究已证实，局部应用PDGF可导致伤 口DNA、蛋白质和羟脯氨酸含量增加；导致形成更厚的肉芽和表皮组织； 和导致伤口部位的细胞再增殖增加。PDGF可对新结缔组织形成的增强施加 局部作用。由于HIF介导的额外的组织保护作用和促血管发生作用，预期 PHD抑制的有效性大于贝卡普勒明所产生的有效性。

预期PHD抑制的有益作用不仅延伸到皮肤和结肠中的加速伤口愈合， 而且延伸到包括但不限于胃肠溃疡、皮肤移植物置换、烧伤、慢性伤口和冻 伤在内的其他组织损害的愈合。

在体内低氧小生境中发现存在干细胞和祖细胞，低氧调节着它们的分 化和细胞命运(Simon et al.，2008，Nat Rev Mol Cell Biol.，9：285-96(Simon等 人，《自然综述：分子细胞生物学》2008年，第9卷第285-296页))。因 此，PHD抑制剂可用于维持干细胞和祖细胞处于多能状态和用于驱动分化 成为所需的细胞类型。干细胞可用于培养和扩增干细胞群体，并可在将激素 和其他因子施用给细胞以影响分化和细胞命运的时候保持细胞处于多能状 态。

PHD抑制剂在干细胞和祖细胞治疗领域的又一个用途，涉及到将PHD 抑制剂用于调理这些细胞以使其能经受住向体内的植入过程和产生对身体的 适当响应，从而使干细胞和祖细胞植入可行(Hu et al.，2008，J Thorac  Cardiovasc Surg.，135(4)：799-808(Hu等人，《美国心胸外科杂志》2008 年，第135卷第4期，第799-808页))。更具体地讲，PHD抑制剂可促进 干细胞的整合，并且一旦干细胞整合时吸引适当的血液供应以维持干细胞。 该血管形成也会起到将这些细胞释放的激素和其他因子携带到身体其他部位 的作用。

PHD抑制剂还可用于治疗感染(Peyssonnaux et al.，2005，J Invest  Dermatol.，115(7)：1806-15(Peyssonnaux等人，《研究性皮肤病学杂志》 2005年，第115卷第7期，第1806-1815页)；Peyssonnaux et al.，2008J Invest Dermatol.，2008Aug；128(8)：1964-8(Peyssonnaux等人，《研究性皮肤 病学杂志》2008年，2008年8月，第128卷第8期，第1964-1968页))。 已证明HIF升高能增加吞噬细胞中和角质化细胞中对感染的先天免疫应答。 其中HIF升高的吞噬细胞显示出杀细菌活性提高、氧化氮产生量增加和 cathelicidin这种抗细菌肽的表达增加。这些作用也可用于治疗烧伤感染。

HIF也已被证实参与骨生长和愈合(Pfander D et al.，2003J Cell Sci.， 116(Pt9)：1819-26(Pfander D等人，《细胞科学期刊》2003年，第116卷第 Pt9期，第1819-1826页)；Wang et al.，2007J Clin Invest.，17(6)：1616-26 (Wang等人，《临床研究杂志》2007年，第17卷第6期，第1616-1626 页))，因此可用于愈合或防止骨折。HIF能刺激糖酵解以提供能量，使得 可在低氧环境下合成骺软骨细胞的胞外基质。HIF还在驱动VEGF的释放和 骨愈合过程中的血管发生中起到作用。血管向生长中或愈合中的骨头内的生 长可能是该过程中的限速步骤。

某些具有脯氨酰羟化酶抑制性活的小分子在文献中已有描述。这些小 分子包括但不限于某些咪唑并[1，2-a]吡啶衍生物(Warshakoon et al.，2006， Bioorg Med Chem Lett.，16(21)：5598-601(Warshakoon等人，《生物有机化学 与医药化学通讯》2006年，第16卷第21期，第5598-5601页))、取代的 吡啶衍生物(Warshakoon et al.，2006，Bioorg Med Chem Lett.，16(21)：5616-20 (Warshakoon等人，《生物有机化学与医药化学通讯》2006年，第16卷第 21期，第5616-5620页))、某些吡唑并吡啶(Warshakoon et al.，2006， Bioorg Med Chem Lett.，16(21)：5687-90(Warshakoon等人，《生物有机化学 与医药化学通讯》2006年，第16卷第21期，第5687-5690页))、某些二 环杂芳族N取代甘氨酸衍生物(国际专利申请公开WO2007/103905，2007 年9月13日)、基于喹啉的化合物(国际专利申请公开WO2007/070359， 2007年6月21日)、某些嘧啶三酮N取代甘氨酸衍生物(国际专利申请公 开WO2007/150011，2007年12月27日)和取代的芳基或杂芳基酰胺化合 物(美国专利申请公开No.：US2007/0299086，2007年12月27日)和取 代的4-羟基嘧啶-5-甲酰胺(国际专利申请公开WO2009/117269，2009年9 月24日)。

但是，仍需要具有期望的药物特性的强效脯氨酰羟化酶调节剂。在本 发明中，已发现某些氨基喹唑啉基衍生物具有脯氨酰羟化酶调节活性。

发明内容

本发明涉及一种化合物，其为有用的PHD抑制剂。本发明的化合物具 有通式(I)及其对映体、非对映体、外消旋化合物和可药用盐：

其中：

n为0-3；

R¹为独立地选自下列的成员：卤代基、-O-R^c、-C_1-4烷基、环己基、任选地 被-C_1-4烷基取代的苯基、任选地被-C_1-4烷基取代的苄基和-NR^aR^b；

R^a为H且R^b为任选地被-C_1-4烷基取代的苄基，或R^a和R^b与它们所连接的 氮合在一起以形成哌啶环；

R^c为环己基、任选地被一个或多个R^d成员取代的苯基；

R^d为独立地选自下列的成员：-H、卤代基和-C_1-4烷基；

R²为独立地选自下列的成员：-H和-C_1-4烷基；

R³为独立地选自下列的成员：-H、任选地被-OCH₃或-N(C_1-4烷基)₂取代的- C_1-4烷基、氰基、-SO₂CH₃、四氢吡喃、-(CH₂)_mC_3-8环烷基、任选地被 一个或多个卤代基或-C_1-4烷基取代的-(CH₂)_m苯基；

m为0-1；

R²和R³能够与它们所连接的氮合在一起以形成任选地包含O、N、S的4至 7元杂环烷基环，所述杂环烷基环任选地被-OH、氰基、卤代基、-N- C(O)C_1-4烷基和-C_1-4烷基取代。

式(I)的化合物的异构体形式和它们的可药用盐的异构体形式涵括在本 发明范围内，本文中提及这类异构体形式中的一者则意味着提及这类异构体 形式中的至少一者。本领域普通技术人员会认识到，本发明的化合物可例如 以单一异构体形式存在，而其他化合物可以以区域异构体混合物的形式存 在。

本发明还涉及式(I)的化合物的可药用盐、可药用前药和药物活性代谢 物。在某些优选的实施例中，式(I)的化合物是选自下文“具体实施方式”中 描述或例举的那些化合物物质的化合物。

在又一个主要方面，本发明涉及一些药物组合物，每种药物组合物包 含：(a)有效量的式(I)的化合物或其可药用盐、可药用前药或药物活性代谢 物；和(b)可药用赋形剂。

在另一个主要方面，本发明涉及治疗遭受或确诊有由脯氨酰羟化酶活 性介导的疾病、障碍或医学病症的方法，该方法包括将有效量的式(I)的化合 物或其可药用盐、可药用前药或药物活性代谢物施用给需要这种治疗的受试 者。

在本发明方法的某些优选实施例中，疾病、障碍或医学病症选自贫血 症、血管疾病、代谢障碍和伤口愈合。

通过以下具体实施方式和本发明实践，本发明的其他实施例、特征和 优点将会是显而易见的。

具体实施方式

由以下描述，包括以下术语表和结论性实例，可更完全地理解本发 明。为简单起见，将本说明书所引用的公开出版物(包括专利)的公开内容 以引用的方式并入本文中。

如本文所用，术语“包括”、“含有”和“包含”在本文中是以其开 放的、非限制性的意思使用。

术语“烷基”指链中具有1至12个碳原子的直链或支链烷基。烷基基 团的例子包括甲基(Me，其也可在结构上以符号“/”表示)、乙基(Et)、 正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基(tBu)、戊基、异戊基、 叔戊基、己基、异己基以及根据本领域的普通技能和本文提供的教导会被认 为与前述例子中的任何一者等同的基团。

术语“烯基”是指链中具有2至12个碳原子的直链或支链烯基基团。 (烯基基团的双键由两个sp²杂化碳原子形成。)示例性的烯基基团包括丙- 2-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、2-甲基丙-2-烯基、己-2-烯基等。

术语“炔基”是指链中具有2至12个碳原子的直链或支链炔基基团。 (炔基基团的三键由两个sp杂化碳原子形成。)示例性的炔基基团包括丙- 2-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、2-甲基丁-2-炔基、己-2-炔基等。

术语“环烷基”指每个碳环具有3至12个环原子的饱和或部分饱和的 单环、稠合多环或螺多环的碳环。示例性的环烷基例子包括采取适当键合部 分形式的下述实体：

“杂环烷基”指为饱和的或部分饱和的、单环的、稠合多环的单环环 状结构，每个环结构具有3至8个选自碳原子和最多两个选自氮、氧和硫的 杂原子的环原子。环结构可任选在硫环成员上含有最多两个氧代基基团。适 当键合部分形式的例示性实体包括：

术语“杂芳基”指每个杂环具有3至12个环原子的单环、稠合双环或 稠合多环的芳族杂环(环结构具有选自碳原子和最多四个选自氮、氧和硫的 杂原子的环原子)。示例性的杂芳基例子包括采取适当键合部分形式的以下 实体：

本领域技术人员会认识到，以上列举或例示的环烷基、杂环烷基和杂 芳基的种类并不是详尽无遗的，落入这些经定义的术语的范围内的另外种类 也可选择。

术语“卤素”表示氯、氟、溴或碘。术语“卤代基”表示氯代基、氟 代基、溴代基或碘代基。

术语“取代的”表示特定基团或部分带有一个或多个取代基。术语 “未被取代的”表示特定基团不携带取代基。术语“任选地取代的”表示特 定基团是未被取代的或者被一个或多个取代基取代。在术语“被取代的”用 来描述结构体系的情况中，意指取代是在该体系上任何化合价允许的位置处 发生。在指定的部分或基团没有明确指出被任何指定的取代基任选地取代或 取代的情况下，应理解这种部分或基团意在表示是未被取代的。

任何本文给出的化学式意在表示具有该结构式所示的结构的化合物以 及某些变化或形式。具体地讲，任何本文给出的化学式的化合物可具有不对 称中心，因此以不同的对映异构体形式存在。通式所示的化合物的所有旋光 异构体和立体异构体以及它们的混合物，都认为落入该化学式的范围内。因 此，任何本文给出的化学式意在表示外消旋体、一种或多种对映异构体形 式、一种或多种非对映异构体形式、一种或多种阻转异构体以及它们的混合 物。此外，某些结构可以几何异构体(即顺页式和反式异构体)的形式、以互 变异构体的形式或以阻转异构体的形式存在。另外，本文给出的任何化学式 意在包括这类化合物的水合物、溶剂化物和多晶型物以及它们的混合物。

另外，本文给出的任何化学式也意在指此类化合物的水合物、溶剂化 物和多晶型物，以及它们的混合物，即使此类形式并未明确列出。某些式(I) 的化合物或式(I)的化合物的可药用盐可以溶剂化物形式获得。溶剂化物包括 本发明的化合物与一种或多种溶剂经相互作用或络合所形成的那些，其为溶 液形式或为固体或晶体形式。在一些实施例中，溶剂为水，而溶剂化物为水 合物。此外，可以共结晶体形式获得式(I)的化合物或式(I)的化合物的可药用 盐的某些晶体形式。在本发明的某些实施例中，式(I)的化合物以晶体形式获 得。在其他实施例中，式(I)的化合物的晶形在性质上是立方体。在其他实施 例中，式(I)的化合物的可药用盐以晶体形式获得。在其他实施例中，式(I)的 化合物以若干多晶形式中的一种、以晶体形式的混合物、以多晶形式或以无 定形形式获得。在其他实施例中，式(I)的化合物在溶液中在一种或多种晶体 形式和/或多晶形式之间转换。

为了提供更准确的描述，本文给出的一些数量表述没有用术语“约” 修饰。应当理解，无论是否明确使用术语“约”，本文所给出的每个量意在 指实际的给定值，并且其还意在指根据本领域一般技术将可合理推理得到的 这些给定值的近似值，包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的等 价值和近似值。当给出收率百分数时，该收率是指实体的质量，对于该实体 所述收率是相对于可在具体化学计量条件下获得的相同实体的最大量给出 的。除非另外指明，否則给定的浓度百分数是指质量比。

本文提及化学实体时，表示以下任何一种：在提到时该化合物所处的 介质中的(a)这种化学实体的实际描述形式，和b)这种化学实体的任何形 式。例如，本文提及化合物例如R-COOH，包括提及以下任何一种，例如 R-COOH_(s)、R-COOH_(sol)和R-COO^-_(sol)。在该例子中，R-COOH_(s)指固体化合 物，因为其可例如存在于片剂或一些其他固体药物组合物或制剂中；R- COOH_(sol)指化合物在溶剂中的非解离形式；而R-COO^-_(sol)指化合物在溶剂中 的解离形式，如化合物在水性环境中的解离形式，无论此类解离形式是衍生 自R-COOH、衍生自其盐还是衍生自在所考虑的介质中解离后可得到R- COO^-的任何其他实体。又如，诸如“使实体暴露于式R-COOH化合物”的 表述是指使此类实体暴露于存在于其中发生该暴露的介质中的化合物R- COOH的一种或多种形式。在又一例子中，诸如“使实体与式R-COOH化 合物反应”之类的表述是指使(a)存在于其中发生该反应的介质中的这类实 体的一种或多种化学相关形式的这种实体与(b)存在于其中发生该反应的介 质中的化合物R-COOH的一种或多种化学相关形式反应。就这一点而言， 如果此类实体是(例如)处于水性环境中，则应当理解，化合物R-COOH 是在此类相同介质中并因此所述实体正暴露于诸如R-COOH_(aq)和/或R-COO^-_(aq)之类的物种中，其中下标“(aq)”根据其化学和生物化学常规含义表示 “水性”。在这些命名例子中选择了羧酸官能团；然而这种选择并非有意作 为限制，而仅用于举例说明。应当理解，可提供其他官能团的类似例子，包 括但不限于羟基、碱性氮成员(如在胺中的那些)和可在含有所述化合物的 介质中根据已知方式相互作用或转化的任何其他基团。此类相互作用和转化 包括(但不限于)解离、缔合、互变异构、溶剂分解(包括水解)、溶剂化 (包括水合)、质子化和去质子化。

在另一个例子中，本文通过提及已知会形成两性离子的化合物而涵盖 两性离子化合物，即使它不被明确以其两性离子形式被提到。诸如两性离子 及其同义词两性离子化合物之类的术语是IUPAC认可的标准名称，这种名 称是众所周知的，且是经定义的科学名称的标准集的一部分。在这点上，两 性离子这个名称被生物学关联化学实体数据库(Chemical Entities of Biological  Inerest，ChEBI)的分子实体词典分配CHEBI：27369这个名称标识。众所周 知，两性离子或两性离子化合物是具有相反符号的形式单位电荷的中性化合 物。有时，这些化合物用术语“内盐”来称谓。其他的资料称这些化合物为 “偶极离子”，不过这个术语被另外的其他资料认为是误称。作为具体的例 子，氨基乙酸(即甘氨酸这种氨基酸)化学式为H₂NCH₂COOH，在一些介 质中(在这个情况下是在中性介质中)以两性离子⁺H₃NCH₂COO^-的形式存 在。两性离子、两性离子化合物、内盐和偶极离子这些术语按其已知和确立 的含义落入本发明的范围内，这在任何情况下本领域技术人员都是这么认识 的。由于没有必要提出本领域普通技术人员会认识到的每一个实施例，因此 本文中没有明确给出与本发明化合物有关联的两性离子化合物的结构。但是 它们是本发明实施例的一部分。在这点上，本文中没有提供更多的例子，因 为给定介质中的导致产生给定化合物的各种形式的相互作用和转化是本领域 任何普通技术人员知道的。

本文给定的任何结构式还旨在表示化合物的未标记形式以及同位素标 记形式。同位素标记的化合物具有本文给定的式子所描绘的结构，不同的是 一个或多个原子被具有所选原子量或质量数的原子所代替。可掺入到本发明 化合物中的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如分 别为²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl、 ¹²⁵I。这种同位素标记的化合物可用于代谢研究(优选用¹⁴C)，用于反应动 力学研究(用例如²H或³H)，用于检测或成像技术[如正电子发射断层显 像(PET)或单光子发射计算机断层显像(SPECT)]，包括药物或底物组织分布 测定，或者用于患者的放射治疗。具体来讲，¹⁸F或¹¹C标记的化合物尤其 可优选用于PET或SPECT研究。此外，用较重的同位素例如氘(即²H)进 行置换可以提供由更大的代谢稳定性所带来的某些治疗优势，例如体内半衰 期延长或需要的剂量减少。同位素标记的本发明化合物及其前药通常可以通 过用容易获得的同位素标记试剂取代非同位素标记试剂，完成“方案”或 “实例”中所公开的程序和下面描述的制备法来制备。

就取代基术语举以第一个例子，如果取代基S¹_例是S₁和S₂其中之一， 且取代基S²_例是S₃和S₄其中之一，则这些归属是指根据以下选择的本发明 实施例：S¹_例是S₁且S²_例是S₃；S¹_例是S₁且S²_例是S₄；S¹_例是S₂且S²_例是 S₃；S¹_例是S₂且S²_例是S₄；以及任何一种此类选择的等同物。因此为简单起 见，本文使用较短的术语“S¹_例是S₁和S₂其中之一，且S²_实是S₃和S₄其中 之一”，但并非限制性的。上述以通用术语方式说明的关于取代基术语的第 一个例子旨在举例说明本文描述的各种取代基归属。本文对取代基给出的上 述约定在适用的情况下可延伸到诸如R¹、R²、R³、A、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、 R^a、R^b、R^c和R^d的成员，以及本文所用的任何其他通用取代基符号。

而且，当对任何成员或取代基指定不止一种归属时，本发明的实施例 包括可由列出的归属独立结合形成的各种分组，及其等同物。就取代基术语 举以第二个例子，如果本文描述取代基S_例是S₁、S₂和S₃其中之一，则这种 列举是指以下本发明实施例，其中S_例是S₁；S_例是S₂；S_例是S₃；S_例是S₁和S₂其中之一；S_例是S₁和S₃其中之一；S_例是S₂和S₃其中之一；S_例是 S₁、S₂和S₃其中之一；并且S_例是这些选择中每一者的任何等同物。因此为 简单起见，本文使用较短的术语“S_例是S₁、S₂和S₃其中之一”，但并非限 制性的。上述以通用术语方式说明的关于取代基术语的第二个例子意在举例 说明本文描述的各种取代基归属。本文对取代基给出的上述约定在适用的情 况下可延伸到诸如R¹、R²、R³、A、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、R^a、R^b、R^c和R^d的 成员，以及本文所用的任何其他通用取代基符号。

命名“C_i-j”(J＞i)在本文中用于一类取代基时，意指其中独立确定碳成 员各自数目(i至J，包括i和J)的本发明实施例。例如，术语C_1-3独立地 指具有一个碳成员的实施例(C₁)、具有两个碳成员的实施例(C₂)和具有三个 碳成员的实施例(C₃)。

术语C_n-m烷基指无论是直链还是支链，链内碳成员的总数N满足n≤N ≤m(m＞n)的脂族链。

本文提及的任何二取代基意涵盖当允许不止一种此类可能性时的各种 连接可能性。例如，本文提及二取代基-A-B-(其中A≠B)时，指A连接 第一被取代成员而B连接第二被取代成员的此类二取代基，也指A连接第 二被取代成员而B连接第一被取代成员的此类二取代基。

根据上文关于归属和命名的解释，应当理解，当化学上有意义时，除 非另外说明，否则本文明确提及一组对象时，是独立提及该组实施例，并且 是提及被明确提及的该组的各个可能的亚组实施例。

化学结构图意在示出含有所写明的取向的化合物部分。

本发明包括式(I)的化合物

的用途，式(I)的化合物和含有这种化合物的药物组合物用于治疗患有与脯氨 酰羟化酶调节有关的障碍的患者(人类或其他哺乳动物)的用途。本发明还 包括制备这种化合物、其药物组合物、可药用盐、可药用前药和药物活性代 谢物的方法。

在由式(I)描述的本发明中，其中n为0-3，R¹独立地为溴代基、氯代 基、氟代基、甲基、异丙基、环己基、环己氧基、苯基、2-甲基苯基、苄 基、苯氧基、4-氯苯氧基、2，6-二甲基-苯氧基、哌啶基和(2，6-二甲基苄基)氨 基。

在另外的优选实施例中，n为1。

在另外的优选实施例中，n为2。

在另外的优选实施例中，n为3。

在另外的优选实施例中，R^a为-H且R^b为2，6-二甲基苄基。

在另外的优选实施例中，R^a和R^b能够与它们所连接的氮合在一起以形 成哌啶环。

在另外的优选实施例中，R^c可为苯基、环己基、4-氯苯基、或2，6-二甲 基-苯基。

在另外的优选实施例中，R^d可独立地为-H、氯代基和-CH₃。

在另外的优选实施例中，R²为-H并且R³可独立地为-H、氰基、甲基、 乙基、丙基、叔丁基、环丙基、环丙基甲基、四氢吡喃基、环己基甲基、苯 基、2-氯苯基、2，6-二甲基苄基和-SO₂CH₃。

在另外的优选实施例中，R²可为甲基、乙基、丙基或丁基。

在另外的优选实施例中，R³可为甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、 2-甲氧基乙基、2-甲氧基-1-甲基-乙基或二乙胺基乙基。

在另外的优选实施例中，R²和R³能够与它们所连接的氮合在一起以形 成吡咯烷、哌啶、4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷、硫代吗啉、4-羟基哌啶、吗 啉、4-乙酰氨基哌啶、4-氰基哌啶、4-氟哌啶、氮杂环庚烷或4-异丙基哌 啶。

在某些优选的实施例中，式(I)的化合物选自：

以及其可药用盐。

本发明还包括式(I)的化合物的可药用盐，优选以上描述的那些化合物 的可药用盐和本文例举的具体化合物的可药用盐，以及用这类盐进行治疗的 方法。

“可药用盐”旨在表示式(I)表示的化合物的游离酸或碱的盐，其是无 毒的、生物学耐受的或换句话说是在生物学上适于施用给受试者。一般来 讲，参见G.S.Paulekuhn，et al.，“Trends in Active Pharmaceutical Ingredient  Salt Selection based on Analysis of the Orange Book Database”，J. Med.Chem.， 2007，50：6665-72，S.M.Berge，et al.，“Pharmaceutical Salts”，J Pharm Sci.， 1977，66：1-19，and Handbook of Pharmaceutical Salts，Properties，Selection，and  Use，Stahl and Wermuth，Eds.，Wiley-VCH and VHCA，Zurich，2002(G.S. Paulekuhn等人，“根据橙皮书数据库的分析选择活性药物成分盐的趋 势”，《药物化学杂志》，2007年，第50卷，第6665-6672页；S.M. Berge等人，“药用盐”，《药物科学杂志》，1977年，第66卷，第1-19 页；以及《药用盐：特性、选择与应用》，Stahl和Wermuth编辑，Wiley- VCH and VHCA，Zurich，2002年)。可药用盐的例子是那些药理学有效且 适于与患者组织接触而不会有不当毒性、刺激或变应性反应的盐。式(I)的化 合物可以具有足够酸性的基团、足够碱性的基团或这两种类型的官能团，从 而与多种无机碱或有机碱，以及无机酸和有机酸反应，形成可药用盐。

可药用盐的例子包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫 酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化 物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸 盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸 盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔- 1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、 羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、 苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟丁酸盐、乙醇酸 盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸 盐。

当式(I)的化合物含有碱性氮时，所需的可药用盐可通过本领域可用的 任何合适方法制备，例如用无机酸处理该游离碱，所述无机酸例如是盐酸、 氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸、硼酸、磷酸等，或者用有机酸处理该游离 碱，所述有机酸例如是乙酸、苯乙酸、丙酸、硬脂酸、乳酸、抗坏血酸、马 来酸、羟基马来酸、羟乙磺酸、琥珀酸、戊酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、 草酸、乙醇酸、水杨酸、油酸、棕榈酸、月桂酸、吡喃糖苷基酸(如葡糖醛 酸或半乳糖醛酸)、α-羟酸(如扁桃酸、柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(如天 冬氨酸、戊二酸或谷氨酸)、芳族酸(如苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、萘甲 酸或肉桂酸)、磺酸(如月桂基磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸)、诸 如本文作为例子给出的那些酸的任何相容混合物、和根据本技术领域的普通 技能水平被认为是等效物或可接受取代物的任何其他酸及其混合物。

当式(I)的化合物为酸如羧酸或磺酸时，所需的可药用盐可通过任何合 适的方法制备，例如通过用无机或有机碱处理该游离酸来制备，所述无机或 有机碱例如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化 物、诸如本文作为例子给出的那些碱的任何相容混合物、和根据本技术领域 的普通技能水平被认为是等效物或可接受取代物的任何其他碱及其混合物。 合适的盐的示例性例子包括衍生自下述物质的有机盐：氨基酸(例如N-甲 基-D-葡糖胺、赖氨酸、胆碱、甘氨酸和精氨酸)、氨、碳酸盐、碳酸氢 盐、伯胺、仲胺、叔胺和环胺(例如氨基丁三醇、苄胺、吡咯烷、哌啶、吗 啉和哌嗪)，以及衍生自下列物质的无机盐：钠、钙、钾、镁、锰、铁、 铜、锌、铝和锂。

示例性的前药包括这样的化合物，其具有通过酰胺键或酯键共价连接 到式(I)的化合物的游离氨基、羟基或羧酸基团的氨基酸残基或者两个或更多 个(例如两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链。氨基酸残基的例子包括 通常用三个字母符号标识的二十种天然存在的氨基酸以及4-羟脯氨酸、羟 基赖氨酸、锁链素(demosine)、异锁链素(isodemosine)、3-甲基组氨酸、正缬 氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和甲 硫氨酸砜。

其他类型的前药可以通过(例如)将式(I)结构的游离羧酸衍生为酰胺 或烷基酯来制备。酰胺的例子包括衍生自氨、C_1-6烷基伯胺和二(C_1-6烷基)仲 胺的那些。仲胺包括5-元或6-元杂环烷基或杂芳基环部分。酰胺的例子包 括衍生自氨、C_1-3烷基伯胺和二(C_1-2烷基)胺的那些酰胺。本发明的酯的例子 包括C_1-7烷基酯、C_5-7环烷基酯、苯酯和(C_1-6烷基)苯酯。优选的酯包括甲 酯。还可以按照诸如Fleisher et al.，Adv.Drug Delivery Rev.1996，19，115-130 (Fleisher等人，《药物递送进展综述》，1996年，第19卷，第115-130 页)中所描述的那些方法，通过用包括半琥珀酸酯、磷酸酯、二甲基氨基乙 酸酯、和磷酰氧基甲氧基羰基在内的基团使游离羟基衍生化来制备前药。羟 基和氨基的氨基甲酸酯衍生物也可产生前药。羟基的碳酸酯衍生物、磺酸酯 和硫酸酯也可以提供前药。将羟基衍生化为(酰氧基)甲酯和(酰氧基)乙酯， 其中酰基可为任选被一个或多个醚、胺或羧酸官能团取代的烷基酯，或者其 中酰基为如上所述的氨基酸酯，这也可用于产生前药。该类型的前药可如 Robinson et al.，JMed Chem.1996，39(1)，10-18(Robinson等人，《药物化学 杂志》，1996年，第39卷第1期，第10-18页)中所述制备。游离胺也可 衍生化为酰胺、磺酰胺或膦酰胺。所有这些前药部分都可掺入包括醚、胺和 羧酸官能团在内的基团。

本发明还涉及式(I)的化合物的药物活性代谢物，其也可用于本发明方 法。“药物活性代谢物”意指式(I)的化合物或其盐的体内代谢的药理活性产 物。化合物的前药和活性代谢物可用本领域公知或可利用的常规技术进行确 定。参见例如Bertolini，et al.，J Med Chem.1997，40，2011-2016(Bertolini等 人，《药物化学杂志》，1997年，第40卷，第2011-2016页)；Shan，et al.， J Pharm Sci.1997，86(7)，765-767(Shan等人，《制药科学杂志》，1997 年，第86卷第7期，第765-767页)；Bagshawe，Drug Dev Res.1995，34， 220-230(Bagshawe，《药物开发研究》，1995年，第34卷，第220-230 页)；Bodor，Adv Drug Res.1984，13，224-331(Bodor，《药物研究进展》， 1984年，第13卷，第224-331页)；Bundgaard，Design of Prodrugs(Elsevier  Press，1985)(Bundgaard，《前药设计》，爱思唯尔出版社，1985年)；和 Larsen，Design and Application of Prodrugs，Drug Design and Development  (Krogsgaard-Larsen，et al.，eds.，Harwood Academic Publishers，1991)(Larsen， 《前药的设计与应用》，《药物设计与开发》(Krogsgaard-Larsen等人编 辑，哈伍德学术出版社，1991年))。

本发明的式(I)的化合物及其可药用盐、可药用前药和药学活性代谢物 可在本发明方法中用作PHD的调节剂。“调节剂”包括抑制剂和激活剂， 其中“抑制剂”指能降低、防止、失活、减敏或下调PHD表达或活性的化 合物，而“激活剂”指能提高、激活、促进、致敏或上调PHD表达或活性 的化合物。

本文所用的术语“治疗”意在指将本发明的活性剂或组合物施用给受 试者，目的是通过调节脯氨酰羟化酶活性实现治疗或预防效果。治疗包括通 过对PHD活性的调节来介导，实现对疾病、障碍或病症或者疾病、障碍或 病症的一种或多种症状逆转、改善、减轻、抑制其进展，减少其严重程度， 或者加以预防。术语“受试者”指需要这种治疗的哺乳动物患者，例如人。

因此，本发明涉及用本文所述的化合物治疗确诊有或者遭受由脯氨酰 羟化酶介导的疾病、障碍或病症的方法，所述疾病、障碍或病症例如为贫血 症、血管疾病、代谢障碍和伤口愈合。症状或疾病状态被认为包括在“医学 病症、障碍或疾病”的范围内。

本文所用的术语“低氧”或“低氧障碍”指其中血液中所提供的或向 组织和器官提供的氧水平不足的病症。低氧障碍可通过多种机制出现，包括 血液携氧能力不足(即贫血症)，因心力衰竭或者血管和/或动脉阻塞导致 血液向组织和/或器官的流动不充分(即局部缺血)，大气压力下降(即高 纬度地区的高海拔病)，或者功能异常的细胞不能够适当利用氧(即组织中 毒性病症)。因此，本领域技术人员会容易认识到本发明可用于治疗包括贫 血症、心力衰竭、冠状动脉疾病、血栓栓塞、中风、心绞痛等在内的多种低 氧病症。

在一个优选的实施例中，本发明的分子可用于治疗或预防贫血症，包 括治疗与以下疾病有关的贫血病症：慢性肾病、多囊性肾病、再生障碍性贫 血、自身免疫性溶血性贫血、骨髓移植贫血、Churg-Strauss综合征、 Diamond Blackfan贫血、范可尼贫血、Felty综合征、移植物抗宿主病、造血 干细胞移植、溶血性尿毒综合征、骨髓增生异常综合征、夜间阵发性血红蛋 白尿症、骨髓纤维化、各类血细胞减少症、纯红细胞再生障碍性贫血、过敏 性紫癜(purpura Schoenlein-Henoch)、原始细胞增多性难治性贫血、类风湿性 关节炎、Shwachman综合征、镰形细胞病、重型地中海贫血、轻型地中海贫 血、血小板减少性紫癜、进行外科手术的贫血症或非贫血症患者、创伤相关 或次生的贫血症、铁粒幼细胞贫血、其他治疗次生的贫血(包括治疗HIV 的反转录酶抑制剂、皮质类固醇激素、含环状顺铂的化疗药物或不含顺铂的 化疗药物、长春花生物碱、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、蒽环 霉素、安慈拉环素、烷基化剂，特别是炎症、衰老和/或慢性疾病次生的贫 血)。PHD抑制还可用于治疗贫血的症状，包括慢性疲劳、脸色苍白和头 昏眼花。

在另一个优选的实施例中，本发明的分子可用于治疗或预防代谢障碍 的疾病，包括但不限于糖尿病和肥胖症。在另一个优选的实施例中，本发明 的分子可用于治疗或预防血管疾病。这些疾病包括但不限于低氧或伤口愈合 相关的疾病，其需要促血管发生介质来进行血管生成、血管发生和动脉生 成。

在根据本发明的治疗方法中，将有效量的根据本发明的药剂施用给遭 受或诊断有此类疾病、障碍或病症的受试者。“有效量”意指足以通常在需 要对指定疾病、障碍或病症进行这种治疗的患者中产生所需的治疗或预防好 处的量或剂量。本发明化合物的有效量或剂量可通过常规方法确定，如建 模、剂量递增研究或临床试验，和通过考虑常规因素来确定，如施用或药物 递送的方式或途径，化合物的药代动力学，疾病、障碍或病症的严重程度和 病程，患者之前进行和现在进行的疗法，患者的健康状况和对药物的响应， 以及主治医师的判断。剂量的例子为这样的剂量范围：约0.001至约200mg 化合物/公斤患者体重/天，优选约0.05至100mg/kg/天，或者约1至 35mg/kg/天，以单一剂量单位或分开剂量单位的形式(例如每日两次、每日 三次、每日四次)。对于70kg的人，合适剂量的示例性范围为约0.05至约 7g/天或者约0.2至约2.5g/天。

一旦患者的疾病、障碍或病症出现改善，可调整剂量以进行预防性或 维持性治疗。例如，给药的剂量或频率或者这两方面可根据症状而定降低到 能维持所需的治疗或预防作用的水平。当然，如果症状已减轻到适当的水 平，治疗可停止。但是，患者可能需要长期地在症状出现任何复发时进行间 歇性治疗。

另外，本发明的药剂可与另外的活性成分组合用于治疗上述病症。所 述另外的化合物可与式(I)药剂分开进行共同施用，或者可作为另外的活性成 分与该药剂一起包含在本发明的药物组合物中。在一个示例性的实施例中， 另外的活性成分是那些已知或被发现能有效治疗由PHD酶介导的病症、障 碍或疾病的活性成分，或者对与该特定病症、障碍或疾病有关的另一靶标有 活性的活性成分，如另一PHD调节剂。该组合可有助于增强功效(例如通 过在该组合物中包含能增强根据本发明的化合物的功效或有效性的化合 物)，减少一种或多种副作用或者降低根据本发明的化合物的所需剂量。

本发明的化合物单独使用或者与一种或多种其他活性成分组合使用来 配制本发明的药物组合物。本发明的药物组合物包含：(a)有效量的式(I)的 化合物，或其可药用盐、可药用前药或药物活性代谢物；和(b)可药用赋形 剂。

“可药用赋形剂”指无毒的、生物学上可耐受的，换句话讲在生物学 上适于施用给受试者的物质，如惰性物质，其被添加至药物组合物或者用作 溶媒、载体或稀释剂以利于本发明化合物的施用，并且其与本发明化合物相 容。赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各种类型的淀粉、纤维 素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

含有一个或多个剂量单位的本发明化合物的药物组合物的递送形式， 可用本领域技术人员现在或以后知道或可获得的合适药物赋形剂和配混技术 来制备。组合物可按本发明方法通过口服途径、胃肠外途径、直肠途径、局 部途径或眼部途径或者通过吸入来施用。

制剂可为片剂、胶囊剂、囊剂(sachet)、糖衣丸剂、散剂、颗粒剂、锭 剂、重构用散剂、液体制剂或栓剂的形式。优选地，所述组合物配制成供静 脉输注、局部施用或口服施用。本发明的优选用法是局部施用PHD抑制 剂，特别是施用至组织已变得或已被造成局部缺血的部位。这可通过专门的 导管、血管成形术球囊或支架布置球囊来实现。

对于口服施用，本发明的化合物可以片剂或胶囊剂的形式提供，或者 作为溶液剂、乳剂或混悬剂提供。为制备口服组合物，可将化合物配制成能 产生例如约0.05至约100mg/kg/天或者约0.05至约35mg/kg/天或者约0.1至 约10mg/kg/天的剂量。

口服片剂可包含与可药用赋形剂混合的根据本发明的化合物，所述赋 形剂例如为惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、着色 剂和防腐剂。合适的惰性填充剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、乳 糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。 示例性的液体口服赋形剂包括乙醇、甘油、水等。淀粉、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、羟基乙酸淀粉钠、微晶纤维素和海藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可 包括淀粉和明胶。润滑剂如果存在的话可以是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。 如果需要，片剂可用诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯的材料进行包 衣，以延迟在胃肠道中的吸收，或者可用肠溶衣进行包衣。

用于口服施用的胶囊剂包括硬明胶胶囊剂或软明胶胶囊剂。为制备硬 明胶胶囊，可将本发明化合物与固体、半固体或液体稀释剂混合。软明胶胶 囊剂可通过将本发明化合物与水、油(如花生油或橄榄油)、液体石蜡、短 链脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物、聚乙二醇400或丙二醇混合来制 备。

口服施用的液体制剂可以为混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂的形式， 或者可以以干品形式呈现，供临用前用水或其他合适的溶媒进行重构。这种 液体组合物可任选含有：药用赋形剂如助悬剂(例如山梨糖醇、甲基纤维 素、海藻酸钠、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶等)； 非含水介质，例如油(例如杏仁油或分馏椰子油)、丙二醇、乙醇或水；防 腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，或者山梨酸)、湿润剂如卵磷脂；和 如果需要的话，还有矫味剂或着色剂。

本发明的活性剂还可通过非口服途径施用。例如，组合物可配制成栓 剂供直肠内施用。对于胃肠外使用，包括静脉内途径、肌肉内途径、腹膜内 途径或皮下途径，本发明的化合物可以以无菌水溶液剂或混悬剂的形式提 供，这些形式被缓冲至适当的pH和等渗性或者在胃肠外可接受的油中。合 适的含水介质包括林格溶液和等渗氯化钠。这类形式将以单位剂量形式呈 现，如安瓿或一次性注射装置，以多剂量形式呈现，如可从中抽取适当剂量 的小瓶，或者以可用来制备可注射制剂的固体形式或预浓缩物形式呈现。示 例性的输注剂量可为约1至1000μg化合物/kg/分钟的范围，与药物载体混合 在数分钟至数天的时间里输注。

对于局部施用，化合物可以与药物载体混合在一起，药物与溶媒的浓 度比为约0.1％至约10％。例子包括洗剂、霜剂、油膏剂等等，并且可通过 已知的方法配制。另一种施用本发明化合物的方式可采用贴剂来实现透皮递 送。

或者，本发明化合物可以按本发明方法通过吸入、通过鼻内途径或口 服途径(例如在还含有合适载体的喷剂中)施用。

本文所用的缩写和首字母缩略词包括以下：

术语 首字母缩略词 二异丙基乙胺 DIEA 四氢呋喃 THF 二氯甲烷 DCM 二甲基亚砜 DMSO 二甲基乙酰胺 DMA N，N-二甲基甲酰胺 DMF 乙醇 EtOH 乙腈 ACN 乙酸乙酯 EtOAc N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺 EDCI N，N′-二异丙基碳二亚胺 DIC 二氯乙烷 DCE

对于可用于本发明方法的示例性化合物，现将在下文通过关于它们的 一般制备的示例性合成方案以及后续的具体实例来进行描述。技术人员会认 识到，为获得本文的各种化合物，可适当地选择原料，使得最终需要的取代 基会在整个反应方案中根据需要进行保护或不经保护的情况下携带，以得到 需要的产物。或者，可能需要或者希望采用合适的基团代替该最终需要的取 代基，该合适的基团可得以贯穿反应方案，然后在适当情况下用需要的取代 基取代。除非另外指明，否则各种变量如上文针对式(I)所定义。反应可在溶 剂的熔点和回流温度之间进行，优选在0℃和溶剂回流温度之间进行。反应 还可在密闭压力容器中在溶剂的正常回流温度以上进行。

方案A

根据方案A，由适当取代的市售的或使用已知方法、方案B中描述的 方法或如Journal ofOrganic Chemistry，2008，73(6)，2473-75(《有机化学杂 志》，2008年，第73卷第6期，第2473-2475页)中描述的方法容易合成 得到的式(II)或(III)的苯胺制备式(I)的化合物。参见方案A，在诸如二氯甲烷 (DCM)之类的溶剂中，在室温和溶剂回流温度之间的温度下，使式(II)或(III) 的官能化苯胺与诸如异硫氰酰甲酸乙酯之类的异硫氰酸酯缩合，得到式(IV) 的化合物。随后在存在偶联试剂如EDCI、DIC等的情况下，使用或不使用 诸如三乙胺之类的胺碱，使式(IV)的化合物与市售的取代的式(V)的吡唑-4- 羧酸酯偶联得到式(VI)的化合物。在诸如DCE或DMF、甲苯等的溶剂中， 在室温和溶剂回流温度之间的温度下，用适当的路易斯酸如三甲基氯硅烷、 氯化钛(IV)等环化式(VI)的化合物，得到式(VII)的化合物。在适当的溶剂如 乙腈中，在存在诸如DIEA的碱的情况下，在室温和回流温度之间的温度 下，用适当的氯化剂如POCl₃处理式(VII)的化合物，得到式(VIII)的化合 物。在某些情况下，通过适当来源如LiCl添加氯离子可为有利的。用胺处 理式(VIII)的化合物，得到式(IX)的化合物。用合适的碱如NaOH水溶液、 LiOH水溶液、KOH或它们混合物，在溶剂如THF中在室温和回流温度之 间的温度下进行皂化，得到式(I)的化合物。有充足的已知的且可商购获得的 该本发明方案中可采用的苯胺。本文中所示方案还提供了合成多种中间体的 指导，这些中间体是不容易获得的并且可用于制备本发明的化合物

方案B

根据方案B制备式(II)的醚中间体，其中HAL为F、Cl。在诸如 DMSO、DMF、DMA等的溶剂中，在存在诸如碳酸钾的碱的情况下，在室 温和溶剂回流温度之间的温度下，使市售的式(X)的适当取代的卤代-硝基- 苯与取代的酚(XI)反应，得到式(XII)的硝基中间体。采用本领域技术人员已 知的方法，例如在诸如丙酮等的溶剂中，在存在NH₄Cl饱和水溶液的情况 下使用锌粉还原硝基基团，得到式(II)的苯胺中间体。

可采用与上述用于醚中间体的方法类似的方法制备式(III)的氨基中间 体，将酚替换为式(XIII)的取代的烷基胺、杂环烷基胺和芳基胺。

实例

化学分析：

在获得描述于下面实例中的化合物和对应的分析数据中，除非另外说 明，否则遵循下列实验和分析方案。

除非另外说明，否则在室温(rt)下磁搅拌反应混合物。在将溶液“干 燥”的情况中，它们通常是用诸如Na₂SO₄或MgSO₄之类的干燥剂进行干 燥。当“浓缩”混合物、溶液和提取物时，通常将它们在旋转蒸发仪上进行 减压浓缩。

薄层色谱(TLC)是用Merck硅胶60F₂₅₄2.5cm×7.5cm250μm或 5.0cm×10.0cm250μm预涂硅胶板进行。制备型薄层色谱是用EM Science硅 胶60F₂₅₄20cm×20cm0.5mm预涂板进行，该板具有20cm×4cm浓缩区。

除非另外指明，否则正相快速柱色谱(FCC)是在硅胶(SiO₂)上用己烷/乙 酸乙酯洗脱进行。

在具有Phenomenex Luna C₁₈(5μm，4.6×150mm)柱的Hewlett Packard HPLC系列1100上进行反相HPLC。在λ＝230、254和280nm处进行检测。 梯度为10至99％乙腈/水(0.05％三氟乙酸)，洗脱5.0分钟，流速 1mL/min。或者，在运行Gilson Unipoint LC软件的Gilson自动HPLC系统上 进行制备型HPLC纯化，uv峰检测在λ＝220nm下进行，配有反相YMC- Pack ODS-A(5μm，30×250mm)柱；流动相梯度为10-99％的乙腈/水(0.05％ 三氟乙酸)，洗脱15-20分钟，流速为10-20毫升/分钟。

质谱(MS)是在配备有ESI/APCI正和负多模式电离源的Agilent系列 1100MSD上获得，除非另外指明。

核磁共振(NMR)谱是在Bruker型DRX光谱仪上获得。以下¹H NMR数 据的格式为：化学位移(单位ppm，在四甲基硅烷参照物的前场)(表观多 重性，耦合常数J(单位Hz)，积分)。

化学名称是用ChemDraw版本6.0.2(马萨诸塞州坎布里奇剑桥软件公 司(CambridgeSoft，Cambridge，MA))或ACD/Name版本9(加拿大安大略省 多伦多高级化学发展有限公司(Advanced Chemistry DevelopmentToronto， Ontario，Canada))产生。

实例1：1-[4-氨基-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

步骤A：制备3-氟-4-(2，6-二甲基-苯氧基)苯胺。向3，4-二氟硝基苯 (50.0g，314mmol)、K₂CO₃(65.0g，138mmol)和DMSO(500mL)的已搅拌混合 物中分次添加固体的2，6-二甲基苯酚(42.4g，346mmol)。添加完成后，将混合 物加热到80℃，持续8h，然后使其冷却到室温。将混合物注入冰水中，收 集并干燥所得沉淀。将该材料溶解于丙酮(1L)中，然后添加150mL NH₄Cl饱 和水溶液，并将混合物浸入冰浴中，同时进行机械搅拌。分次添加固体zn 粉(204g，65.4mmol)，添加速率使得反应混合物的内部温度不会升至20℃以 上。添加完成后，使混合物温热至室温并维持搅拌6h。添加EtOAc(乙酸 乙酯)(1.5L)和无水硫酸钠(500g)，并持续搅拌30分钟。然后将反应物通过 滤垫过滤，用EtOAc充分冲洗，浓缩滤液。用将残余物与己烷一起 磨碎，得到固体(64.5g，90％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：7.10-6.99(m， 3H)，6.55(ddd，J＝12.5，2.1，0.8Hz，1H)，6.25-6.19(m，2H)，3.50(s，2H)，2.15 (s，6H)。

步骤B：制备1-(4-(2，6-二甲基苯氧基)-3-氟苯基)-3-乙氧羰基硫脲。在 冰浴中冷却3-氟-4-(2，6-二甲基-苯氧基)苯胺(15.4g，66.6mmol)和DCM (250mL)的混合物，然后在10分钟内添加纯净的异氰酸基甲酸乙酯(9.61g， 73.2mmol)。使所得溶液温热至室温并维持2h。浓缩该溶液，将残余物与 50∶50己烷/醚一起磨碎，得到固体的标题化合物(21.8g，90％)。MS(ESI)： C₁₈H₁₉FN₂O₃S的质量计算值为362.1；m/z实测值为363.1[M+H]⁺。

步骤C：制备1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟-4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2- 基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯。向1-(4-(2，6-二甲基苯氧基)-3-氟苯基)-3-乙氧羰基 硫脲(100g，276mmol)、吡唑-4-羧酸乙酯(45.4g，290mmol)和DCM(1L)的溶液 中添加纯净的二异丙基碳二亚胺(45.4g，290mmol)。将该溶液在室温下维持 24h，然后进行浓缩。将残余物在冰浴中用醚(500mL)搅拌3h，然后进行过 滤。将滤液浓缩为较浓的橙色油状物(180g，大约70％纯度，97％)。将该 材料的一部分(20g，大约30mmol)溶解于DCE(150mL)中，然后添加纯净 TiCl₄。然后将混合物加热回流6h，然后在冰浴中冷却。添加EtOH (750mL)，并将混合物搅拌3h。通过过滤收集所得沉淀，用低温EtOH冲 洗，并干燥，从而得到标题化合物(3.9g，31％)。1H NMR(500MHz， DMSO)：13.03(s，1H)，8.95(d，J＝0.6Hz，1H)，8.29(s，1H)，7.75(d，J＝ 11.5Hz，1H)，7.31-7.24(m，2H)，7.22(dd，J＝8.5，6.4Hz，1H)，6.96(d，J＝ 9.1Hz，1H)，4.29(q，J＝7.1Hz，2H)，2.11(s，6H)，1.32(t，J＝7.1Hz，3H)。

步骤D：制备1-[4-氯-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡 唑-4-羧酸乙酯。将上述1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-4-氧代-3，4-二氢-喹唑 啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(5.0g，12mmol)、LiCl(2.5g，59mmol)、POCl₃(5.5ml，59mmol)、DIEA(10mL，59mmol)和乙腈(ACN)(50mL)的混合物加热 回流6h。使混合物冷却至室温，然后进行浓缩。将残余物用最小量的DCM 吸收，并通过硅胶滤垫，用50∶50己烷/EtOAc洗脱。浓缩所得溶液，从而得 到标题化合物。(5.2g，＞99％)。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：9.13(d，J＝ 0.6Hz，1H)，8.23(d，J＝0.6Hz，1H)，7.92(d，J＝10.7Hz，1H)，7.23-7.19(m，3H)， 7.07(d，J＝8.6Hz，1H)，4.36(q，J＝7.1Hz，2H)，2.19(s，6H)，1.40(t，J＝7.1Hz， 3H)。

步骤E：制备1-[4-氨基-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡 唑-4-羧酸乙酯。向上述1-[4-氯-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H- 吡唑-4-羧酸乙酯(120mg，0.27mmol)和THF(2mL)的溶液中添加氨(7M， 0.39mL，2.7mmol)的甲醇溶液。将混合物搅拌6h，然后进行浓缩。将残余物 与Et₂O一起磨碎，得到标题化合物(72mg，64％)。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：8.96(d，J＝0.8Hz，1H)，8.44-8.02(m，3H)，7.71(d，J＝11.9Hz， 1H)，7.37(d，J＝9.0Hz，1H)，7.24-7.20(m，2H)，7.17(dd，J＝8.6，6.2Hz，1H)， 4.27(q，J＝7.1Hz，2H)，2.12(s，6H)，1.31(t，J＝7.1Hz，3H)。

步骤F：制备1-[4-氨基-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡 唑-4-羧酸。将1-[4-氨基-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑- 4-羧酸乙酯(65mg，0.15mmol)、1M LiOH水溶液(1.5mL，1.5mmol)和THF (3mL)的混合物加热至40℃，持续16h，同时快速搅拌。然后在冰浴中冷却 该反应物，并添加1M HCl(1.5mL，1.5mmol)。通过过滤收集所得沉淀，用 水冲洗，并干燥，从而得到标题化合物(45mg，74％)。MS(ESI)： C₂₀H₁₆FN₅O₃的质量计算值为393.1；m/z实测值为394.1[M+H]⁺。¹H NMR (500MHz，DMSO-d₆)：12.72(s，1H)，8.91(d，J＝0.7Hz，1H)，8.42-7.98(m， 3H)，7.70(d，J＝11.9Hz，1H)，7.37(d，J＝9.0Hz，1H)，7.25-7.20(m，2H)，7.17 (dd，J＝8.6，6.2Hz，1H)，2.12(s，6H)。

实例2：1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-4-甲基氨基-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用甲胺制备该标题化合物。MS (ESI)：C₂₁H₁₈FN₅O₃的质量计算值为407.1；m/z实测值为408.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.76(s，1H)，8.99(d，J＝0.7Hz，1H)，8.60(d，J＝ 4.5Hz，1H)，8.08(d，J＝0.7Hz，1H)，7.71(d，J＝11.9Hz，1H)，7.34(d，J＝8.9Hz， 1H)，7.27-7.22(m，2H)，7.19(dd，J＝8.6，6.2Hz，1H)，3.00(d，J＝4.5Hz，3H)， 2.12(s，6H)。

实例3：1-[4-二甲基氨基-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。 MS(ESI)：C₂₂H₂₀FN₅O₃的质量计算值为421.2；m/z实测值为422.1 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.97(d，J＝0.7Hz，1H)， 8.09(d，J＝0.7Hz，1H)，7.79(d，J＝11.9Hz，1H)，7.32-7.16(m，3H)，6.99(d，J ＝9.1Hz，1H)，3.12(s，6H)，2.13(s，6H)。

实例4：1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-4-哌啶-1-基-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用哌啶制备该标题化合物。MS (ESI)：C₂₅H₂₄FN₅O₃的质量计算值为461.2；m/z实测值为462.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.96(d，J＝0.7Hz，1H)，8.09(d，J＝ 0.7Hz，1H)，7.83(d，J＝11.8Hz，1H)，7.31-7.19(m，3H)，6.70(d，J＝9.1Hz， 1H)，3.58-3.48(m，4H)，2.13(s，6H)，1.66-1.53(m，2H)，1.47-1.35(m， 4H)。

实例5：1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-4-吡咯烷-1-基-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。 MS(ESI)：C₂₄H₂₂FN₅O₃的质量计算值为447.2；m/z实测值为448.2 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.74(s，1H)，8.95(s，1H)，8.08(s， 1H)，7.75(d，J＝12.0Hz，1H)，7.30-7.12(m，4H)，3.66-3.48(m，4H)，2.14(s， 6H)，1.91-1.80(m，4H)。

实例6：1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-4-苯基氨基-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用苯胺，并加热至80℃持续 16h，制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₆H₂₀FN₅O₃的质量计算值为469.2； m/z实测值为470.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.76(s，1H)， 10.14(s，1H)，8.69(d，J＝0.7Hz，1H)，8.07(d，J＝0.7Hz，1H)，7.82(d，J＝ 11.8Hz，1H)，7.71-7.59(m，3H)，7.47-7.39(m，2H)，7.28-7.15(m，4H)，2.16(s， 6H)。

实例7：1-[4-(2-氯-苯基氨基)-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用2-氯苯胺，并加热至80℃持 续16h，制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₆H₁₉ClFN₅O₃的质量计算值为 503.1；m/z实测值为504.0[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.72(s， 1H)，10.30(s，1H)，8.42(d，J＝0.7Hz，1H)，8.03(d，J＝0.7Hz，1H)，7.85(d，J＝ 11.8Hz，1H)，7.66-7.59(m，2H)，7.54(dd，J＝7.8，1.7Hz，1H)，7.48-7.38(m， 2H)，7.28-7.23(m，2H)，7.19(dd，J＝8.3，6.6Hz，1H)，2.17(s，6H)。

实例8：1_-[6_-(2，6_-二甲基_-苯氧基)_-7_-氟-4_-丙基氨基_-喹唑啉_-2_-基]-1H_-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用丙胺制备该标题化合物。MS (ESI)：C₂₃H₂₂FN₅O₃的质量计算值为435.2；m/z实测值为436.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.76(s，1H)，8.94(d，J＝0.7Hz，1H)，8.67(t，J＝ 5.6Hz，1H)，8.09(d，J＝0.7Hz，1H)，7.70(d，J＝11.9Hz，1H)，7.39(d，J＝8.9Hz， 1H)，7.27-7.14(m，3H)，3.49(dd，J＝14.0，6.1Hz，2H)，2.12(s，6H)，1.71-1.57 (m，2H)，0.90(t，J＝7.4Hz，3H)。

实例9：(外消旋)-1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-4-(2-甲氧基-1-甲基-乙基氨基)-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用外消旋2-甲氧基-1-甲基乙胺 制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₄FN₅O₄的质量计算值为465.2；m/z实 测值为467.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.82(s，1H)，8.96(d， J＝0.7Hz，1H)，8.37(d，J＝7.9Hz，1H)，8.09(d，J＝0.7Hz，1H)，7.67(d，J＝ 11.8Hz，1H)，7.54(d，J＝8.9Hz，1H)，7.20-7.08(m，3H)，4.80-4.67(m，1H)， 3.51(dd，J＝9.7，6.5Hz，1H)，3.44-3.35(m，1H，部分被水阻塞)，3.24(d， J＝3.3Hz，3H)，2.11(s，6H)，1.21(d，J＝6.8Hz，3H)。

实例10：1-[4-(2-二乙基氨基-乙基氨基)-6-(2，6-二甲基-苯氧基)-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用2-二甲基氨基乙胺制备该标 题化合物。MS(ESI)：C₂₆H₂₉FN₆O₃的质量计算值为492.2；m/z实测值为 493.5[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：9.00(s，1H)，8.83(s，1H)，8.15 (s，1H)，7.76(d，J＝11.8Hz，1H)，7.34(d，J＝8.8Hz，1H)，7.27-7.14(m，3H)， 3.71(d，J＝5.3Hz，2H)，3.08-2.84(m，6H)，2.12(s，6H)，1.07(t，J＝7.0Hz， 6H)。

实例11：1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-4-二丁基氨基-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用二丁胺制备该标题化合物。 MS(ESI)：C₂₈H₃₂FN₅O₃的质量计算值为505.2；m/z实测值为506.3 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.76(s，1H)，8.87(d，J＝0.7Hz，1H)， 8.09(d，J＝0.7Hz，1H)，7.79(d，J＝11.8Hz，1H)，7.30-7.17(m，3H)，6.90(d，J ＝9.0Hz，1H)，3.47-3.40(m，4H)，2.13(s，6H)，1.52-1.37(m，4H)，1.15-1.03 (m，4H)，0.85(t，J＝7.3Hz，6H)。

实例12：1-[6-(2，6-二甲基-苯氧基)-4-二丙基氨基-7-氟-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用二丙胺制备该标题化合物。 MS(ESI)：C₂₆H₂₈FN₅O₃的质量计算值为477.2；m/z实测值为478.4 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.87(d，J＝0.6Hz，1H)， 8.10(d，J＝0.6Hz，1H)，7.79(d，J＝11.8Hz，1H)，7.30-7.24(m，2H)，7.20(dd，J ＝8.4，6.6Hz，1H)，6.88(d，J＝9.0Hz，1H)，3.43-3.37(m，4H)，2.13(s，6H)，1.55 -1.41(m，4H)，0.70(t，J＝7.4Hz，6H)。

实例13：1-(4-((环己基甲基)氨基)-6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用环己烷甲胺制备该标题化合 物。MS(ESI)：C₂₇H₂₈FN₅O₃的质量计算值为490.1；m/z实测值为489.2 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：8.90(d，J＝0.6Hz，1H)，8.65(t，J＝ 5.7Hz，1H)，8.08(d，J＝0.6Hz，1H)，7.68(d，J＝11.9Hz，1H)，7.43(d，J＝8.9Hz， 1H)，7.25-7.14(m，J＝8.5，6.8Hz，3H)，3.39(t，J＝6.0Hz，2H)，2.12(s，6H)， 1.73-1.53(m，6H)，1.14(t，J＝9.4Hz，3H)，0.97(t，J＝11.6Hz，2H)。

实例14：1-((4-环丙基氨基)-6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用环丙胺制备该标题化合物。 MS(ESI)：C₂₃H₂₀FN₅O₃的质量计算值为433.2；m/z实测值为434.0 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，9.00(d，J＝0.7Hz，1H)， 8.72(d，J＝2.7Hz，1H)，8.10(d，J＝0.7Hz，1H)，7.72(d，J＝11.8Hz，1H)，7.41(d， J＝8.9Hz，1H)，7.23-7.13(m，3H)，3.04-2.93(m，1H)，2.11(s，6H)，0.88-0.76 (m，2H)，0.68-0.57(m，2H)。

实例15：1-((4-环丙烷甲基氨基)-6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用环丙烷甲胺制备该标题化合 物。MS(ESI)：C₂₄H₂₂FN₅O₃的质量计算值为447.2；m/z实测值为448.0 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.75(s，1H)，8.95(d，J＝0.7Hz，1H)， 8.76(t，J＝5.7Hz，1H)，8.09(d，J＝0.7Hz，1H)，7.71(d，J＝11.8Hz，1H)，7.39(d， J＝8.9Hz，1H)，7.28-7.14(m，J＝8.5，6.9Hz，3H)，3.43-3.38(m，2H)，2.13(s， 6H)，1.29-1.14(m，1H)，0.48-0.40(m，2H)，0.35-0.27(m，2H)。

实例16：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用4-氨基四氢-2H-吡喃制备该 标题化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₄FN₅O₄的质量计算值为477.2；m/z实测值为 478.0[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.95(d，J＝ 0.5Hz，1H)，8.29(d，J＝7.5Hz，1H)，8.10(d，J＝0.5Hz，1H)，7.70(d，J＝11.8Hz， 1H)，7.49(d，J＝8.9Hz，1H)，7.24-7.12(m，3H)，4.55-4.39(m，1H)，3.91(dd， J＝11.0，4.0Hz，2H)，3.65-3.56(m，2H)，3.45(t，J＝11.1Hz，2H)，2.12(s，6H)， 1.87(dd，J＝12.4，2.6Hz，2H)，1.78-1.73(m，2H)，1.72-1.59(m，2H)。

实例17：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟-4-(4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷制 备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₆H₂₇FN₆O₃的质量计算值为490.2；m/z实测 值为491.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：8.94(s，1H)，8.09(d，J＝ 0.4Hz，1H)，7.81(d，J＝11.9Hz，1H)，7.32-7.18(m，3H)，6.89(d，J＝9.1Hz，1H)， 3.84-3.73(m，2H)，3.66(t，J＝5.9Hz，2H)，2.73-2.54(m，4H)，2.31(s，3H)， 2.13(s，6H)，1.87-1.75(m，2H)。

实例18：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟-4-硫代吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用硫代吗啉制备该标题化合 物。MS(ESI)：C₂₄H₂₂FN₅O₃S的质量计算值为479.1；m/z实测值为480.0 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.79(s，1H)，8.98(d，J＝0.7Hz，1H)， 8.11(d，J＝0.7Hz，1H)，7.88(d，J＝11.8Hz，1H)，7.33-7.21(m，3H)，6.65(d，J ＝9.1Hz，1H)，3.86-3.75(m，4H)，2.56-2.51(m，4H)，2.14(s，6H)。

实例19：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟-4-(4-羟基哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用4-羟基哌啶制备该标题化合 物。MS(ESI)：C₂₅H₂₄FN₅O₃的质量计算值为477.2；m/z实测值为478.1 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆）：12.78(s，1H)，8.96(d，J＝0.7Hz，1H)， 8.10(d，J＝0.7Hz，1H)，7.84(d，J＝11.8Hz，1H)，7.32-7.19(m，3H)，6.71(d，J ＝9.1Hz，1H)，4.81(d，J＝4.0Hz，1H)，3.87-3.66(m，3H)，3.32-3.24(m，2H)， 1.73-1.61(m，2H)，1.35-1.13(m，2H)。

实例20：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS (ESI)：C₂₄H₂₂FN₅O₄的质量计算值为436.2；m/z实测值为464.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.79(s，1H)，9.00(d，J＝0.7Hz，1H)，8.11(d，J＝ 0.7Hz，1H)，7.89(d，J＝11.8Hz，1H)，7.31-7.21(m，3H)，6.68(d，J＝9.1Hz，1H)， 3.56(s，8H)，2.12(s，6H)。

实例21：1-(4-(4-乙酰氨基哌啶-1-基)-6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1的方式，在步骤E中使用4-乙酰氨基哌啶制备该标题 化合物。MS(ESI)：C₂₇H₂₇FN₆O₄的质量计算值为518.2；m/z实测值为519.1 [M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆）：12.80(s，1H)，8.97(d，J＝0.7Hz，1H)， 8.11(d，J＝0.7Hz，1H)，7.91-7.80(m，2H)，7.32-7.19(m，3H)，6.70(d，J＝ 9.0Hz，1H)，3.96(d，J＝13.5Hz，2H)，3.88-3.76(m，1H)，3.20(t，J＝11.1Hz， 2H)，2.14(s，6H)，1.80(s，3H)，1.75-1.66(m，2H)，1.34-1.20(m，2H)。

实例22：1-(6-环己基-4-甲基氨基-喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B-F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并且 在步骤E中使用甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₁N₅O₂的质量计算 值为351.2；m/z实测值为352.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)： 12.74(s，1H)，9.04(s，1H)，8.78(s，1H)，8.10(s，2H)，7.70(d，J＝8.6Hz，1H)， 7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，3.17-3.07(m，3H)，2.65(t，J＝11.5Hz，1H)，1.95-1.80 (m，4H)，1.75(d，J＝12.5Hz，1H)，1.60-1.35(m，4H)，1.30-1.20(m，1H)。

实例23：1-[6-环己基-4-(2，6-二甲基-苄基氨基)-喹唑啉-2-基]-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B-F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并且 在步骤E中使用2，6-二甲基苄胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₇H₂₉N₅O₂的质量计算值为455.2；m/z实测值为456.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：12.72(s，1H)，9.09(s，1H)，8.56(s，1H)，8.26(s，1H)，8.11(s，1H)， 7.75-7.63(m，2H)，7.20-7.13(m，1H)，7.13-7.06(m，2H)，4.87(d，J＝4.3Hz， 2H)，2.68-2.56(m，1H)，2.38(s，6H)，1.82(t，J＝12.0Hz，4H)，1.71(d，J＝ 12.9Hz，1H)，1.55-1.43(m，2H)，1.43-1.30(m，2H)，1.30-1.18(m，1H)。

实例24：1-(4-氨基-6-环己基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用氨的二氧杂环己烷溶液制备该标题化合物。MS(ESI)： C₁₈H₁₉N₅O₂的质量计算值为337.2；m/z实测值为338.2[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)13.57-11.64(m，1H)，8.93(s，1H)，8.59(s，2H)，8.17(d，J ＝9.6Hz，2H)，7.75(q，J＝8.7Hz，2H)，2.66(t，J＝11.7Hz，1H)，1.86(t，J＝ 12.7Hz，4H)，1.75(d，J＝12.2Hz，1H)，1.59-1.34(m，4H)，1.34-1.21(m， 1H)。

实例25：1-(6-环己基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₅N₅O₂的质量 计算值为391.2；m/z实测值为392.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO- d₆)：12.80(s，1H)，9.04(s，1H)，8.17(s，1H)，8.12(s，1H)，7.77(s，2H)，4.05(s， 4H)，2.81-2.66(m，1H)，2.03(s，4H)，1.92-1.79(m，4H)，1.73(d，J＝12.8Hz， 1H)，1.58-1.35(m，4H)，1.31-1.16(m，1H)。

实例26：1-(6-环己基-4-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₇N₅O₂的质量计 算值为405.2；m/z实测值为406.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆) 12.78-11.82(m，1H)，8.99(s，1H)，8.10(s，1H)，7.75(s，2H)，7.73(s，1H)，3.85 (s，4H)，2.69(s，1H)，1.94-1.89(m，2H)，1.83-1.75(m，2H)，1.75(s，6H)，1.55- 1.39(m，4H)，1.34-1.28(m，2H)。

实例27：1-(6-环己基-4-(二乙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₇N₅O₂的质量 计算值为393.2；m/z实测值为394.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.76(s，1H)，8.94(s，1H)，8.10(s，1H)，7.80(s，1H)，7.73(s，1H)，7.72(s， 1H)，3.82(q，J＝6.9Hz，4H)，2.67(s，1H)，1.91(s，2H)，1.84(s，2H)，1.74(d，J＝ 12.1Hz，1H)，1.51-1.35(m，11H)。

实例28：1-(6-环己基-4-(苯基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用苯胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₃N₅O₂的质量计 算值为413.2；m/z实测值为414.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 12.79(s，1H)，10.22(s，1H)，8.82(s，1H)，8.45(s，1H)，8.13(s，1H)，7.91(d，J＝ 7.6Hz，2H)，7.81(d，J＝8.6Hz，1H)，7.76(d，J＝8.5Hz，1H)，7.52-7.45(m，2H)， 7.23(t，J＝7.4Hz，1H)，3.65-3.56(m，1H)，2.72(t，J＝11.8Hz，1H)，1.96-1.83 (m，4H)，1.82-1.72(m，2H)，1.66-1.52(m，2H)，1.44-1.32(m，2H)，1.30-1.23 (m，1H)。

实例29：1-(4-((2-氯苯基)氨基)-6-环己基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用2-氯苯胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₂ClN₅O₂的 质量计算值为447.2；m/z实测值为448.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：10.35(s，1H)，8.50(s，1H)，8.42(s，1H)，8.04(s，1H)，7.83(dd，J＝ 8.7，1.7Hz，1H)，7.76(d，J＝8.6Hz，1H)，7.69(dd，J＝4.0，1.6Hz，1H)，7.67(dd， J＝3.9，1.6Hz，1H)，7.51(td，J＝7.6，1.5Hz，1H)，7.43(td，J＝7.7，1.7Hz，1H)， 2.83-2.64(m，1H)，1.94(d，J＝11.8Hz，2H)，1.87(d，J＝12.7Hz，2H)，1.79- 1.73(m，1H)，1.68-1.51(m，2H)，1.51-1.36(m，2H)，1.36-1.22(m，1H)。

实例30：1-(4-(4-氰基哌啶-1-基)-6-环己基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用4-氰基哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₆N₆O₂的 质量计算值为430.2；m/z实测值为431.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，9.02(s，1H)，8.11(s，1H)，7.78(s，2H)，7.75(s，1H)， 4.16-4.09(m，2H)，3.75-3.64(m，2H)，3.30-3.20(m，1H)，2.89-2.73(m，1H)， 2.27-2.14(m，2H)，2.01-1.91(m，2H)，1.88(d，J＝12.3Hz，2H)，1.84(d，J＝ 12.4Hz，2H)，1.74(d，J＝12.6Hz，1H)，1.57-1.36(m，5H)，1.35-1.23(m，1H)。

实例31：1-(6-环己基-4-(4-氟哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用4-氟哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₆FN₅O₂的 质量计算值为423.2；m/z实测值为424.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，9.01(s，1H)，8.11(s，1H)，7.78(s，3H)，5.19-4.93(m， 1H)，3.92-3.79(m，4H)，2.72-2.64(m，1H)，2.23-2.08(m，2H)，2.03-1.92(m， 2H)，1.89(d，J＝12.7Hz，2H)，1.83(d，J＝12.5Hz，2H)，1.74(d，J＝12.7Hz，1H)， 1.52-1.39(m，4H)，1.33-1.22(m，1H)。

实例32：1-(6-环己基-4-(环丙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用环丙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₃N₅O₂的质量 计算值为377.1；m/z实测值为378.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：9.33(s，1H)，9.14(s，1H)，8.26(s，1H)，8.25(s，1H)，7.83-7.73(m，2H)， 2.81-2.65(m，1H)，1.84(d，J＝8.0Hz，4H)，1.74-1.62(m，1H)，1.52-1.48(m， 2H)，1.46-1.33(m，2H)，1.26-1.14(m，1H)，0.98-0.88(m，2H)，0.88-0.80(m， 2H)。

实例33：1-(6-环己基-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₅N₅O₃的质量计 算值为407.2；m/z实测值为408.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 12.79(s，1H)，9.03(s，1H)，8.12(s，1H)，7.79(s，1H)，7.78(s，2H)，4.02-3.92(m， 4H)，3.82(d，J＝4.3Hz，4H)，2.73-2.64(m，1H)，1.92-1.85(m，4H)，1.73-1.68 (m，1H)，1.53-1.38(m，4H)，1.34-1.21(m，1H)。

实例34：1-(6-环己基-4-硫代吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用硫代吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₅N₅O₂S的 质量计算值为423.1；m/z实测值为424.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：12.80(s，1H)，9.01(s，1H)，8.11(s，1H)，7.78(s，2H)，7.73(s，1H)， 4.19-4.12(m，4H)，2.98-2.87(m，4H)，2.72-2.64(m，1H)，2.06-1.89(m，2H)， 1.88-1.82(m，2H)，1.76-1.70(m，1H)，1.52-1.39(m，4H)，1.29-1.14(m， 1H)。

实例35：1-(4-氰氨基-6-环己基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用氰氨基钠制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₁₈N₆O₂的质 量计算值为362.1；m/z实测值为363.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：13.19(s，1H)，8.89(s，1H)，8.43(s，1H)，7.97(s，1H)，7.87(d，J＝8.6Hz， 1H)，7.79(d，J＝8.6Hz，1H)，2.66(s，1H)，1.82(s，4H)，1.72-1.68(m，1H)，1.42 -1.30(m，4H)，1.26-1.19(m，1H)。

实例36：1-(4-(叔丁基氨基)-6-环己基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用叔丁胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₇N₅O₂的质量 计算值为393.2；m/z实测值为394.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：13.27-12.44(m，1H)，8.89(s，1H)，8.29(s，1H)，8.18(s，1H)，7.94(s，1H)， 7.76-7.71(m，1H)，7.69(d，J＝8.6Hz，1H)，2.67(t，J＝11.8Hz，1H)，1.85(d，J＝ 10.5Hz，4H)，1.75(d，J＝12.4Hz，1H)，1.63(s，9H)，1.59-1.50(m，2H)，1.48- 1.38(m，2H)，1.35-1.24(m，1H)。

实例37：1-(4-(氮杂环庚烷-1-基)-6-环己基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用高哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₉N₅O₂的质量 计算值为419.2；m/z实测值为420.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.76(s，1H)，8.95(s，1H)，8.09(s，1H)，7.92(s，1H)，7.74-7.69(m，2H)， 4.08-3.96(m，4H)，2.68(s，1H)，1.98(s，4H)，1.89(d，J＝10.5Hz，2H)，1.83(d， J＝12.0Hz，2H)，1.73(d，J＝11.9Hz，1H)，1.61(s，4H)，1.57-1.44(m，4H)，1.27 (d，J＝12.2Hz，1H)。

实例38：1-(6-环己基-4-(二甲基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₀H₂₃N₅O₂的质量 计算值为365.2；m/z实测值为366.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：13.57-11.86(m，1H)，9.11(s，1H)，8.24(s，1H)，8.05(s，1H)，7.82(q，J＝ 8.8Hz，2H)，3.54(s，6H)，2.73(t，J＝11.5Hz，1H)，1.85(t，J＝12.7Hz，4H)，1.73 (d，J＝11.6Hz，1H)，1.57-1.44(m，4H)，1.34-1.20(m，1H)。

实例39：1-(6-环己基-4-((环己基甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用环己基甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₅H₃₁N₅O₂的 质量计算值为433.2；m/z实测值为434.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.76(s，1H)，8.95(s，1H)，8.09(s，1H)，7.92(s，1H)，7.74-7.69(m， 2H)，4.08-3.96(m，4H)，2.68(s，1H)，1.98(s，4H)，1.89(d，J＝10.5Hz，2H)， 1.83(d，J＝12.0Hz，2H)，1.73(d，J＝11.9Hz，1H)，1.61(s，4H)，1.44-1.31(m， 4H)，1.27(d，J＝12.2Hz，1H)。

实例40：1-(6-环己基-4-(甲基磺酰氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己基苯胺并 且在步骤E中使用甲烷磺酰胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₁N₅O₄S， 415.1；m/z实测值为416.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：12.88(s， 1H)，8.93(s，1H)，8.32(s，1H)，8.26(s，1H)，7.91-7.81(m，2H)，3.65(s，3H)， 2.70(t，J＝11.6Hz，1H)，1.87(t，J＝14.8Hz，4H)，1.79-1.70(m，1H)，1.59-1.34 (m，5H)，1.28-1.12(m，1H)。

实例41：1-(4-(二甲基氨基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₀H₁₇N₅O₂的质量计 算值为359.1；m/z实测值为360.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 9.11(s，1H)，8.45(s，1H)，8.21(s，1H)，8.18(d，J＝8.7，1H)，7.94(d，J＝8.7Hz， 1H)，7.81(d，J＝7.7Hz，2H)，7.53(t，J＝7.7Hz，2H)，7.43(t，J＝7.3Hz，1H)，3.59 (s，6H)。

实例42：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用N-甲基乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₉N₅O₂的 质量计算值为373.1；m/z实测值为374.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：13.24-12.33(m，1H)，9.05(s，1H)，8.37(s，1H)，8.19(s，1H)，8.17 (dd，J＝8.8，2.0Hz，1H)，7.92(d，J＝8.7Hz，1H)，7.83-7.78(m，2H)，7.53(t，J＝ 7.6Hz，2H)，7.43(t，J＝7.4Hz，1H)，3.96(q，J＝7.0Hz，2H)，3.57(s，3H)，1.41(t， J＝7.0Hz，3H)。

实例43：1-(6-苯基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₂的质量计 算值为385.1；m/z实测值为386.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 9.09(s，1H)，8.51(s，1H)，8.24(s，1H)，8.20(dd，J＝8.7，1.6Hz，1H)，7.96(d，J＝ 8.7Hz，1H)，7.85-7.79(m，2H)，7.53(t，J＝7.6Hz，2H)，7.44(t，J＝7.4Hz，1H)， 4.16(s，4H)，2.05(s，4H)。

实例44：1-(6-苯基-4-(苯基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用苯胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₁₇N₅O₂的质量计算 值为407.1；m/z实测值为408.0[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 12.81(s，1H)，10.39(s，1H)，8.94(s，1H)，8.86(s，1H)，8.25(dd，J＝8.7，1.9Hz， 1H)，8.14(d，J＝0.6Hz，1H)，7.93-7.81(m，5H)，7.58(t，J＝7.7Hz，2H)，7.49 (dd，J＝15.4，7.2Hz，3H)，7.25(t，J＝7.4Hz，1H)。

实例45：1-(6-苯基-4-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₁N₅O₂的质量计算 值为399.1；m/z实测值为400.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 12.80(s，1H)，9.03(s，1H)，8.19-8.12(m，3H)，7.92-7.87(m，1H)，7.83-7.77 (m，2H)，7.54(t，J＝7.6Hz，2H)，7.43(t，J＝7.4Hz，1H)，3.94(s，4H)，1.77(s， 6H)。

实例46：1-(4-(二乙基氨基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₂的质量计 算值为387.1；m/z实测值为388.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 8.97(s，1H)，8.22(d，J＝1.8Hz，1H)，8.14(dd，J＝8.9，2.1Hz，1H)，8.13(s，1H)， 7.87(d，J＝8.7Hz，1H)，7.81-7.75(m，2H)，7.54(t，J＝7.7Hz，2H)，7.43(t，J＝ 7.4Hz，1H)，3.89(q，J＝6.9Hz，4H)，1.45(t，J＝7.0Hz，6H)。

实例47：1-(4-((2-氯苯基)氨基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用2-氯苯胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₁₆ClN₅O₂的质 量计算值为441.1；m/z实测值为442.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：10.56(s，1H)，8.94(s，1H)，8.54(s，1H)，8.29(dd，J＝8.7，1.9Hz，1H)，8.07 (s，1H)，7.93(d，J＝8.7Hz，3H)，7.75-7.68(m，2H)，7.58(t，J＝7.7Hz，2H)，7.62 -7.53(m，1H)，7.49-7.42(m，2H)。

实例48：1-(4-(氮杂环庚烷-1-基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用高哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₃N₅O₂的质量计 算值为413.1；m/z实测值为414.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 12.81(s，1H)，9.00(s，1H)，8.34(s，1H)，8.14(dd，J＝8.3，1.2Hz，2H)，7.88(d，J ＝8.7Hz，1H)，7.81-7.75(m，2H)，7.53(t，J＝7.7Hz，2H)，7.45-7.40(m，1H)， 4.15-4.02(m，4H)，2.01(s，4H)，1.62(s，4H)。

实例49：1-(4-((环己基甲基)氨基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用N-甲基环己胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₅N₅O₂的质量计算值为427.2；m/z实测值为428.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.80(s，1H)，9.02(s，1H)，8.97(s，1H)，8.70(s，1H)，8.19-8.12(m， 2H)，7.89-7.84(m，2H)，7.82(d，J＝8.7Hz，1H)，7.55(t，J＝7.7Hz，2H)，7.44(t， J＝7.3Hz，1H)，3.56(s，3H)，1.92-1.83(m，3H)，1.81-1.72(m，2H)，1.64(s， 1H)，1.31-1.13(m，3H)，1.13-1.08(m，2H)。

实例50：1-(4-氰氨基-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用氰氨基钠制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₁₂N₆O₂的质量 计算值为356.1；m/z实测值为357.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO- d₆)：13.15(s，1H)，8.91(s，1H)，8.40(s，1H)，8.35(s，1H)，8.19(dd，J＝8.7， 2.0Hz，1H)，7.97(d，J＝8.6Hz，1H)，7.76(d，J＝7.4Hz，2H)，7.52(t，J＝7.6Hz， 2H)，7.43(t，J＝7.4Hz，1H)。

实例51：1-(4-(环丙基氨基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用环丙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₇N₅O₂的质量计 算值为371.1；m/z实测值为372.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 9.36(s，1H)，9.14(s，1H)，8.75(s，1H)，8.24-8.22(m，1H)，8.21(dd，J＝8.7， 1.9Hz，1H)，7.90(d，J＝8.7Hz，1H)，7.88-7.85(m，2H)，7.55(dd，J＝10.5， 4.8Hz，2H)，7.48-7.40(m，1H)，3.44-3.38(m，1H)，1.00-0.90(m，2H)，0.89- 0.80(m，2H)。

实例52：1-(4-(叔丁基氨基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用叔丁胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₂的质量计 算值为387.1；m/z实测值为388.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 8.93(s，1H)，8.77(s，1H)，8.23(s，1H)，8.21(s，1H)，8.16(dd，J＝8.7，1.9Hz，1H)， 7.87(dd，J＝12.5，5.0Hz，3H)，7.55(t，J＝7.6Hz，2H)，7.44(t，J＝8.4Hz，1H)， 1.66(s，9H)。

实例53：1-(4-氨基-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用氨的二氧杂环己烷溶液制备该标题化合物。MS(ESI)： C₁₈H₁₃N₅O₂的质量计算值为331.1；m/z实测值为332.1[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：13.34-12.10(m，1H)，8.98(s，1H)，8.73(s，1H)，8.68(d， J＝1.9Hz，1H)，8.55(s，1H)，8.21(dd，J＝8.7，1.9Hz，1H)，8.15(s，1H)，7.89- 7.83(m，3H)，7.55(t，J＝7.7Hz，2H)，7.43(t，J＝7.4Hz，1H)。

实例54：1-(6-苯基-4-硫代吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用硫代吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₂S的质 量计算值为417.1；m/z实测值为418.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO- d₆)：12.79(s，1H)，9.04(s，1H)，8.18(dd，J＝8.7，2.0Hz，1H)，8.15(d，J＝1.9Hz， 1H)，8.14(d，J＝0.7Hz，1H)，7.92(d，J＝8.7Hz，1H)，7.85-7.80(m，2H)，7.57- 7.52(m，2H)，7.46-7.41(m，1H)，4.26-4.16(m，4H)，2.94-2.79(m，4H)。

实例55：1-(4-(4-乙酰氨基哌啶-1-基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用N-(哌啶-4-基)乙酰胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₅H₂₄N₆O₃的质量计算值为456.1；m/z实测值为457.1[M+H]⁺。¹H NMR (500MHz，DMSO-d₆)：12.81(s，1H)，9.05(s，1H)，8.17(d，J＝8.7Hz，1H)，8.14 (s，2H)，7.92(d，J＝8.7Hz，2H)，7.80(dd，J＝8.3，1.1Hz，2H)，7.54(dd，J＝10.5， 4.9Hz，2H)，7.44-7.38(m，1H)，4.48-4.36(m，2H)，4.05-3.91(m，1H)，3.52(t， J＝11.5Hz，2H)，2.00(d，J＝9.5Hz，2H)，1.84(s，3H)，1.62-1.51(m，2H)。

实例56：1-(6-苯基-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用4-氨基四氢吡喃制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₁N₅O₃的质量计算值为415.1；m/z实测值为416.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：9.12(s，1H)，9.05(s，1H)，8.79(s，1H)，8.22(s，1H)，8.20(dd，J＝ 8.8，1.9Hz，1H)，7.89(dd，J＝8.2，6.7Hz，3H)，7.56(t，J＝7.6Hz，2H)，7.45(t，J＝ 7.4Hz，1H)，4.76-4.60(m，1H)，3.98(dd，J＝11.2，3.2Hz，2H)，3.56(dd，J＝ 11.8，10.1Hz，2H)，1.99(dd，J＝12.5，2.4Hz，2H)，1.80-1.72(m，2H)。

实例57：1-(4-(4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用N-甲基高哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₄N₆O₂的质量计算值为428.2；m/z实测值为429.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.10-11.18(m，1H)，9.05(s，1H)，8.32(s，1H)，8.16(dd，J＝8.7， 1.8Hz，1H)，8.14(s，1H)，7.89(d，J＝8.7Hz，1H)，7.83-7.79(m，2H)，7.53(t，J＝ 7.6Hz，2H)，7.43(t，J＝7.3Hz，1H)，4.28(d，J＝16.6Hz，2H)，4.24(s，2H)，3.51 (s，2H)，3.18(s，2H)，2.69(s，3H)，2.35(s，2H)。

实例58：1-(4-吗啉代-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₃的质量计算 值为401.1；m/z实测值为402.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)： 13.09-12.49(m，1H)，9.09(s，1H)，8.21(s，1H)，8.18(dd，J＝8.7，2.0Hz，1H)， 8.16(s，1H)，7.94(d，J＝8.7Hz，1H)，7.82(dd，J＝8.3，1.1Hz，2H)，7.54(dd，J＝ 10.5，4.9Hz，2H)，7.46-7.41(m，1H)，4.12-4.01(m，4H)，3.88-3.77(m，4H)。

实例59：1-(4-(4-氰基哌啶-1-基)-6-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯基苯胺并且 在步骤E中使用4-氰基哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₀N₆O₂的质 量计算值为424.1；m/z实测值为425.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO- d₆)：13.35-12.09(m，1H)，9.09(s，1H)，8.19(dd，J＝8.7，1.9Hz，1H)，8.17(d，J ＝4.6Hz，2H)，7.94(d，J＝8.6Hz，1H)，7.86-7.80(m，2H)，7.55(dd，J＝10.5， 4.9Hz，2H)，7.47-7.41(m，1H)，4.29-4.16(m，2H)，3.87-3.76(m，2H)，3.30- 3.24(m，1H)，2.21-2.11(m，2H)，2.08-1.97(m，2H)。

实例60：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-(二乙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₀ClN₅O₃的质量计算值为437.1；m/z实测值为438.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.93(s，1H)，8.11(s，1H)，7.84(d，J＝9.1Hz，1H)， 7.66(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，7.56-7.50(m，2H)，7.31(d，J＝2.6Hz，1H)，7.27- 7.17(m，2H)，3.68(q，J＝6.9Hz，4H)，1.20(t，J＝7.0Hz，6H)。

实例61：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₈ClN₅O₃的质量计算值为435.1；m/z实测值为436.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：12.74(s，1H)，8.98(s，1H)，8.09(s，1H)，7.87(d，J＝2.1Hz，1H)， 7.80(d，J＝9.0Hz，1H)，7.57(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，7.49-7.44(m，2H)，7.15- 7.08(m，2H)，3.89(s，4H)，1.97(t，J＝6.3Hz，4H)。

实例62：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-(环丙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用环丙烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₆ClN₅O₃的质量计算值为421.0；m/z实测值为422.0[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，9.06(s，1H)，8.66(d，J＝3.6Hz，1H)，8.12(s，1H)， 8.04(d，J＝2.1Hz，1H)，7.82(d，J＝9.0Hz，1H)，7.58(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)， 7.50-7.43(m，2H)，7.14-7.06(m，2H)，3.26-3.15(m，1H)，0.91-0.83(m，2H)， 0.73-0.67(m，2H)。

实例63：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀ClN₅O₃的 质量计算值为449.1；m/z实测值为450.1[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz， DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，8.99(s，1H)，8.11(s，1H)，7.88(d，J＝9.1Hz，1H)， 7.64(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，7.54-7.48(m，2H)，7.34(d，J＝2.5Hz，1H)，7.24- 7.18(m，2H)，3.75(d，J＝5.3Hz，4H)，1.68(s，2H)，1.63(d，J＝3.7Hz，4H)。

实例64：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-((环己基甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用环己基甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₅H₂₄ClN₅O₃的质量计算值为477.2；m/z实测值为478.2[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，8.98(s，1H)，8.67(s，1H)，8.12(s，1H)， 8.10(d，J＝2.6Hz，1H)，7.80(d，J＝9.0Hz，1H)，7.57(dd，J＝9.0，2.6Hz，1H)， 7.49-7.44(m，2H)，7.14-7.09(m，2H)，3.48(t，J＝5.9Hz，2H)，1.77(d，J＝ 11.7Hz，3H)，1.67(t，J＝16.5Hz，3H)，1.19(t，J＝11.0Hz，3H)，1.03(t，J＝ 11.3Hz，2H)。

实例65：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-(4-氰基哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用4-氰基哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₄H₁₉ClN₆O₃的质量计算值为474.1；m/z实测值为475.1[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.80(s，1H)，9.03(s，1H)，8.12(s，1H)，7.91(d，J＝ 9.1Hz，1H)，7.65(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，7.53-7.49(m，2H)，7.42(d，J＝2.6Hz， 1H)，7.22-7.17(m，2H)，4.08-3.92(m，2H)，3.70-3.55(m，2H)，3.27-3.18(m， 1H)，2.03(d，J＝5.9Hz，2H)，1.88-1.72(m，2H)。

实例66：1-(4-(氮杂环庚烷-1-基)-6-(4-氯苯氧基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用高哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₂ClN₅O₃的质量计算值为474.1；m/z实测值为475.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.80(s，1H)，9.03(s，1H)，8.12(s，1H)，7.91(d，J＝9.1Hz，1H)， 7.65(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，7.53-7.49(m，2H)，7.42(s，1H)，7.22-7.17(m， 2H)，4.08-3.92(m，2H)，3.70-3.55(m，2H)，3.27-3.18(m，1H)，2.03(d，J＝ 5.9Hz，2H)，1.88-1.72(m，2H)。

实例67：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-硫代吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用硫代吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₂H₁₈ClN₅O₃S的质量计算值为467.1；m/z实测值为468.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：8.81(s，1H)，7.94(s，1H)，7.89(d，J＝9.1Hz，1H)， 7.64(dd，J＝9.1，2.7Hz，1H)，7.55-7.47(m，2H)，7.34(d，J＝2.7Hz，1H)，7.24- 7.17(m，2H)，4.04-3.95(m，4H)，2.82-2.73(m，4H)。

实例68：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用4-氨基四氢吡喃制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₃H₂₀ClN₅O₄的质量计算值为465.1；m/z实测值为466.2[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.81(s，1H)，9.02(s，1H)，8.41(d，J＝7.3Hz，1H)，8.21 (s，1H)，8.13(s，1H)，7.81(d，J＝9.1Hz，1H)，7.59(dd，J＝8.9，2.3Hz，1H)，7.50- 7.43(m，2H)，7.15-7.04(m，2H)，4.62-4.43(m，1H)，3.94(d，J＝8.6Hz，2H)， 3.49-3.44(m，2H)，1.95-1.82(m，2H)，1.68-1.52(m，2H)。

实例69：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-(苯基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用苯胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₁₆ClN₅O₃的 质量计算值为457.1；m/z实测值为458.1[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，10.16(s，1H)，8.83(s，1H)，8.39(d，J＝2.5Hz，1H)， 8.13(s，1H)，7.92-7.85(m，3H)，7.67(dd，J＝9.0，2.6Hz，1H)，7.53-7.43(m， 4H)，7.22(t，J＝7.4Hz，1H)，7.19-7.12(m，2H)。

实例70：1-(4-(4-乙酰氨基哌啶-1-基)-6-(4-氯苯氧基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用N-(哌啶-4-基)乙酰胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₅H₂₃ClN₆O₄的质量计算值为506.2；m/z实测值为507.2[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.83(s，1H)，9.01(s，1H)，8.13(s，1H)，7.89(dd，J＝8.4， 4.7Hz，2H)，7.65(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，7.55-7.45(m，2H)，7.38(d，J＝2.5Hz， 1H)，7.26-7.15(m，2H)，4.26(d，J＝13.4Hz，2H)，3.99-3.78(m，1H)，3.36(d，J ＝11.4Hz，2H)，1.88(d，J＝9.9Hz，2H)，1.80(s，3H)，1.48(dd，J＝20.8，10.3Hz， 2H)。

实例71：1-(6-(4-氯苯氧基)-4-(4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-(4-氯)苯氧基苯 胺并且在步骤E中使用N-甲基高哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₄H₂₃ClN₆O₃的质量计算值为484.2；m/z实测值为479.2[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：13.04-11.93(m，1H)，9.03(s，1H)，8.13(s，1H)，7.88(d， J＝9.1Hz，1H)，7.68(d，J＝2.4Hz，1H)，7.63(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，7.54-7.43 (m，2H)，7.18-7.10(m，2H)，4.05(s，3H)，3.47-3.32(m，3H)，3.29-3.14(m， 2H)，2.74(s，3H)，2.28(s，2H)。

实例72：1-(4-(叔丁基氨基)-6-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯氧基苯胺并 且在步骤E中使用叔丁胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₃的质量 计算值为403.2；m/z实测值为404.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO- d₆)：12.80(s，1H)，8.91(s，1H)，8.37(d，J＝2.6Hz，1H)，8.13(s，1H)，7.77(d，J ＝9.1Hz，2H)，7.51(dd，J＝9.0，2.6Hz，1H)，7.43-7.37(m，2H)，7.17-7.11(m， 1H)，7.06-6.97(m，2H)，1.60(s，9H)。

实例73：1-(6-苯氧基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯氧基苯胺并 且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₃的质量 计算值为401.2；m/z实测值为402.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO- d₆)：12.74(s，1H)，8.99(s，1H)，8.09(s，1H)，7.83(d，J＝2.6Hz，1H)，7.81(d，J ＝9.0Hz，1H)，7.56(dd，J＝9.0，2.6Hz，1H)，7.47-7.40(m，2H)，7.22-7.16(m， 1H)，7.13-7.08(m，2H)，3.88(s，4H)，1.96(t，J＝6.4Hz，4H)。

实例74：1-(4-(二乙基氨基)-6-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯氧基苯胺并 且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₃的质量 计算值为403.2；m/z实测值为404.2[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO- d₆)：12.75(s，1H)，8.92(s，1H)，8.10(s，1H)，7.84(d，J＝9.1Hz，1H)，7.65(dd，J ＝9.1，2.4Hz，1H)，7.50(t，J＝7.9Hz，2H)，7.27(dd，J＝8.9，5.0Hz，2H)，7.21(d， J＝7.8Hz，2H)，3.65(q，J＝6.9Hz，4H)，1.15(t，J＝6.9Hz，6H)。

实例75：1-(4-(环丙基氨基)-6-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯氧基苯胺并 且在步骤E中使用环丙烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₇N₅O₃的质量 计算值为387.1；m/z实测值为388.2[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.83(s，1H)，9.08(s，1H)，8.80(d，J＝3.4Hz，1H)，8.15(s，1H)，8.11(d，J ＝2.6Hz，1H)，7.83(d，J＝9.0Hz，1H)，7.55(dd，J＝9.0，2.6Hz，1H)，7.45-7.38 (m，2H)，7.20-7.13(m，1H)，7.09-7.03(m，2H)，3.27-3.14(m，1H)，0.96-0.83 (m，2H)，0.77-0.69(m，2H)。

实例76：1-(6-苯氧基-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苯氧基苯胺并 且在步骤E中使用4-氨基四氢吡喃制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₃H₂₁N₅O₄的质量计算值为431.2；m/z实测值为432.2[M+H]⁺。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，9.01(s，1H)，8.41(d，J＝7.4Hz，1H)，8.22 (d，J＝2.5Hz，1H)，8.12(s，1H)，7.80(d，J＝9.0Hz，1H)，7.54(dd，J＝9.0，2.6Hz， 1H)，7.45-7.37(m，2H)，7.16(t，J＝7.4Hz，1H)，7.05(dd，J＝8.7，1.0Hz，2H)， 4.53(dd，J＝11.4，4.1Hz，1H)，3.94(d，J＝8.8Hz，2H)，3.53-3.47(m，2H)，2.00 -1.90(m，2H)，1.72-1.63(m，2H)。

实例77：1-(4-(二甲基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

步骤A：制备1-(N-(乙氧羰基)-N′-(3-苯氧基苯基)甲脒基)-1H-吡唑-4-羧 酸乙酯。向3-苯氧基苯胺(0.93g，5.0mmol)和DCM(17mL)的混合物中添加纯 净的异氰酸基甲酸乙酯(0.65mL，5.5mmol)，并将所得溶液搅拌15分钟。依 次向反应混合物中添加吡唑-4-羧酸乙酯(0.77g，5.5mmol)和纯净的二异丙基 碳二亚胺(0.78mL，5.0mmol)。将溶液在室温下搅拌24h，然后浓缩。将残余 物在冰浴中用醚(10mL)搅拌3h，然后过滤。通过FCC(0至25％EtOAc/己 烷)纯化残余物，得到标题化合物(1.6g，76％，大约70％纯度)。MS (ESI/CI)：C₂₂H₂₂N₄O₅的质量计算值为422.1；m/z实测值为423.3[M+H]⁺。

步骤B：制备1-(4-氧代-7-苯氧基-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸 乙酯。在2分钟内，向1-(N-(乙氧羰基)-N′-(3-苯氧基苯基)甲脒基)-1H-吡唑- 4-羧酸乙酯(1.51g，大约2.51mmol)的二氯乙烷(DCE)(18mL)溶液中添加 纯净的TiCl₄(1.18mL，10.7mmol)。然后将混合物加热回流2h，然后在冰浴 中冷却。添加EtOH(50mL)，并将混合物搅拌3h。通过过滤收集所得沉 淀，用低温EtOH冲洗，并干燥，从而得到标题化合物(0.77g，57％)。MS (ESI/CI)：C₂₀H₁₆N₄O₄的质量计算值为376.1；m/z实测值为377.3[M+H]⁺。 ¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：12.85(s，1H)，9.00(d，J＝0.5Hz，1H)，8.31(s， 1H)，8.13(d，J＝8.8Hz，1H)，7.58-7.45(m，2H)，7.38-7.27(m，1H)，7.26-7.20 (m，2H)，7.18(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，6.98(s，1H)，4.39-4.13(m，2H)，1.42-1.21 (m，3H)。

步骤C：制备1-(4-氯-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯。将上 述1-(4-氧代-7-苯氧基-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(0.31g， 0.82mmol)和POCl₃(3.08mL，32.9mmol)的混合物加热回流3h。使混合物冷却 至室温，然后进行浓缩。以最小量的DCM吸收残余物，并通过FCC(0至 25％EtOAc/己烷)纯化，得到标题化合物(250mg，77％)。¹H NMR(600MHz， DMSO-d₆)：9.06(d，J＝0.7Hz，1H)，8.35(d，J＝9.2Hz，1H)，8.23(dd，J＝10.6， 6.6Hz，1H)，7.63-7.59(m，1H)，7.60-7.54(m，2H)，7.41-7.36(m，1H)，7.31-7.29 (m，2H)，7.18(d，J＝2.4Hz，1H)，4.30(q，J＝7.1Hz，2H)，1.35-1.24(t，J＝7.2Hz， 3H)。

步骤D：制备1-(4-(二甲基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸 乙酯。向上述1-(4-氯-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(70mg， 0.18mmol)和THF(1.4mL)的溶液中添加二甲胺的THF溶液(2M，0.44mL， 0.88mmol)。将混合物搅拌1h，然后浓缩。将残余物与乙醇一起磨碎，得到 标题化合物(45mg，63％)。MS(ESI/CI)：C₂₂H₂₁N₅O₃的质量计算值为403.1； m/z实测值为404.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：9.02(s，1H)， 8.31(d，J＝9.3Hz，1H)，8.12(s，1H)，7.53(dd，J＝11.1，4.8Hz，2H)，7.32(t，J＝ 7.4Hz，1H)，7.27-7.21(m，2H)，7.18(dd，J＝9.3，2.7Hz，1H)，6.96(d，J＝2.7Hz， 1H)，4.27(q，J＝7.1Hz，2H)，3.46(s，6H)，1.30(t，J＝7.1Hz，3H)。

步骤E：制备1-(4-(二甲基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧 酸。将1-(4-(二甲基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(35mg， 0.09mmol)、1M KOH水溶液(0.43mL，0.43mmol)和THF(1.3mL)的混合物加 热到40℃，持续48h，同时快速搅拌。然后浓缩混合物，在冰浴中冷却，添 加1M HCl水溶液，直至混合物呈弱酸性(pH值为大约5-6)。通过过滤收 集所得沉淀，用水冲洗，并干燥，从而得到标题化合物(22mg，68％)。MS (ESI)：C₂₀H₁₇N₅O₃的质量计算值为375.1；m/z实测值为376.3[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.73(s，1H)，8.98(d，J＝0.6Hz，1H)，8.31(d，J＝ 9.3Hz，1H)，8.07(s，1H)，7.52(ddd，J＝7.6，5.9，2.2Hz，2H)，7.36-7.28(m，1H)， 7.28-7.20(m，2H)，7.17(dd，J＝9.3，2.7Hz，1H)，6.97(d，J＝2.7Hz，1H)，3.46(s， 6H)。

实例78：1-(7-苯氧基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₃的质量计算值为 401.1；m/z实测值为402.3[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.72(s， 1H)，8.97(d，J＝0.6Hz，1H)，8.38(d，J＝9.3Hz，1H)，8.06(d，J＝0.6Hz，1H)， 7.56-7.46(m，2H)，7.35-7.27(m，1H)，7.26-7.19(m，2H)，7.16(dd，J＝9.3， 2.7Hz，1H)，6.97(d，J＝2.7Hz，1H)，3.97(s，4H)，2.01(s，4H)。

实例79：1-(7-苯氧基-4-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₁N₅O₃的质量计算值为 415.1；m/z实测值为416.3[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：12.74(s， 1H)，8.97(d，J＝0.7Hz，1H)，8.08(d，J＝0.7Hz，1H)，8.04(d，J＝9.2Hz，1H)， 7.56-7.49(m，2H)，7.32(t，J＝7.4Hz，1H)，7.25-7.21(m，3H)，6.99(d，J＝2.6Hz， 1H)，3.86(s，4H)，1.74(s，6H)。

实例80：1-(4-(二甲基氨基)-7-苯基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯基苯胺并且在步骤D中 使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₀H₁₇N₅O₂的质量计算值为 359.1；m/z实测值为360.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：9.13(d， J＝0.5Hz，1H)，8.40(d，J＝8.8Hz，1H)，8.24(s，1H)，8.15(d，J＝1.9Hz，1H)， 7.89-7.81(m，3H)，7.59-7.48(m，2H)，7.53-7.44(m，1H)，3.59(s，6H)。

实例81：1-(7-苯基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯基苯胺并且在步骤D中 使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₂的质量计算值为 385.1；m/z实测值为386.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：9.08(d， J＝0.5Hz，1H)，8.45(d，J＝8.9Hz，1H)，8.21(s，1H)，8.12(d，J＝1.8Hz，1H)， 7.90-7.78(m，3H)，7.62-7.53(m，2H)，7.53-7.45(m，1H)，4.07(s，4H)，2.05(s， 4H)。

实例82：1-(7-苯基-4-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯基苯胺并且在步骤D中 使用哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₁N₅O₂的质量计算值为 399.1；m/z实测值为400.3[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：12.80(s， 1H)，9.03(d，J＝0.5Hz，1H)，8.13(d，J＝0.5Hz，1H)，8.10(d，J＝8.7Hz，1H)， 8.06(d，J＝1.9Hz，1H)，7.89-7.80(m，3H)，7.60-7.52(m，2H)，7.51-7.45(m， 1H)，3.92(s，4H)，1.77(s，6H)。

实例83：1-(4-(二乙基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₃的质量计算值为 403.1；m/z实测值为404.3[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：8.91(d， J＝0.7Hz，1H)，8.09-8.07(m，2H)，7.56-7.48(m，2H)，7.35-7.28(m，1H)，7.25- 7.22(m，2H)，7.20(dd，J＝9.3，2.7Hz，1H)，6.99(d，J＝2.7Hz，1H)，3.82(q，J＝ 7.0Hz，4H)，1.38(t，J＝7.0Hz，6H)。

实例84：1-(4-((环己基甲基)氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用环己基甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₅N₅O₃的质量计算值 为443.2；m/z实测值为444.4[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：12.74 (s，1H)，8.96(s，1H)，8.75(s，1H)，8.38(d，J＝9.1Hz，1H)，8.09(s，1H)，7.56- 7.46(m，2H)，7.30(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，7.21(dd，J＝ 8.6，1.0Hz，2H)，6.98(d，J＝2.4Hz，1H)，3.51(t，J＝6.0Hz，2H)，1.80-1.62(m， 7H)，1.27-1.11(m，2H)，1.04(m，2H)。

实例85：1-(4-(4-异丙基哌啶-1-基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用4-异丙基哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₆H₂₇N₅O₃的质量计算 值为457.2；m/z实测值为458.4[M+H]⁺。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)： 12.75(s，1H)，8.97(d，J＝0.7Hz，1H)，8.08(d，J＝0.7Hz，1H)，8.06(d，J＝9.2Hz， 1H)，7.57-7.48(m，2H)，7.34-7.31(m，1H)，7.24-7.23(m，3H)，6.99(d，J＝ 2.6Hz，1H)，4.54(d，J＝13.0Hz，2H)，3.22(t，J＝12.0Hz，2H)，1.84(d，J＝9.8Hz， 2H)，1.56-1.33(m，4H)，0.91(d，J＝6.6Hz，6H)

实例86：1-(4-(环丙基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用环丙烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₇N₅O₃的质量计算值为 387.1；m/z实测值为388.3[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：12.74(s， 1H)，9.01(s，1H)，8.64(d，J＝3.9Hz，1H)，8.31(d，J＝9.1Hz，1H)，8.06(s，1H)， 7.55-7.45(m，2H)，7.31-7.29(m，1H)，7.24(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，7.22-7.19 (m，2H)，6.95(d，J＝2.5Hz，1H)，3.25-3.20(m，1H)，0.93-0.84(m，2H)，0.76- 0.69(m，2H)。

实例87：1-(4-(氮杂环庚烷-1-基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用高哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₃N₅O₃的质量计算值为 429.1；m/z实测值为430.3[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：12.72(s， 1H)，8.92(s，1H)，8.21(d，J＝9.3Hz，1H)，8.06(s，1H)，7.56-7.47(m，2H)，7.31 (t，J＝7.4Hz，1H)，7.23(dd，J＝8.5，0.9Hz，2H)，7.16(dd，J＝9.3，2.7Hz，1H)， 6.97(d，J＝2.7Hz，1H)，4.08-3.94(m，4H)，1.95(s，4H)，1.58(s，4H)。

实例88：1-(4-(二乙基氨基)-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用4-哌啶-1-基-苯胺并且在步 骤D中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₆N₆O₂的质量计算值 为394.2；m/z实测值为395.3[M+H]⁺。1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：8.89 (s，1H)，8.06(s，1H)，7.65(br s，2H)，7.18(s，1H)，3.78(q，J＝7.0Hz，4H)，3.28- 3.23(m，4H)，1.72-1.64(m，4H)，1.62-1.54(m，2H)，1.40(t，J＝7.0Hz，6H)。

实例89：1-(4-吗啉代-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₄的质量计算值为 417.1；m/z实测值为418.1[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：9.02(s， 1H)，8.13-8.12(m，1H)，8.11(s，1H)，7.59-7.45(m，2H)，7.33(t，J＝7.4Hz，1H)， 7.28-7.18(m，3H)，7.04(d，J＝2.5Hz，1H)，3.94-3.92(m，4H)，3.88-3.76(m， 4H)。

实例90：1-(7-苯氧基-4-硫代吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用硫代吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₃S的质量计算值 为433.1；m/z实测值为434.1[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：9.04- 8.97(m，1H)，8.10(s，1H)，8.05(d，J＝9.2Hz，1H)，7.58-7.48(m，2H)，7.36-7.29 (m，1H)，7.28-7.20(m，3H)，7.05(d，J＝2.5Hz，1H)，4.22-4.08(m，4H)，2.96- 2.86(m，4H)。

实例91：1-(4-(4-氟哌啶-1-基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用4-氟哌啶制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀FN₅O₃的质量计算值 为433.2；m/z实测值为434.1[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：9.02 (s，1H)，8.14-8.09(m，2H)，7.58-7.48(m，2H)，7.37-7.30(m，1H)，7.27-7.20(m， 3H)，7.06(d，J＝2.5Hz，1H)，5.14-4.92(m，1H)，4.06-3.65(m，4H)，2.23-2.03 (m，2H)，1.97-1.92(m，2H)。

实例92：1-(4-(二丁基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用二丁胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₆H₂₉N₅O₃的质量计算值为 459.2；m/z实测值为460.2[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：8.91(s， 1H)，8.10(s，1H)，8.04(d，J＝9.3Hz，1H)，7.57-7.48(m，2H)，7.37-7.28(m，1H)， 7.24-7.22(m，3H)，7.04(d，J＝2.3Hz，1H)，3.80-3.77(m，4H)，1.79(dt，J＝15.3， 7.7Hz，4H)，1.44-1.38(m，4H)，0.96(t，J＝7.4Hz，6H)。

实例93：1-(4-(二丙基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用二丙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₅N₅O₃的质量计算值为 431.2；m/z实测值为432.2[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：8.91(s， 1H)，8.10(s，1H)，8.03(d，J＝9.2Hz，1H)，7.56-7.47(m，2H)，7.32(t，J＝7.4Hz， 1H)，7.23(dd，J＝8.6，1.0Hz，3H)，7.04(s，1H)，3.77-3.74(m，4H)，1.93-1.70(m， 4H)，0.98-0.96(m，6H)。

实例94：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用N-甲基乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₉N₅O₃的质量计算 值为389.2；m/z实测值为390.1[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)： 8.97(s，1H)，8.26(d，J＝9.1Hz，1H)，8.11(s，1H)，7.59-7.43(m，2H)，7.37-7.29 (m，1H)，7.24-7.22(m，2H)，7.20-7.18(m，1H)，7.05(s，1H)，3.90-3.87(m，2H)， 3.47(s，3H)，1.35(t，J＝7.1Hz，3H)。

实例95：1-(4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用2-甲氧基-N-甲基乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₄的 质量计算值为419.2；m/z实测值为420.1[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz， DMSO-d₆)：8.98(s，1H)，8.36(d，J＝9.2Hz，1H)，8.10(s，1H)，7.57-7.47(m， 2H)，7.37-7.29(m，1H)，7.27-7.21(m，2H)，7.18(dd，J＝9.3，2.5Hz，1H)，7.04(s， 1H)，4.07(t，J＝5.5Hz，2H)，3.77-3.74(m，2H)，3.53(s，3H)，3.31(s，3H)。

实例96：1-(7-溴-4-(二乙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-溴苯胺并且在步骤D中使 用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₆H₁₆BrN₅O₂的质量计算值为 389.1；m/z实测值为390.0[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：12.75(s， 1H)，8.94(d，J＝0.7Hz，1H)，8.11(d，J＝0.7Hz，1H)，7.97(s，1H)，7.96(d，J＝ 2.0Hz，2H)，3.83(q，J＝7.0Hz，4H)，1.44-1.33(m，6H)。

实例97：1-(4-(环己基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用环己胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₃N₅O₃的质量计算值为 429.2；m/z实测值为430.1[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：8.97(s， 1H)，8.49-8.45(m，2H)，8.11(s，1H)，7.51(t，J＝7.9Hz，2H)，7.30(t，J＝7.4Hz， 1H)，7.26(d，J＝9.1Hz，1H)，7.20(d，J＝7.7Hz，2H)，7.01(s，1H)，4.30(s，1H)， 2.05-2.00(m，2H)，1.82-1.80(m，2H)，1.70-1.68(m，1H)，1.52-1.36(m，4H)， 1.29-1.13(m，1H)。

实例98：1-(4-((环丙基甲基)氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用环丙基甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₃的质量计算值 为401.2；m/z实测值为402.1[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)：8.99 (s，1H)，8.92(s，1H)，8.38(d，J＝8.5Hz，1H)，8.10(s，1H)，7.56-7.45(m，2H)， 7.33-7.29(m，1H)，7.27(d，J＝9.0Hz，1H)，7.21(dd，J＝8.5，1.0Hz，2H)，7.00(s， 1H)，3.72-3.28(m，2H)，1.33-1.14(m，1H)，0.58-0.46(m，2H)，0.43-0.32(m， 2H)。

实例99：1-(4-(叔丁基氨基)-7-苯氧基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例77的方式，在步骤A中使用3-苯氧基苯胺并且在步骤D 中使用2-甲基丙-2-胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₃的质量计算 值为403.2；m/z实测值为404.2[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆)： 8.87(d，J＝0.7Hz，1H)，8.51(d，J＝9.1Hz，1H)，8.11(d，J＝0.6Hz，1H)，7.83(s， 1H)，7.56-7.44(m，2H)，7.32-7.28(m，1H)，7.24(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，7.22- 7.18(m，2H)，6.97(d，J＝2.5Hz，1H)，1.61(s，9H)。

实例100：1-(7-氟-6-(环己氧基)-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氟-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₄FN₅O₄的质量计算值为441.5；m/z实测值为442.3[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.68(s，1H)，9.00(s，1H)，8.10(s，1H)，7.68(d，J＝12.0Hz，1H)， 7.49(d，J＝9.1Hz，1H)，4.58(s，1H)，3.87(s，4H)，3.82(s，4H)，1.97(s，2H)，1.74 (s，2H)，1.65-1.29(m，6H)。

实例101：1-(7-氟-6-(环己氧基)-4-(二甲基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氟-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₀H₂₂FN₅O₃的质量计算值为399.4；m/z实测值为400.1[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.97(s，1H)，8.08(s，1H)，7.74(d，J＝ 8.7Hz，1H)，7.59(d，J＝11.7Hz，1H)，4.56(s，1H)，3.43(s，6H)，1.98(s，2H)， 1.74(s，2H)，1.64-1.25(m，6H)。

实例102：1-(7-氟-6-(环己氧基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氟-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₂H₂₆FN₅O₃的质量计算值为427.5；m/z实测值为428.2[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.78(s，1H)，8.92(s，1H)，8.10(s，1H)，7.62(d，J＝ 12.1Hz，1H)，7.48(d，J＝8.8Hz，1H)，4.49(s，1H)，3.79(q，J＝6.4Hz，4H)，2.03 (s，2H)，1.76(s，2H)，1.64-1.26(m，12H)。

实例103：1-(7-氟-6-(环己氧基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氟-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₂H₂₄FN₅O₃的质量计算值为425.5；m/z实测值为426.1[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.73(s，1H)，8.96(s，1H)，8.07(s，1H)，7.84(d，J＝ 9.1Hz，1H)，7.56(d，J＝12.1Hz，1H)，4.53(s，1H)，3.98(s，4H)，2.01(s，6H)， 1.74(s，2H)，1.63-1.27(m，6H)。

实例104：1-(7-氟-6-(环己氧基)-4-(乙基(甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氟-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₁H₂₄FN₅O₃的质量计算值为413.5；m/z实测值为414.1[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.81(s，1H)，8.94(s，1H)，8.08(s，1H)，7.64-7.58(m， 2H)，4.53(s，1H)，3.80(q，J＝6.5Hz，2H)，3.39(s，3H)，2.00(s，2H)，1.74(s，2H)， 1.64-1.26(m，9H)。

实例105：1-(7-氟-6-(环己氧基)-4-(环丙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氟-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用环丙烷制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₁H₂₂FN₅O₃的质量计算值为411.4；m/z实测值为412.2[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：8.96(s，1H)，8.61(s，1H)，8.03(s，1H)，7.94(d，J＝ 8.9Hz，1H)，7.55(d，J＝12.1Hz，1H)，4.55(s，1H)，3.19-3.07(m，1H)，1.95(s， 2H)，1.74(s，2H)，1.64-1.26(m，6H)，0.97-0.85(m，2H)，0.77-0.67(m，2H)。

实例106-135为可以使用上面提供的一般方案合成的预示性实例。

实例106：1-(6-苄基-7-氟-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氟-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化合物。 MS(ESI)：C₂₃H₂₀FN₅O₃的预测质量计算值为433.2

实例107：1-(6-苄基-4-(二甲基氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氟-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₁H₁₈FN₅O₂的预测质量计算值为391.1

实例108：1-(6-苄基-4-(二乙基氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氟-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₃H₂₂FN₅O₂的预测质量计算值为419.2

实例109：1-(6-苄基-7-氟-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氟-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀FN₅O₂的预测质量计算值为417.2

实例110：1-(6-苄基-4-(乙基(甲基)氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氟-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲基乙胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₀FN₅O₂的预测质量计算值为405.2

实例111：1-(6-苄基-4-(环丙基氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氟-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₂H₁₈FN₅O₂的预测质量计算值为403.1

实例112：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉 制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₅FN₆O₃的预测质量计算值为476.2

实例113：1-(4-(二甲基氨基)-6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲 胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₃FN₆O₂的预测质量计算值为434.2

实例114：1-(4-(二乙基氨基)-6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙 胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₇FN₆O₂的预测质量计算值为462.2

实例115：11-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯 烷制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₅FN₆O₂的预测质量计算值为460.2

实例116：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-(乙基(甲基)氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲 基乙胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₅FN₆O₂的预测质量计算值为448.2

实例117：1-(4-(环丙基氨基)-6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氟- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙 胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₃FN₆O₂的预测质量计算值为446.2

实例118：1-(7-氟-4-吗啉代-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀FN₅O₃的预测质量计算值为433.2

实例119：1-(4-(二甲基氨基)-7-氟-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₈FN₅O₂的预测质量计算值为391.1

实例120：1-(4-(二乙基氨基)-7-氟-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₂FN₅O₂的预测质量计算值为419.2

实例121：1-(7-氟-4-(吡咯烷-1-基)-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀FN₅O₂的预测质量计算值为417.2

实例122：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-7-氟-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(邻甲苯基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲基乙胺制备 上述化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₀FN₅O₂的预测质量计算值为405.2

实例123：1-(4-(环丙基氨基)-7-氟-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₈FN₅O₂的预测质量计算值为403.1

实例124：1-(7-氟-6-异丙基-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-6-异丙基-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化合 物。MS(ESI)：C₁₉H₂₀FN₅O₃的预测质量计算值为385.2

实例125：1-(4-(二甲基氨基)-7-氟-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-6-异丙基-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₁₇H₁₈FN₅O₂的预测质量计算值为343.1

实例126：1-(4-(二乙基氨基)-7-氟-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-6-异丙基-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₁₉H₂₂FN₅O₂的预测质量计算值为371.2

实例127：1-(7-氟-6-异丙基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-6-异丙基-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述化合 物。MS(ESI)：C₁₉H₂₀FN₅O₂的预测质量计算值为369.2

实例128：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-7-氟-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-6-异丙基-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲基乙胺制备上述 化合物。MS(ESI)：C₁₈H₂₀FN₅O₂的预测质量计算值为357.2

实例129：1-(4-(环丙基氨基)-7-氟-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-6-异丙基-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₁₈H₁₈FN₅O₂的预测质量计算值为355.1

实例130：1-(7-氟-4-吗啉代-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₃FN₆O₃的预测质量计算值为426.2

实例131：1-(4-(二甲基氨基)-7-氟-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述 化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₁FN₆O₂的预测质量计算值为384.2

实例132：1-(4-(二乙基氨基)-7-氟-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述 化合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₅FN₆O₂的预测质量计算值为412.2

实例133：1-(7-氟-6-(哌啶-1-基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述 化合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₃FN₆O₂的预测质量计算值为410.2

实例134：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-7-氟-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲基乙胺制备 上述化合物。MS(ESI)：C₂₀H₂₃FN₆O₂的预测质量计算值为398.2

实例135：1-(4-(环丙基氨基)-7-氟-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氟-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙烷制备上述 化合物。MS(ESI)：C₂₀H₂₁FN₆O₂的预测质量计算值为396.2

实例136：1-(7-氯-6-(环己氧基)-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₄ClN₅O₄的质量计算值为457.9；m/z实测值为458.1[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：8.88(s，1H)，8.01(s，1H)，7.94(s，1H)，7.43(s，1H)，4.65(s，1H)， 3.87(s，4H)，3.83(s，4H)，1.94(s，2H)，1.75(s，2H)，1.70-1.33(m，6H)。

实例137：1-(7-氯-6-(环己氧基)-4-(二甲基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₀H₂₂ClN₅O₃的质量计算值为415.9；m/z实测值为416.1[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.98(s，1H)，8.08(s，1H)，7.88(s，1H)， 7.69(s，1H)，4.64(s，1H)，3.44(s，6H)，1.95(s，2H)，1.83-1.35(m，8H)。

实例138：1-(7-氯-6-(环己氧基)-4-(二乙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₂H₂₆ClN₅O₃的质量计算值为443.9；m/z实测值为444.2[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，8.91(s，1H)，8.09(s，1H)，7.89(s，1H)， 7.43(s，1H)，4.54(s，1H)，3.80(q，J＝6.6Hz，4H)，1.99(s，2H)，1.77(s，2H)， 1.68-1.50(m，3H)，1.48-1.33(m，9H)。

实例139：1-(7-氯-6-(环己氧基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₂H₂₄ClN₅O₃的质量计算值为441.9；m/z实测值为442.2[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：8.96(s，1H)，8.07(s，1H)，7.84(s，1H)，7.78(s，1H)，4.61 (s，1H)，3.99(s，4H)，2.10-1.88(m，6H)，1.83-1.32(m，8H)。

实例140：1-(7-氯-6-(环己氧基)-4-(乙基(甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₁H₂₄ClN₅O₃的质量计算值为429.9；m/z实测值为430.1[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：8.94(s，1H)，8.08(s，1H)，7.86(s，1H)，7.56(s，1H)， 4.65-4.54(m，1H)，3.81(q，J＝7.5Hz，2H)，3.40(s，3H)，1.96(s，2H)，1.75(s， 2H)，1.68-1.36(m，9H)。

实例141：1-(7-氯-6-(环己氧基)-4-(环丙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-环己氧基 苯胺并且在步骤E中使用环丙烷制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₁H₂₂ClN₅O₃的质量计算值为428.1；m/z实测值为442.2[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.75(s，1H)，9.01(s，1H)，8.68(s，1H)，8.09(s，1H)， 7.88(s，1H)，7.84(s，1H)，4.65(s，1H)，3.17(s，1H)，1.91(s，2H)，1.76(s，2H)， 1.69-1.37(m，6H)，0.95-0.89(m，2H)，0.73(s，2H)。

实例142-159为可以使用上面提供的一般方案合成的预示性实例。

实例142：1-(6-苄基-7-氯-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化合物。 MS(ESI)：C₂₃H₂₀ClN₅O₃的预测质量计算值为449.9

实例143：1-(6-苄基-4-(二甲基氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₁H₁₈ClN₅O₂的预测质量计算值为407.9

实例144：1-(6-苄基-4-(二乙基氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₃H₂₂ClN₅O₂的预测质量计算值为435.9

实例145：1-(6-苄基-7-氯-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀ClN₅O₂的预测质量计算值为433.9

实例146：1-(6-苄基-4-(乙基(甲基)氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲基乙胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₀ClN₅O₂的预测质量计算值为421.9

实例147：1-(6-苄基-4-(环丙基氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-苄基-7-氯-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙胺制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₂H₁₈ClN₅O₂的预测质量计算值为419.9

实例148：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉 制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₅ClN₆O₃的预测质量计算值为492.9

实例149：1-(4-(二甲基氨基)-6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲 胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₃ClN₆O₂的预测质量计算值为450.9

实例150：1-(4-(二乙基氨基)-6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙 胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₇ClN₆O₂的预测质量计算值为479.0

实例151：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯 烷制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₅H₂₅ClN₆O₂的预测质量计算值为479.0

实例152：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-(乙基(甲基)氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲 基乙胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₅ClN₆O₂的预测质量计算值为 464.9

实例153：1-(4-(环丙基氨基)-6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-7-氯- 4-氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙 胺制备上述化合物。MS(ESI)：C₂₄H₂₃ClN₆O₂的预测质量计算值为462.9

实例154：1-(7-氯-4-吗啉代-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化合 物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀ClN₅O₃的预测质量计算值为449.9

实例155：1-(4-(二甲基氨基)-7-氯-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₈ClN₅O₂的预测质量计算值为407.9

实例156：1-(4-(二乙基氨基)-7-氯-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₂ClN₅O₂的预测质量计算值为435.9

实例157：1-(7-氯-4-(吡咯烷-1-基)-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₀ClN₅O₂的预测质量计算值为433.9

实例158：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-7-氯-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(邻甲苯基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲基乙胺制备 上述化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₀ClN₅O₂的预测质量计算值为421.9

实例159：1-(4-(环丙基氨基)-7-氯-6-(o-甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(o-甲苯基)-3，4-二 氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙胺制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₈ClN₅O₂的预测质量计算值为419.9

实例160：1-(7-氯-6-异丙基-4_x吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-异丙基苯 胺并且在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₀ClN₅O₃的 质量计算值为401.9；m/z实测值为402.1[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.77(s，1H)，9.02(s，1H)，8.11(s，1H)，7.88(s，2H)，3.97(s，4H)， 3.81(s，4H)，3.33(s，1H)，1.31(d，J＝6.8Hz，6H)。

实例161：1-(7-氯-4-(二甲基氨基)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-异丙基苯 胺并且在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₇H₁₈ClN₅O₂的质量计算值为359.8；m/z实测值为360.0[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：9.01(s，1H)，8.12(s，1H)，8.11(s，1H)，7.82(s，1H)，3.49(s，6H)， 3.39(dt，J＝14.1，7.2Hz，1H)，1.32(d，J＝6.8Hz，6H)。

实例162：1-(7-氯-4-二乙基氨基-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-异丙基苯 胺并且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₂ClN₅O₂的质量计算值为387.9；m/z实测值为388.1[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：8.94(s，1H)，8.13(s，1H)，7.91(s，1H)，7.83(s，1H)，3.84(q，J＝ 6.7Hz，4H)，3.49-3.31(m，1H)，1.43(t，J＝6.7Hz，6H)，1.31(d，J＝6.7Hz，6H)。

实例163：1-(7-氯-4-(吡咯烷-1-基)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-异丙基苯 胺并且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₀ClN₅O₂的质量计算值为385.9；m/z实测值为386.1[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：8.98(s，1H)，8.19(s，1H)，8.08(s，1H)，7.78(s，1H)，4.01(s，4H)， 3.45-3.33(m，1H)，2.03(s，4H)，1.32(d，J＝6.8Hz，6H)。

实例164：1-(7-氯-4-(乙基(甲基)氨基)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-异丙基苯 胺并且在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₁₈H₂₀ClN₅O₂的质量计算值为373.9；m/z实测值为374.1[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：8.99(s，1H)，8.14(s，1H)，8.05(s，1H)，7.84(s，1H)，3.88 (q，J＝7.1Hz，2H)，3.48(s，3H)，3.40(dt，J＝13.3，6.8Hz，1H)，1.41(t，J＝6.9Hz， 3H)，1.32(d，J＝6.8Hz，6H)。

实例165：1-(7-氯-4-(环丙基氨基)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用3-氯-4-异丙基苯 胺并且在步骤E中使用环丙烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₈H₁₈ClN₅O₂的质量计算值为371.8；m/z实测值为372.1[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：12.75(s，1H)，9.04(s，1H)，8.87(s，1H)，8.27(s，1H)，8.11(s，1H)， 7.78(s，1H)，3.42-3.33(m，1H)，3.21(s，1H)，1.32(d，J＝6.6Hz，6H)，0.93-0.90 (m，2H)，0.76(br s，2H)。

实例166-171为可以使用上面提供的一般方案合成的预示性实例。

实例166：1-(7-氯-4-吗啉代-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化 合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₃ClN₆O₃的预测质量计算值为442.9

实例167：1-(4-(二甲基氨基)-7-氯-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述 化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₁ClN₆O₂的预测质量计算值为400.9

实例168：1-(4-(二乙基氨基)-7-氯-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述 化合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₅ClN₆O₂的预测质量计算值为428.9

实例169：1-(7-氯-6-(哌啶-1-基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述 化合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₃ClN₆O₂的预测质量计算值为410.2

实例170：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-7-氯-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-甲基乙胺制备 上述化合物。MS(ESI)：C₂₀H₂₃ClN₆O₂的预测质量计算值为414.9

实例171：1-(4-(环丙基氨基)-7-氯-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(7-氯-4-氧代-6-(哌啶-1-基)-3，4- 二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙烷制备上述 化合物。MS(ESI)：C₂₀H₂₁ClN₆O₂的预测质量计算值为412.9

实例172：1-(6-(环己氧基)-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己氧基苯胺 并且在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₅N₅O₄的质量 计算值为423.5；m/z实测值为424.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.75(s，1H)，9.01(s，1H)，8.10(s，1H)，7.81(d，J＝9.2Hz，1H)，7.56(dd，J ＝9.1，2.3Hz，1H)，7.30(s，1H)，4.52(s，1H)，3.84(s，8H)，1.97(s，2H)，1.75(s， 2H)，1.62-1.22(m，6H)。

实例173：1-(6-(环己氧基)-4-(二甲基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己氧基苯胺 并且在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₀H₂₃N₅O₃的质 量计算值为381.4；m/z实测值为382.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.80(s，1H)，8.93(s，1H)，8.04(s，1H)，7.72(d，J＝9.0Hz，1H)，7.58-7.45 (m，2H)，4.50(s，1H)，3.42(s，6H)，1.97(s，2H)，1.74(s，2H)，1.63-1.22(m， 6H)。

实例174：1-(6-(环己氧基)-4-(二乙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己氧基苯胺 并且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₇N₅O₃的质 量计算值为409.5；m/z实测值为410.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.69(s，1H)，8.89(s，1H)，8.07(s，1H)，7.72(d，J＝9.1Hz，1H)，7.48(d，J ＝9.1Hz，1H)，7.32(s，1H)，4.44(s，1H)，3.79(q，J＝6.6Hz，4H)，2.01(s，2H)， 1.76(s，2H)，1.64-1.22(m，12H)。

实例175：1-(6-(环己氧基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己氧基苯胺 并且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₅N₅O₃的质 量计算值为407.5；m/z实测值为408.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.71(s，1H)，8.96(s，1H)，8.07(s，1H)，7.71-7.66(m，2H)，7.50(dd，J＝9.1， 2.4Hz，1H)，4.57-4.41(m，1H)，3.98(s，4H)，2.01(s，6H)，1.74(s，2H)，1.62-1.21 (m，6H)。

实例176：1-(6-(环己氧基)-4-(环丙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己氧基苯胺 并且在步骤E中使用环丙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₂₃N₅O₃的质 量计算值为393.5；m/z实测值为394.2[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：9.07(s，1H)，8.85(s，1H)，8.17(s，1H)，7.86-7.70(m，2H)，7.51(d，J ＝9.2Hz，1H)，4.54(s，1H)，3.29(s，1H)，1.95(s，2H)，1.76(s，2H)，1.63-1.20(m， 6H)，0.95-0.89(m，2H)，0.78(s，2H)。

实例177：1-(6-(环己氧基)-4-(乙基(甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-环己氧基苯胺 并且在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₂₁H₂₅N₅O₃的质量计算值为395.5；m/z实测值为396.2[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：12.75(s，1H)，8.91(s，1H)，8.04(s，1H)，7.72(d，J＝ 9.1Hz，1H)，7.49(d，J＝9.3Hz，1H)，7.45(s，1H)，4.48(s，1H)，3.80(q，J＝7.3Hz， 2H)，3.38(s，3H)，1.99(s，2H)，1.75(s，2H)，1.62-1.25(m，9H)。

实例178：1-(6-苄基-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苄基苯胺并且 在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₁N₅O₃的质量计算 值为415.2；m/z实测值为416.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)： 12.75(s，1H)，9.00(s，1H)，8.09(s，1H)，7.80-7.68(m，3H)，7.36-7.17(m，5H)， 4.15(s，2H)，3.85-3.83(m，4H)，3.78-3.77(m，4H)。

实例179：1-(6-苄基-4-(二甲基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苄基苯胺并且 在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₁H₁₉N₅O₂的质量计 算值为373.4；m/z实测值为374.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.71(s，1H)，8.97(s，1H)，8.07(s，1H)，8.04(s，1H)，7.70-7.63(m，2H)， 7.31-7.28(m，4H)，7.24-7.18(m，1H)，4.13(s，2H)，3.41(s，6H)。

实例180：1-(6-苄基-4-(二乙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苄基苯胺并且 在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₃N₅O₂的质量计 算值为401.5；m/z实测值为402.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.76(s，1H)，8.89(s，1H)，8.07(s，1H)，7.70(s，2H)，7.62(s，1H)，7.36- 7.21(m，5H)，4.14(s，2H)，3.70(q，J＝6.8Hz，4H)，1.24(t，J＝6.9Hz，6H)。

实例181：1-(6-苄基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苄基苯胺并且 在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₃H₂₁N₅O₂的质量计 算值为399.5；m/z实测值为400.3[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：8.88(s，1H)，8.14(s，1H)，7.99(s，1H)，7.64(s，2H)，7.31-2.29(m，4H)， 7.23-7.16(m，1H)，4.12(s，2H)，3.93(s，4H)，2.00(s，4H)。

实例182：1-(6-苄基-4-(环丙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苄基苯胺并且 在步骤E中使用环丙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₁₉N₅O₂的质量计 算值为385.4；m/z实测值为386.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：8.96(s，1H)，8.76(d，J＝3.6Hz，1H)，8.31(s，1H)，8.01(s，1H)，7.66-7.60 (m，2H)，7.32-7.23(m，4H)，7.22-7.13(m，1H)，4.05(s，2H)，3.24-3.18(m，1H)， 0.92-0.82(m，2H)，0.81-0.71(m，2H)。

实例183：1-(6-苄基-4-(乙基(甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-苄基苯胺并且 在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₂₂H₂₁N₅O₂的质量计算值为387.4；m/z实测值为388.1[M+H]+。1H NMR(400MHz， DMSO-d₆)：8.94(s，1H)，8.07(s，1H)，7.88(s，1H)，7.68(s，2H)，7.34-7.28(m， 4H)，7.21(brs，1H)，4.13(s，2H)，3.75(q，J＝6.8Hz，2H)，3.36(s，3H)，1.26(t，J ＝6.9Hz，3H)。

实例184：1-(4-(吗啉代)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-异丙基苯胺并 且在步骤E中使用吗啉制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₁N₅O₃的质量计 算值为367.4；m/z实测值为368.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.77(s，1H)，9.03(s，1H)，8.11(s，1H)，7.80(s，3H)，3.92(s，4H)，3.82(s， 4H)，3.11(dt，J＝13.5，6.7Hz，1H)，1.29(d，J＝6.8Hz，6H)。

实例185：1-(4-(二甲基氨基)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-异丙基苯胺并 且在步骤E中使用二甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₇H₁₉N₅O₂的质量 计算值为325.4；m/z实测值为326.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.66(s，1H)，9.00(s，1H)，8.08(s，1H)，8.02(s，1H)，7.82-7.69(m，2H)， 3.45(s，6H)，3.10(dt，J＝13.6，6.6Hz，1H)，1.29(d，J＝6.8Hz，6H)。

实例186：1-(4-(二乙基氨基)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-异丙基苯胺并 且在步骤E中使用二乙胺制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₁₂₃N₅O₂的质 量计算值为353.4；m/z实测值为354.2[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：12.77(s，1H)，8.96(s，1H)，8.13(s，1H)，7.78(t，J＝13.6Hz，3H)，3.84(q，J ＝6.7Hz，4H)，3.09(dt，J＝14.0，7.0Hz，1H)，1.42(t，J＝6.9Hz，6H)，1.30(d，J＝ 6.9Hz，6H)。

实例187：1-(6-异丙基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-异丙基苯胺并 且在步骤E中使用吡咯烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₉H₂₁N₅O₂的质量 计算值为351.4；m/z实测值为352.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：8.96(s，1H)，8.08(d，J＝11.4Hz，2H)，7.78-7.63(m，2H)，3.98(s，4H)，3.13- 3.05(m，1H)，2.02(s，4H)，1.29(d，J＝6.3Hz，6H)。

实例188：1-(4-(环丙基氨基)-6-异丙基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-异丙基苯胺并 且在步骤E中使用环丙烷制备该标题化合物。MS(ESI)：C₁₈H₁₉N₅O₂的质量 计算值为337.4；m/z实测值为338.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO- d₆)：9.08(s，1H)，9.00(s，1H)，8.25(s，1H)，8.16(s，1H)，7.80-7.69(m，2H)，3.32 (s，1H)，3.04(dt，J＝13.4，6.7Hz，1H)，1.30(d，J＝6.9Hz，6H)，1.02-0.76(m， 4H)。

实例189：1-(6-异丙基-4-(乙基(甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

以类似于实例1步骤B至F的方式，在步骤B中使用4-异丙基苯胺并 且在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备该标题化合物。MS(ESI)： C₁₈H₂₁N₅O₂的质量计算值为339.4；m/z实测值为340.1[M+H]+。1H NMR (400MHz，DMSO-d₆)：9.10(s，1H)，8.26(s，1H)，8.02(s，1H)，7.93-7.83(m，2H)， 3.97(q，J＝6.9Hz，2H)，3.56(s，3H)，3.12(dt，J＝13.7，6.9Hz，1H)，1.40(t，J＝ 7.0Hz，3H)，1.29(d，J＝6.9Hz，6H)。

实例190-213为可以使用上面提供的一般方案合成的预示性实例。

实例190：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-氧 代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备 上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₅H₂₆N₆O₃的预测质量为458.2。

实例191：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-(二甲基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-氧 代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制 备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₃H₂₄N₆O₂的预测质量为416.20。

实例192：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-(二乙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-氧 代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制 备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₅H₂₈N₆O₂的预测质量为444.2。

实例193：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-氧 代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制 备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₅H₂₆N₆O₂的预测质量为442.2。

实例194：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-(环丙基氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-氧 代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙烷制 备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₄H₂₄N₆O₂的预测质量为428.2。

实例195：1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-(乙基(甲基)氨基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-((2，6-二甲基苄基)氨基)-4-氧 代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-乙基- N-甲胺制备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₄H₂₆N₆O₂的预测质量为430.2。

实例196：1-(4-吗啉代-6-(邻甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(邻甲苯基)-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化合物。 MS(ESI/CI)：C₂₃H₂₁N₅O₃的预测质量为415.2。

实例197：1-(4-(二甲基氨基)-6-(邻甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(邻甲苯基)-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₁H₁₉N₅O₂的预测质量为373.2。

实例198：1-(4-(二乙基氨基)-6-(邻甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(邻甲苯基)-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₃H₂₃N₅O₂的预测质量为401.2。

实例199：1-(4-(吡咯烷-1-基)-6-(邻甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(邻甲苯基)-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₃H₂₁N₅O₂的预测质量为399.2。

实例200：1-(4-(环丙基氨基)-6-(邻甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(邻甲苯基)-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙烷制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₂H₁₉N₅O₂的预测质量为385.2。

实例201：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-6-(邻甲苯基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(邻甲苯基)-4-氧代-3，4-二氢喹 唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备上 述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₂H₂₁N₅O₂的预测质量为387.2。

实例202：1-(4-吗啉代-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(哌啶-1-基)-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₁H₂₄N₆O₃的预测质量为408.2。

实例203：1-(4-(二甲基氨基)-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(哌啶-1-基)-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₁₉H₂₂N₆O₂的预测质量为366.2。

实例204：1-(4-(二乙基氨基)-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(哌啶-1-基)-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₁H₂₆N₆O₂的预测质量为394.2。

实例205：1-(6-(哌啶-1-基)-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(哌啶-1-基)-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₁H₂₄N₆O₂的预测质量为392.2。

实例206：1-(4-(环丙基氨基)-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(哌啶-1-基)-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙烷制备上述化合 物。MS(ESI/CI)：C₂₀H₂₂N₆O₂的预测质量为378.2。

实例207：1-(4-(乙基(甲基)氨基)-6-(哌啶-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(哌啶-1-基)-4-氧代-3，4-二氢 喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-乙基-N-甲胺制备 上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₀H₂₄N₆O₂的预测质量为380.2。

实例208：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4-吗啉代喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4- 氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吗啉制 备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₅H₂₅N₅O₄的预测质量为459.2。

实例209：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4-二甲基氨基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4- 氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二甲胺 制备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₃H₂₃N₅O₃的预测质量为417.2。

实例210：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4-二乙基氨基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4- 氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用二乙胺 制备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₅H₂₇N₅O₃的预测质量为445.2。

实例211：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4-(吡咯烷-1-基)喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4- 氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用吡咯烷 制备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₅H₂₅N₅O₃的预测质量为443.2。

实例212：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4-环丙基氨基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4- 氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用环丙烷 制备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₄H₂₃N₅O₃的预测质量为429.2。

实例213：1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-4-(乙基(甲基)氨基)-7-甲基喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸。

可以类似于实例1，在步骤D中使用1-(6-(2，6-二甲基苯氧基)-7-甲基-4- 氧代-3，4-二氢喹唑啉-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯并且在步骤E中使用N-乙 基-N-甲胺制备上述化合物。MS(ESI/CI)：C₂₅H₂₄N₅O₃的预测质量为431.2。

生物学方案：

PHD_2181-417的表达和纯化

将含有GenBank登录号NM_022051的氨基酸181-417的人PHD2表达 构建物克隆到pBAD载体(Invitrogen)中，该载体整合有N-末端组氨酸标签 和Smt3标签，这两个标签都被Ulp1切割。通过在生长于含100μg/ml氨苄 青霉素的Terrific肉汤中的BL21细胞中表达来实现蛋白质的产生。细胞培 养物在37℃下接种，并生长至OD₆₀₀0.8。将培养物用0.1％阿拉伯糖诱导并 在20℃下以225rpm连续振摇培养过夜。通过离心获取细胞并存储在-80℃ 下。将细胞颗粒悬浮于缓冲液A(50mM Tris-HCl pH7.2、100mM NaCl、 100mM L-精氨酸、1mM TCEP、0.05％(w/v)NP-40、50mM咪唑)中，然后 添加溶菌酶和核酸酶。将细胞进行超声裂解，并将裂解物通过离心 (15,000rpm，90分钟，4℃)进行澄清。用HisTrap Crude FF柱(通用电气 医疗公司(GE Healthcare))通过镍亲和层析纯化蛋白质。将样品在缓冲液A 中以50-200mM咪唑梯度进行洗脱。通过孵育过夜并对缓冲液A透析，实 现用Ulp1蛋白酶切割Smt标签。然后使PHD2_181-417样品通过第二HisTrap  Crude FF柱(通用电器医疗集团(GE Healthcare))，从而移除未剪切的蛋白 质。然后使流出液透析到50mM MES pH6.0、1mM TCEP、5mM NaCl中， 以在HiTrap SP阳离子交换柱(通用电气医疗公司(GE Healthcare))上进行 离子交换层析。以0-0.2M NaCl梯度洗脱PHD2_181-417蛋白质。将级分集中， 以在Superdex75尺寸排阻柱(通用电气医疗公司(GE Healthcare))上进一步 通过尺寸排阻层析进行纯化。将最终蛋白质浓缩至4mg/ml，并在10mM PIPES pH7.0、100mM NaCl、0.5mM TCEP中透析。蛋白质经凝胶电泳测出 纯度为＞95％。

酶活性测定

在0.5ml含有如下物质的反应混合物中进行PHD酶测定法10分钟：反 应缓冲液(40mM Tris-HCl，pH7.5，0.4mg/ml过氧化氢酶，0.5mM DTT， 1mM抗坏血酸盐)中的纯化的PHD2_181-417多肽(3μg)、包含残基 [KNPFSTGDTDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRSFDQLS]的合成HIF-1α肽 (10μM，加利福尼亚州纳帕加州多肽研究有限公司(California Peptide  Research Inc.，Napa，CA))和[5-¹⁴C]-2-氧代戊二酸(50mCi/mmol，加利福尼 亚州布瑞亚莫拉维克化学公司(Moravek Chemicals，Brea，CA))。在开始反应 前将化合物预孵育30分钟(所有测试化合物均以10mM溶解于100％ DMSO(w/v)中，并且以每1％DMSO(w/v)中100μM的最终化合物浓度进行 测试)。通过添加50μl的70mM H₃PO₄和50μl的500mM NaH₂PO₄(pH3.2) 终止反应。通过对反应混合物与100μl的0.16M DNP(在30％高氯酸中制 备)进行孵育，使[¹⁴C]-琥珀酸与[5-¹⁴C]-2-氧代戊二酸分离，来实现对[¹⁴C]- 琥珀酸的检测。接着，将50μl的未标记的20mM2-氧代戊二酸/20mM琥珀 酸(充当放射性的载体)添加至该混合物，让其在室温下进行30分钟。然 后将该反应物与50μl的1M2-氧代戊二酸在室温下再孵育30分钟，以沉淀 过量的DNP。然后在室温下将反应在2800×g下离心10分钟，以使上清液 中的[¹⁴C]-琥珀酸与沉淀的[¹⁴C]-二硝基苯腙分离。用β射线计数器(加里福 利亚州富勒顿贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter，Fullerton，CA))对上 清液的级分(400μl)进行计数。以[¹⁴C]-琥珀酸产生量的下降，测量PHD2_181-417活性的抑制情况。通过用GraphPad Prism版本4.02(加里福利亚州圣地 亚哥GraphPad软件公司(Graph Pad Software，San Diego，CA))将数据拟合三 参数logistic函数来估计IC₅₀值。

细胞测定

将Hep-3B细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯美国模式培养物集存库(ATCC， Manassas，VA))以20,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，每孔具有 100μl的DMEM，该DMEM中含有10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、 50IU/mL的青霉素和50μg/mL的链霉素(所有细胞培养试剂均获自加里福利 亚州卡尔斯班英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))。接种24小时后，加入 化合物，再孵育24小时。所有化合物均以100μM的最终化合物浓度进行测 试。然后将50微升的上清液转移至人低氧测定试剂盒(马里兰州盖瑟斯堡 MSD公司(Meso-Scale Discovery，Gaithersburg，MD))。如下根据厂商说明书 检测上清液中的促红细胞生成素(EPO)。将EPO检测板用3％BSA(于PBS 中)封闭过夜，并将50μl的上清液在轨道式振荡器中在室温下孵育2小 时。加入25微升的0.5μg/ml抗EPO检测抗体，在轨道式振荡器中在室温下 保持2小时。在PBS中洗涤3次后，加入150μl的1X读板缓冲液，然后在 MSD SECTOR仪器上进行读板。通过确定存在100μM化合物的情况下的 EPO分泌量相对于存在对照化合物7-[(4-氯-苯基)-(5-甲基-异唑-3-基氨基)- 甲基]-喹啉-8-醇的情况下的EPO分泌量的百分比，对数据进行分析。

HIF1-α的细胞测定

将海拉细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯美国模式培养物集存库(ATCC， Manassas，VA))以20,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，每孔具有 100μl的DMEM，其中含有10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、50IU/mL的 青霉素和50μg/mL的链霉素(所有细胞培养试剂均得自加利福尼亚州卡尔 斯班英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))。接种24小时后，将培养基更换 为不含10％胎牛血清的100ul DMEM，对每种化合物添加1.1μl储备溶液并 孵育6小时。所有化合物均以100μM的最终化合物浓度进行测试。移除上 清液，并在55μl含有蛋白酶抑制剂的MSD裂解缓冲液中裂解细胞。然后将 50μl细胞裂解液转移到分区的MSD人HIF-1α检测板(马里兰州盖瑟斯堡 MSD公司(Meso-Scale Discovery，Gaithersburg，MD)，根据制造商方案)，并 在轨道式振荡器上在室温下孵育2小时。在PBS中洗涤3次后，加入25μl 20nM抗-HIF1α检测抗体，在轨道式振荡器上在室温下孵育1小时。在PBS 中洗涤3次后，加入150μl的1X读板缓冲液，然后在MSD SECTOR仪器 上进行读板。通过确定存在100μM化合物的情况下的HIF分泌量相对于存 在对照化合物7-[(4-氯-苯基)-(5-甲基-异唑-3-基氨基)-甲基]-喹啉-8-醇的情 况下的分泌量的百分比，对数据进行分析。

这些测定法中所测试化合物的结果平均值列于表1中(NT＝未测试)。

表1.