九香虫总生物碱在制备具有抗菌、消炎、解热和免疫促进功能的药物或保健品中的应用

摘要

本发明公开了九香虫总生物碱在制备具有抗菌、消炎、解热和免疫促进功能的药物或保健品中的应用，九香虫总生物碱的生物活性检测结果显示，九香虫总生物碱对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌和变形杆菌都有不同程度的抑制作用，对肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用，对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的抗炎作用，对干酵母所致大鼠的发热反应有明显的解热作用，并能显著增强小鼠网状内皮系统的吞噬功能，具有免疫促进作用，且毒性低，使用安全。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及九香虫总生物碱在药物和保健品制备领域中的新用途。 

背景技术

抗生素的使用使人类许多严重的细菌感染性疾病得到有效控制，但抗生素的不合理使用也导致了耐药菌株的增加，降低了现有抗生素的抗菌效率。因此，减少耐药菌株的生成和研制新的抗菌药物成为21世纪医学界的重要课题。中药几千年来为中国人的健康作出了重大贡献，在现代预防和控制细菌性感染疾病方面也发挥了积极作用。由于中药的特殊性，细菌较少对中药产生耐药，因此，研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺的问题具有重要意义。 

中药九香虫为蝽科昆虫九香虫Aspongopus chinensis Dallas的干燥全体，始载于《本草纲目》，其味咸、性温，归肝、脾、肾经，具有理气止痛、温中助阳的功效，用于胃寒胀痛，肝胃气痛，肾虚阳痿，腰膝酸痛等疾病。现代医学研究表明，九香虫含有脂肪油、蛋白质、甲壳质、维生素、黄酮、蒽醌、生物碱等化学成分，具有抗菌、抗癌、止癌痛、促血管生成等药理作用。但有关九香虫总生物碱的生物活性尚未见报道。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供九香虫总生物碱的生物活性，以及其在药物和保健品制备领域中的新用途。 

为解决上述问题，本发明从抗菌、消炎、解热和免疫调节几个方面考察了九香虫总生物碱的生物活性，结果显示，九香虫总生物碱对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌和变形杆菌都有不同程度的抑制作用，对肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用，对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显的消炎作用，对干酵母所致大鼠的发热反应有明显的解热作用，并能显著增强小鼠网状内皮系统的吞噬功能，具有免疫促进作用，且毒性低，使用安全，因此，其可用于制备具有抗菌、消炎、解热和免疫促进功能的药物或保健品。 

进一步，所述九香虫总生物碱采用以下方法制得：将九香虫用水加热提取，提取液上弱极性大孔吸附树脂柱，先用无机碱溶液洗至流出液无色，再用水洗至流出液呈中性，再用体 积分数为30%～70%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得九香虫总生物碱。 

优选的，所述弱极性大孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101。 

优选的，提取液上弱极性大孔吸附树脂柱，先用质量分数为0.2%的氢氧化钠溶液洗至流出液无色，再用水洗至流出液呈中性，再用体积分数为50%的乙醇溶液洗脱。 

优选的，将九香虫加水煎煮2次，每次加入10倍重量的水煎煮1小时，合并煎煮液，离心，取上清液作为提取液。 

本发明的有益效果在于：本发明公开了九香虫总生物碱在制备具有抗菌、消炎、解热和免疫促进功能的药物或保健品中的应用，不仅拓宽了九香虫总生物碱的应用范围，提高了其市场价值，而且进一步明确了中药九香虫的药效物质基础，利于控制中药九香虫及其制剂的质量。 

具体的实施方式 

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对九香虫总生物碱的药理作用及其效果进行详细的阐述。 

一、九香虫总生物碱的制备 

称取九香虫药材2kg，加入10倍量水煎煮2次，每次煎煮1小时，煎煮液滤过，合并滤液，离心，取上清液上大孔吸附树脂D101柱（弱极性，天津市海光化工有限公司），先用质量分数为0.2%的氢氧化钠溶液洗至流出液无色，再用蒸馏水洗至流出液呈中性，再用体积分数为50%的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得九香虫总生物碱40g。 

含量测定方法：取九香虫总生物碱细粉约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加浓氨试液3ml、乙醚20ml，放置24小时，置水浴上加热回流提取4小时至生物碱提尽，将提取液移至分液漏斗中，容器用少量乙醚洗涤，洗液并入分液漏斗中，加盐酸滴定液（0.5mol/L）振摇提取5次（20、10、10、10、10ml），合并酸液，滤过，滤液加氢氧化钠试液使呈碱性，加氯化钠饱和，用乙醚振摇提取5次（20、10、10、10、10ml），合并乙醚液，用氯化钠饱和溶液洗涤3次，每次5ml，合并洗液，再用乙醚10ml振摇提取，合并乙醚液，精密加入硫酸滴定液（0.01mol/L）30ml，振摇提取，静置使分层，分取酸液，剩余乙醚液再用水提取3次，每次5ml，合并酸液与水液，置水浴上加热，除去微量乙醚，放冷，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）滴定，即得。每1ml的硫酸滴定液（0.01mol/L）相当于3.143mg的九香虫素（aspongopusin，C₁₀H₉NO₃）。 

含量测定结果显示，所得九香虫总生物碱以九香虫素计纯度为75.84%。 

二、九香虫总生物碱的药理作用 

1.体外抗菌作用 

以肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌、变形杆菌为试验菌种。取各试验菌种，分别接种于2mL牛肉膏汤液体培养基中，37℃培养16小时，所得菌悬液用无菌生理盐水稀释至浓度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7/mL，再取各稀释菌液0.1mL，加至牛肉膏汤固体培养基中，37℃培养18小时，以刚形成融合生长菌落者作为平皿法试验用菌液，最终确定金黄色葡萄球菌的平皿法试验用菌液采用10^-3/mL浓度，其余各菌采用10^-2/mL浓度。 

称取九香虫总生物碱，用生理盐水溶解并稀释制成浓度为10mg/mL的溶液；另取阳性对照盐酸环丙沙星标准品，用生理盐水溶解并稀释，分别制成浓度为10μg/mL和20μg/mL的溶液。取6个三角烧瓶，顺序编号，2～6号烧瓶中各加入无菌生理盐水40mL，先取九香虫总生物碱溶液80mL至1号烧瓶中，再从1号烧瓶中吸取溶液40mL至2号烧瓶中，混匀，再从2号烧瓶中吸取溶液40mL至3号烧瓶中，依次操作至6号烧瓶，则1～6号烧瓶中九香虫总生物碱的浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.63和0.32mg/mL。取9个无菌平皿，顺序编号，1～6号平皿中分别对应加入上述1～6号烧瓶中的溶液1mL，7～8号平皿中分别加入浓度为10μg/mL和20μg/mL的盐酸环丙沙星溶液，9号平皿中不加药液作为空白对照，然后在各平皿中加入已融化并冷却至40℃的牛肉膏汤琼脂培养基9mL，立即摇动充分混匀，则1～6号平皿中九香虫总生物碱的浓度依次为1、0.5、0.25、0.125、0.063和0.032mg/mL，7-8号平皿中盐酸环丙沙星的浓度依次为1和2μg/mL。在1～9号平皿上按前述平皿法试验用菌液浓度接种试验菌株，37℃培养18小时，记录各药物浓度平皿上的细菌生长情况，测定药物的最低抗菌浓度（MIC）。 

结果显示，九香虫总生物碱对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌、变形杆菌的MIC分别为0.25、0.5、0.5、1、1mg/mL，说明九香虫总生物碱对以上各菌均有不同程度的抗菌作用。 

2.体内抗菌作用 

以肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌为试验菌种。将浓度为6×10⁸/mL的肺炎双球菌菌液用无菌生理盐水稀释至浓度分别为6×10⁷、6×10⁶、6×10⁵、6×10⁴/mL。取小鼠20只，随机分为5组，每组4只，1～5组分别腹腔注射浓度为6×10⁸、6×10⁷、6×10⁶、6×10⁵、6×10⁴/mL的肺炎双球菌菌液，0.5mL/只，观察4天内各组动物死亡情况，最终确定引起小鼠90%致死率的肺炎双球菌菌液浓度为3.16×10⁸/mL。将浓度为1.2×10⁹/mL的金黄色葡萄球菌菌液用无菌生理盐水稀释至浓度分别为1.2×10⁸、1.2×10⁷、1.2×10⁶、1.2×10⁵/mL。取小鼠20只，随机分为5 组，每组4只，1～5组分别腹腔注射浓度为1.2×10⁹、1.2×10⁸、1.2×10⁷、1.2×10⁶、1.2×10⁵/mL的金黄色葡萄球菌菌液，0.5mL/只，观察4天内各组动物死亡情况，最终确定引起小鼠90%致死率的金黄色葡萄球菌菌液浓度为6.4×10⁸/mL。 

取体重20±2g的雄性昆明小鼠60只，随机分为4组：空白对照组，九香虫总生物碱低、高剂量组和盐酸环丙沙星片组，每组15只。各组小鼠每天经口灌胃1次，空白对照组按照0.01mL/g(体重)的剂量给予小鼠生理盐水，九香虫总生物碱低、高剂量组分别按照10mg/kg、20mg/kg(体重)的剂量给予小鼠九香虫总生物碱，盐酸环丙沙星片组按照24mg(主药)/kg(体重)的剂量给予盐酸环丙沙星片。连续给药4天后，各组小鼠腹腔注射浓度为3.16×10⁸/mL的肺炎双球菌菌液或浓度为6.4×10⁸/mL的金黄色葡萄球菌菌液，0.5mL/只，之后按前述方法继续给药一周，记录一周内各组小鼠死亡数。 

结果显示，空白对照组、九香虫总生物碱高剂量组（20mg/kg）、九香虫总生物碱低剂量组（10mg/kg）、盐酸环丙沙星片组（24mg/kg）小鼠在腹腔感染肺炎双球菌后，一周内死亡数分别为14、6、8、4只，九香虫总生物碱高剂量组与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05）；同样，空白对照组、九香虫总生物碱高剂量组（20mg/kg）、九香虫总生物碱低剂量组（10mg/kg）、盐酸环丙沙星片组（24mg/kg）小鼠在腹腔感染金黄色葡萄球菌后，一周内死亡数分别为13、4、7、1只，九香虫总生物碱高剂量组与空白对照组比较有极显著差异（P<0.01），说明九香虫总生物碱对肺炎双球菌和金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用。 

3.体内抗炎作用 

取体重20±2g的雄性昆明小鼠40只，随机分为4组：空白对照组，九香虫总生物碱低、高剂量组和强力银翘片组，每组10只。各组小鼠每天经口灌胃1次，空白对照组按照0.01ml/g(体重)的剂量给予小鼠生理盐水，九香虫总生物碱低、高剂量组分别按照10mg/kg、20mg/kg(体重)的剂量给予小鼠九香虫总生物碱，强力银翘片组按照900mg(主药)/kg(体重)的剂量给予强力银翘片，连续给药4天。末次给药后1小时，在乙醚麻醉下，将二甲苯0.02mL涂在小鼠左耳前后两面致炎，致炎后30分钟处死小鼠，用7mm直径打孔器在小鼠左右耳相同部位打下耳片，称重并记录左右耳片重量，计算肿胀率，按t检验法进行统计学处理。 

结果见表1，二甲苯所致小鼠耳肿胀是经典的急性炎症模型，九香虫总生物碱可以降低二甲苯所致小鼠耳肿胀的肿胀率，其中九香虫总生物碱高剂量组（20mg/kg）与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05），说明九香虫总生物碱具有抗炎作用。 

表1 九香虫总生物碱对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响 

与空白对照组比较：^ap<0.05,^bp<0.01. 

4.体内解热作用 

称取干酵母10g，于研钵中逐渐加水研磨成均匀的悬浆，再加水定容至50mL，制成20%干酵母悬液，备用。取体重200±20g的雄性SD大鼠60只，随机分为4组：空白对照组，九香虫总生物碱低、高剂量组和强力银翘片组，每组15只。各组大鼠每天经口灌胃1次，空白对照组按照1mL/100g(体重)的剂量给予大鼠生理盐水，九香虫总生物碱低、高剂量组分别按照5mg/kg、10mg/kg(体重)的剂量给予大鼠九香虫总生物碱，强力银翘片组按照450mg(主药)/kg(体重)的剂量给予强力银翘片，连续给药4天，给药期间，每天将体温计插入大鼠肛门1次，使动物适应。末次给药前，各组大鼠禁食不禁水8小时，并于给药前测量肛温2次（间隔1小时），取平均值作为正常体温，选取2次温差不超过0.3℃的大鼠进行末次给药，之后按照10mL/kg(体重)的剂量立即于大鼠背部皮下注射20%干酵母悬液致热，分别于致热后0.5、1、2、4、6、8、10、12小时测肛温1次，以正常体温为基数，计算各时间点体温变化值，按t检验法进行统计学处理。 

结果见表2，干酵母致大鼠发热模型是一种常用的研究解热药物的药理实验模型，致热后4、6、8、10小时，九香虫总生物碱高剂量组（10mg/kg）的大鼠体温升高值与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05），而致热后4、6小时，九香虫总生物碱低剂量组（5mg/kg）的大鼠体温升高值与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05），说明九香虫总生物碱能够明显抑制干酵母所致的大鼠发热反应，具有较强的解热作用。 

表2 九香虫总生物碱对干酵母所致大鼠发热的影响 

与空白对照组比较：^ap<0.05,^bp<0.01. 

5.体内免疫促进作用 

取体重20±2g的雄性昆明小鼠40只，随机分为4组：空白对照组，九香虫总生物碱低、高剂量组和强力银翘片组，每组10只。各组小鼠每天经口灌胃1次，空白对照组按照0.01ml/g(体重)的剂量给予小鼠生理盐水，九香虫总生物碱低、高剂量组分别按照10mg/kg、20mg/kg(体重)的剂量给予小鼠九香虫总生物碱，强力银翘片组按照900mg(主药)/kg(体重)的剂量给予强力银翘片，连续给药4天。末次给药后30分钟，按照0.1mL/10g(体重)的剂量于小鼠尾静脉注射用1%(w/w)明胶溶液稀释4倍的印度墨汁，分别于注射后1、5分钟小鼠眼眶取血20μL，立即吹入0.1%(w/w)Na₂CO₃溶液2mL中，充分洗出采血管壁血液，摇匀，用分光光度计在波长675nm处测定吸光度（OD）值，并于第二次采血后，用脱颈椎方法处死小鼠，称量体重，解剖取肝、脾称重，计算单位时间内炭粒廓清率即吞噬指数K及校正吞噬指数A，按t检验法进行统计学处理。 

结果见表3，九香虫总生物碱高、低两个剂量组的吞噬指数和校正吞噬指数与空白对照组比较均有显著性差异（P<0.05），说明九香虫总生物碱能够促进小鼠网状内皮系统中单核巨噬细胞的吞噬功能，具有免疫促进作用。 

表3 九香虫总生物碱对小鼠碳粒廓清功能的影响（n=10） 

与空白对照组比较：^ap<0.05,^bp<0.01. 

三、九香虫总生物碱的急性毒性 

取体重20±2g的小鼠40只，雌雄各半，每只小鼠按照1.2g/kg(体重)的剂量给予九香虫总生物碱（相当于生药60g/kg），每天经口灌胃给药3次，连续给药7天，观察小鼠有无急性毒性反应。 

结果显示，在口服给予小鼠相当于人体用药剂量（九香虫生药日用量3g）130倍的九香虫总生物碱时，未见小鼠死亡，未测得LD₅₀。 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照上述实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。