一种分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法

摘要

一种分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，属于医药、食品和化工领域。本发明利用甘草中三萜类、黄酮类和多糖类成分化学结构特点以及在不同溶剂中、不同pH下的溶解特性，使甘草提取物中主要活性成分即黄酮类、三萜类和多糖类成分同步分离。当甘草提取物的水液加有机溶剂分层后，调节体系pH4.3，三萜类和黄酮类成分在有机层，糖类成分在水层，分出其中的有机层，加水后，调节体系pH6.5，黄酮类成分在有机层，三萜类成分在水层。本方法不仅工艺简单、步骤少，溶剂可重复使用，成本大大降低，而且分离效果好，得率和纯度都很高，并且三大类成分在同一生产线上分离出来，避免了单一成分提取分离造成其它有效成分损失。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从甘草提取物中分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多 糖的方法，属于医药、食品和化工领域。

背景技术

甘草是豆科甘草属多年生草本植物，又名甜草根、红甘草、粉甘草、粉草。 药用根，其性甘、平。甘草为常用大宗药材，药食兼用品种，年需要量约6万 吨左右，位列诸药前列，被医药界誉为“国老、药王、软黄金”，有“十方九 草”之美誉，被大量用于临床药物配方，甘草提取物还被应用于日用化工领域， 并有大量的出口。传统中医药理论认为，甘草具有补脾益气，清热解毒，润肺 止咳等功效，并具有调和诸药的作用。用于脾胃虚寒，倦怠乏力，心悸气短， 咳嗽痰多，四肢痉挛疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性等。现代药理研究表明， 甘草所含的三萜类、黄酮类和多糖类为甘草中的主要活性成分，这三类成分具 有多种药用价值，其中三萜类成分具有解毒、止咳平喘、抗炎及抗过敏、抗多 种病毒（包括艾滋病毒）、抗心律失常、抗肿瘤、抗肝损伤及降低胆固醇等作用， 其中的甘草酸在甘草中含量最高，应用最广，主要用于制药、化工和功能性甜 味剂等；甘草黄酮具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化、抗心律失常等作用，主要用于 制药，化妆品等；甘草多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用，主要用于 制药和食品如糖果等。

目前，关于单一提取甘草中的甘草酸或甘草黄酮、甘草多糖成分的方法专 利较多，如专利CN1450081A、1210865A、1070197A、1524870A、85104970A、 101759757A、等用于制备甘草酸或其盐的方法；专利CN102050851A、 101518542A、101289480A、102010313A、1827613A、等用于制备黄酮类成分的 一种或总黄酮的方法；专利CN1343729A、101492510A、101525391A等用于制 备甘草多糖的方法。

上述方法均是用于分离制备甘草中的一种或一类成分，不可避免会造成其 它类成分的流失，损失大、污染大，成本高。目前对于将甘草中的三大类成分 在一条生产线上分离也有报道，如专利“一种提取分离甘草酸、甘草黄酮和甘 草多糖的方法”（CN1803789A），“从甘草中系统分离、提取甘草黄酮、甘草酸、 甘草多糖生产方法”（CN1359905A），“甘草综合提取方法”（CN101766680A）。 这些方法提取分离的三萜类成分仅含甘草酸一种成分，其中专利CN1359905A 和CN101766680A是用三种不同的溶剂分别从药渣中提取三类成分，操作略显 麻烦，而且由于成分间助溶作用，分离效果不会太理想，先被提取的成分，提 取的量多，杂质也多，反之亦然；专利CN1803789A是用溶剂将甘草中的总成 分提取出来，然后用萃取方法分离这三类成分，操作虽然简单，但如果不调解 pH，单纯用有机溶剂很难将甘草酸和黄酮类成分分离，需要萃取多次才能分开。

发明人惊奇地发现，pH对于分离甘草三萜类、黄酮类和多糖类成分的得率 和纯度有很大的影响，调节pH仅萃取一次的分离效果相当于不调节pH萃取5 次的分离效果。基于该发现，本发明公开一种从甘草中分离甘草总三萜、甘草 总黄酮和甘草总多糖的新方法。该方法不仅简便易行，分离效果好，而且避免 了单一或间歇性提取分离造成另一些有效成分流失，能耗低，成本低，适于工 业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题包含但不限于以下一种或几种：A、提供一种从 甘草中分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的新方法；B、使甘草中的三 萜类、黄酮类和多糖类成分在同一生产线上分离开来，避免了单一或间歇性提 取分离会造成其它有效成分流失，C、不仅方法简便，而且分离效果好，萃取一 次相当于不调节pH萃取5次的分离效果，得率和纯度都很高；D、溶剂可重复 使用，成本低，能耗低，适于工业化生产。

本发明提供一种分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，包括 以下步骤：

步骤1、向含有甘草提取物的提取液中加入有机试剂，再加pH调节试剂使 体系pH小于5，优选范围pH2.5～4.7，更优选pH4.1～4.5，最优选pH4.3， 体系分层为有机层和水层，其中含有甘草提取物的提取液指的是同时含有甘草 黄酮、甘草三萜和甘草多糖的水溶液；有机试剂指的是易溶解三萜和黄酮而不 易溶解多糖，优选正丁醇和/或乙酸乙酯；pH调节试剂为能够影响pH的物质， 优选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸。

步骤2、分离步骤1中的有机层和水层，水层为甘草总多糖类成分。

步骤3、将步骤2中的有机层加入水，再加pH调节试剂使体系pH大于5且 小于8，优选范围pH6～7，更优选pH6.5，体系分层为有机层和水层，其中 pH调节试剂为能够影响体系pH的物质，优选氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氨 水。

步骤4、分离步骤3中的有机层和水层，有机层为甘草总黄酮类成分，水层 为甘草总三萜类成分。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤1中调节体系pH大于1小于4.7，优选范围pH2.5～4.7，更优选范围pH4.1～ 4.5，最优选pH4.3，其中以正丁醇为有机溶剂通过调节pH进行萃取的示例显 示在了图1中，尽管以往也有关于pH能够影响三萜类物质在有机溶剂和水中分 配系数的报道，但基本上认为不同pH对三萜类成分的影响不大，至少相邻pH 值之间不会发生太大的变化，但经过深入研究，发明人意外地发现pH对于甘草 三萜类物质在水层中的分配系数的影响之大，超出了传统的预期，在pH为4.0 时，水相中几乎不含有甘草三萜类物质，但在pH5.0时，却发生了极大的变化， 大量的甘草三萜类物质溶于水相中，与此同时，正丁醇相中的甘草三萜类物质 也明显减少。这一现象对于甘草三萜类物质的提取具有积极的影响，根据图1 可以看出，尽管低pH有利于甘草三萜进入正丁醇相，但一般pH越低，对于甘 草三萜的水解越强烈，使得甘草中的原皂苷变成次级皂苷，成分发生了变化， 也会导致pH调节试剂用量的增大，浪费了资源，也不利于环保，还会对容器造 成腐蚀，而且pH越低，糖类成分进入有机层的量也越大，使得分离的三萜类成 分的纯度降低，影响分离效果，而过大的pH又会造成甘草三萜得率的下降，基 于上述因素的考虑，发明人所发现的pH微小变化就会对甘草三萜成分的分配系 数产生很大影响的现象，使得如何平衡甘草三萜得率、甘草三萜纯度以及pH试 剂用量的问题变得简单，能够在保证甘草三萜纯度的同时，使得甘草三萜的得 率提高，还可以降低生产成本。

为了更加细致地展示体系pH对于甘草三萜在水相分配系数的影响，发明人 对pH进行了细化，具体见图2，可以看出，即使pH从4.5变化到4.7，甘草三 萜在水相中的含量也发生了较大的变化，因此，如何更加细化调节pH，对于分 离甘草三萜得率、甘草三萜纯度以及pH调节试剂用量，降低成本，减少环境污 染等问题具有很重要的指导意义。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤3中有机层加入水，再加调节试剂使体系pH大于5且小于8，优选范围pH6～ 7，更优选pH6.5，其中以正丁醇为有机溶剂通过调节pH进行萃取的示例显示 在了图3中，可以看出随着pH的增加，甘草黄酮类物质在正丁醇相和水相之间 的变化也很明显，这与已有文献报道的“相邻或相近pH对于甘草黄酮类物质在 有机相中分配系数影响不明显”有所差异。

在pH6.0时，水层没有黄酮类成分，但在有机层含有少量的三萜，相应的 随着pH变小，甘草三萜类成分在正丁醇相中溶解度变大，并且pH越低，溶解 量越大，这将影响正丁醇相中甘草黄酮的纯度，也会导致甘草三萜得率的降低， 而在pH7.0时，水相中出现了少许的甘草黄酮，pH8.0时开始变得明显，而 pH9.0时极其明显，在pH6.5时，水相中几乎没有黄酮类物质，有机相中没有 三萜，因此，优选pH6.5。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤1中含有甘草提取物的提取液的制备方法为：将含有甘草三萜、甘草黄酮和 甘草多糖的甘草属植物，包括根、根茎、茎、花和/或果实，采用温浸、渗漉、 煎煮、回流、连续回流、超声、微波或超临界流体提取法中的一种或几种提取； 优选料液比w/v（g/ml）为1:5～1:10；优选提取次数1～3次；优选提取时间 每次0.5～1.5小时；优选多次提取时将提取液合并。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤1提取甘草提取物时所用溶剂为以下溶剂中的任一种：A.水；B.甲醇与水的 混合物，优选混合物中甲醇含量10～70wt%；C.乙醇与水的混合物，优选混合物 中乙醇含量10～60wt%；D.丙酮与水的混合物，优选的混合物中丙酮含量10～ 50wt%；E.氨与水的混合物，优选混合物中氨含量0.1～2wt%；F.乙醇与氨 水的混合物，优选其中乙醇含量10～60wt%，其余为氨水含量，氨水中氨的含 量0.1～2wt%。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤1中甘草提取液优选浓缩液，更优选的浓缩液为不残留有机试剂，浓缩方法 包括但不限于以下方法中的一种或几种方法联合使用，A.常压加热浓缩，B.减 压加热浓缩，C.冷冻干燥浓缩，D.喷雾加热干燥浓缩，优选减压加热浓缩；优 选浓缩液比重1.05～1.20（20℃）；

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：提 取甘草总提取物的步骤不是必须的，如果是购买的商品甘草提取物，如甘草膏， 此步骤可省略。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤1中的有机试剂指的是能与水分层的试剂，优选易溶解三萜和黄酮而不易溶 解多糖的有机试剂，更优选正丁醇、正戊醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙醚。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤1中的pH调节试剂为任何能够影响pH的物质，优选有机酸、无机酸，更优 选硫酸、盐酸、醋酸、柠檬酸。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤2中分离出的水层含有的成分较杂，分离其中的多糖类成分，首先将水层所 含蛋白质除掉，优选的方法是，先用sevag法除蛋白质等杂质；再用有机试剂 沉淀得甘草多糖，沉淀试剂包括能够沉淀多糖的各种试剂，优选乙醇，更优选 的通过加95%乙醇或无水乙醇至乙醇浓度达到60～80%；有机试剂沉淀多糖后优 选静置沉淀，优选的静置时间为10～24小时；优选的静置时温度为4～20℃。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：沉 淀的多糖需要分离，分离方式为自然过滤、真空抽滤、超滤、离心或连续流离 心分离中的任何一种或几种但不限于以上方法，优选离心、连续流离心或真空 抽滤。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：步 骤3中的调节试剂为能够影响pH的物质，优选碱性物质，更优选氢氧化钠、氢 氧化钾、碳酸钠、氨水。

所述分离甘草总三萜、甘草总黄酮和甘草总多糖的方法，其特征在于：将 步骤5中分离出的水层和有机层分别进行干燥或不进行干燥，优选干燥；干燥 方法为自然干燥、减压干燥、冷冻干燥或喷雾干燥等方法中的任何一种或多种 方法联合，但不限于以上方法。

本发明充分利用甘草中黄酮类、三萜类和多糖类成分的化学结构特点以及 在不同pH下、不同溶剂中的溶解特性，使甘草提取物中的主要活性成分即黄酮 类、三萜类和/或多糖类成分同步分离，在最适pH下，甘草总三萜、甘草总黄 酮和甘草总多糖的收率和纯度都很高，而且甘草中三大类活性成分在一条生产 线上被分离开来，即便含量很少的成分也不会损失，避免了单一成分提取分离 造成其它有效成分损失，大大提高甘草的综合利用度，与其他制备方法相比较， 本方法工艺简单、步骤少，分离效果好，收率高，纯度高，而且溶剂可重复使 用，成本大大降低。

附图说明

图1甘草总提物的pH调节正丁醇萃取过程薄层色谱图

0：含甘草酸的混合对照；1：pH2.5；2：pH3.0；3：pH4.0；4：pH5.0；5： 初始pH5.31；6：pH6.0；7：pH7.0；8：pH8.0；9：pH9.0；左边为正丁醇相， 右边为水相。其中正丁醇相和水相中每个样品的上样量均相同。

图2甘草总提物的pH微调节正丁醇萃取过程薄层色谱图

0：含甘草酸的混合对照；1pH3.7；2pH3.9；3pH4.1；4pH4.3；5pH4.5； 6pH4.7；7pH5.0；8pH5.3；9pH5.6；左边为正丁醇相，右边为水相，其中 正丁醇相和水相中每个样品的上样量均相同。

图3含有甘草三萜类和黄酮类成分的pH调节正丁醇萃取过程薄层色谱图

0：含甘草酸的混合对照；1：pH3.2；2：pH4.0；3：pH5.0；4：pH6.0；5： pH6.5；6pH7.0；7：pH8.0；8：pH9.0；左边为正丁醇相，右边为水相，其中 正丁醇相和水相中每个样品的上样量均相同。

上述TLC色谱图，薄层板：GF254，展开剂条件：氯仿-甲醇-甲酸（6:1:1）， 显色剂：10%硫酸，硫酸显色后在365nm下照相。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

取100g甘草粉，加20wt%乙醇按料液比1:10、1:8和1:8超声提取3次， 每次1小时，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩液比重1.15（20℃），按 1:1比例加入水饱和的正丁醇，加盐酸调节体系pH4.13，摇匀萃取1次，黄酮 类和三萜类成分在正丁醇层，糖类成分在水层，分出水层，减压和真空干燥,得 甘草糖类粗品10.66g，含糖量85.76%。将全部糖类粗品用水溶解后，按水溶液 与sevag试剂（加氯仿:正丁醇=4:1）体积分数5:1加入sevag试剂，萃取3次 后，水层加95%乙醇至乙醇浓度80%，室温（20℃）下静置24小时，真空抽滤， 滤渣真空干燥（温度60℃），得甘草多糖粗品5.96克，占糖类粗品含量65.29%； 正丁醇层按1:1比例加入去离子水，加氨水调节体系pH6.5，摇匀萃取1次， 黄酮类成分在正丁醇层，三萜类成分在水层，分出正丁醇层，减压回收溶剂， 甘草黄酮粗品采用真空干燥（60℃），得甘草黄酮粗品2.86克，黄酮含量68.93%， 甘草苷含量32.37%；水层减压浓缩，冷冻干燥，得甘草三萜粗品8.45克，三萜 含量76.26%，甘草酸含量21.05%。

实施例2：

取25g甘草膏(含水6.9%)，加去离子水500mL，超声溶解(不溶物2.7%)， 将溶解液置于分液漏斗中，加500mL水饱和的正丁醇溶液，加盐酸调节体系 pH2.5，摇匀萃取1次，黄酮类和三萜类成分在正丁醇层，糖类成分在水层，分 出水层，冷冻干燥，得糖类粗品13.90克，其中糖的含量84.10%，将全部糖类 粗品用水溶解后，按水液与sevag试剂（加氯仿:正丁醇=4:1）5:1加入sevag 试剂，离心，去沉淀（主要为蛋白质），上清液加入95%乙醇至乙醇浓度达到80%， 室温下静置24小时，真空抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤，真空干燥（温度60℃）， 得甘草多糖7.31克，约占糖类粗品的52.52%；分出正丁醇层，按1:1比例加入 去离子水，加氨水调节体系pH6.5，摇匀萃取1次，黄酮类成分在正丁醇层，三 萜类成分在水层，分出正丁醇层和水层，正丁醇层减压回收溶剂，浓缩液用少 量溶剂溶出，室温下挥去有机溶剂后，加水冷冻干燥，得甘草黄酮粗品2.10克， 其中黄酮类成分含量67.89%，甘草苷含量31.90%；水层减压浓缩，冷冻干燥， 得甘草三萜粗品6.65克，其中三萜类成分含量73.38%，甘草酸含量19.70%。

实施例3：

取100g甘草粉碎，加30wt%丙酮索氏提取，提取液减压浓缩，浓缩液比 重1.20（20℃），按1:1比例加入乙醚，加盐酸调节体系pH4.7，摇匀萃取1次， 黄酮类和三萜类成分在乙醚层，糖类成分在水层，分出水层，减压和冷冻干燥， 得甘草糖类粗品6.75克，其中含糖量75.48%。将全部糖类粗品用水溶解后，按 水液与sevag试剂（加氯仿:正丁醇=4:1）5:1加入sevag试剂，离心，去沉淀 （主要为蛋白质），上清液加入95%乙醇至乙醇浓度达到80%，室温下静置24小 时，真空抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤，真空干燥（温度60℃），得甘草多糖粗品 3.23克，约占糖类粗品的53.38%。乙醚层按1:1比例加入去离子水，加氨水调 节体系pH7.5，摇匀萃取1次，黄酮类成分在乙醚层，三萜类成分在水层，分出 乙醚层，减压回收溶剂，甘草黄酮粗品采用真空箱中干燥（60℃），得甘草黄酮 粗品2.45克，黄酮含量74.39%，甘草苷含量30.25%；水层减压浓缩，冷冻干 燥，得甘草三萜粗品7.79克，三萜含量71.28%，甘草酸含量16.68%。

实施例4：

取100g甘草切片，加去离子水按料液比1:10、1:8和1:8煮沸提取3次， 每次1小时，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液比重1.05（20℃），按1:1 比例加入水饱和的正丁醇，加盐酸调节体系pH3.0，摇匀萃取1次，黄酮类和三 萜类成分在正丁醇层，糖类成分在水层，分出水层，减压和冷冻干燥，得甘草 糖类粗品14.31克，其中含糖量85.77%。将全部糖类粗品用水溶解后，按水液 与sevag试剂（加氯仿:正丁醇=4:1）5:1加入sevag试剂，离心，去沉淀（主 要为蛋白质），上清液加入95%乙醇至乙醇浓度达到80%，室温下静置24小时， 真空抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤，真空干燥（温度60℃），得甘草多糖粗品7.35 克，约占糖类粗品的57.51%。正丁醇层按1:1比例加入去离子水，加氨水调节 体系pH7.0，摇匀萃取1次，黄酮类成分在正丁醇层，三萜类成分在水层，分出 正丁醇层，减压回收溶剂，甘草黄酮粗品采用真空箱中干燥（60℃），得甘草黄 酮粗品2.55克，黄酮含量68.89%，甘草苷含量31.95%；水层减压浓缩，冷冻 干燥，得甘草三萜粗品8.78克，三萜含量71.88%，甘草酸含量19.69%。

实施例5：

取100g甘草粉碎，加50wt%甲醇按料液比1:10、1:8和1:8回流提取3 次，每次1小时，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液比重1.15（20℃），按 1:1比例加入乙酸乙酯，加硫酸调节体系pH4.3，摇匀萃取1次，黄酮类和三萜 类成分在乙酸乙酯层，糖类成分在水层，分出水层，减压和冷冻干燥，得甘草 糖类粗品9.54克，其中含糖量86.47%。将全部糖类粗品用水溶解后，按水液与 sevag试剂（加氯仿:正丁醇=4:1）5:1加入sevag试剂，离心，去沉淀（主要 为蛋白质），上清液加入95%乙醇至乙醇浓度达到80%，室温下静置24小时，真 空抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤，真空干燥（温度60℃），得甘草多糖粗品5.23 克，约占糖类粗品的54.82%。乙酸乙酯层按1:1比例加入去离子水，加氨水调 节体系pH6.5，摇匀萃取1次，大部分黄酮类成分在乙酸乙酯层，三萜类成分和 少部分黄酮在水层，分出乙酸乙酯层，减压回收溶剂，甘草黄酮粗品采用真空 箱中干燥（60℃），得甘草黄酮粗品2.89克，黄酮含量68.85%，甘草苷含量 32.38%；水层减压浓缩，冷冻干燥，得甘草三萜粗品9.21克，三萜含量76.28%， 甘草酸含量21.23%。

虽然本发明的具体实施例被详细地显示和描述，以说明本发明的应用和原 理，但是可以理解这并不表明本发明被局限于此，而且本发明能够在不脱离该 原理以其它的方式实施。在本发明的一些实施例中，本发明的某些特征有时候 可以不与其它的特征相应使用，被用于优选实施。相应地，所有这些改变和实 施例全部落入本发明的保护范围。