杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用

摘要

本发明提供了杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其在免疫层析时中应用。杂交瘤细胞株1H2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C201329。杂交瘤细胞株1H2可以用于制备高效价抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，采用鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达7.2×10

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用。 

背景技术

赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，是由多种生长在粮食(小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)、花生、蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉产生的。其中赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最大，在霉变谷物、饲料等中最常见。OTA主要经胃肠道吸收，在人体血液中半衰期长达840h，有很强的肝毒性和肾毒性，是引起巴尔干肾炎的主要原因，除此，其还具有致畸和致癌作用，与上尿路肿瘤发生率的增加密切相关。鉴于OTA的肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性和致畸性，其被世界卫生组织定为2B类可疑人类致癌物。且OTA有很高的化学稳定性和热稳定性，因此OTA污染问题引起了世界各国的广泛关注。为此，很多组织都对食品及饲料中的OTA含量进行了严格限定，如欧盟规定谷类等食品中OTA最高浓度为5μg/kg，国际粮农组织/世界卫生组织联合食品添加剂委员会暂定人每日对OTA最大耐受量为0.17ng/(kg·d)。而我国又属于小农户分散型的种植模式，因此鉴于OTA的广泛发生性，加强对食品及农产品中OTA的检测尤其是快速检测，对保障我国食品安全消费具有重要意义。 

现有的对赭曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。薄层层析法对赭曲霉毒素A进行检测时，不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法主要包括高效液相色谱法和液相色谱与质谱联用方法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求赭曲霉毒素A样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年 发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，其中，抗体作为免疫反应的核心试剂，为了建立针对抗赭曲霉毒素A的免疫学检测技术，必须先制得灵敏度高、特异性好的抗赭曲霉毒素A的抗体。发明内容 

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株1H2、其产生的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体及其应用。 

本发明提供了杂交瘤细胞株1H2，该杂交瘤细胞株已于2013年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201329。其具有序列表中SEQ ID No.1所示的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID No.2所示的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。 

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。该抗赭曲霉毒素A单克隆抗体可以识别赭曲霉毒素A，对赭曲霉毒素A的50％抑制浓度IC₅₀为52pg/mL。 

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体在赭曲霉毒素A含量测定中的应用。 

本发明提供的杂交瘤细胞株1H2是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，然后采用ELISA方法分两步筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗赭曲霉毒素A 而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用赭曲霉毒素A作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株1H2。 

本发明提供的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将上述获得的杂交瘤细胞株1H2注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗赭曲霉毒素A单克隆抗体。 

按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30～35μL，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用； 

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得。 

本发明的有益效果： 

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株1H2可以用于制备高效价抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，鼠腹水 抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达7.2×10⁵。 

(2)本发明提供的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对赭曲霉毒素A的50％抑制浓度IC₅₀为52pg/mL，与赭曲霉毒素B，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮，伏马毒素的交叉反应率均小于0.1％。 

(3)本发明提供的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体可应用于赭曲霉毒素A含量的测定。 

附图说明

图1为应用本发明提供的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体制备的赭曲霉毒素A免疫层析试纸条的正视图。 

图2为应用本发明提供的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体制备的赭曲霉毒素A免疫层析试纸条的侧视图。 

图3为实施例4中应用本发明提供的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体制备的赭曲霉毒素A免疫层析试纸的检测样品的结果判定图。 

图中：1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线；8对照试纸条；9检测试纸条。 

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株1H2的筛选 

1.动物免疫 

购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA。第一次免疫将赭曲霉毒素A完全抗原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的赭曲霉毒素A完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠70μg。前3次每次免疫后8～10天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血 清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。 

赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA购于Sigma-Aldrich公司。 

2.细胞融合 

于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50％PEG融合，融合1分钟，然后缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用20mL含1％HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。 

所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，2％(重量百分数)生长因子(HFCS)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体培养基为含1％(质量百分数)甲基纤维素的细胞完全培养基；RPMI-1640基础培养液、HEPES、双抗和L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于Sigma-Aldrich公司。 

3.细胞株的筛选及克隆 

待细胞融合后2-3周，细胞集落长到人肉眼可见时，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，即进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗赭曲霉毒素A而 不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用赭曲霉毒素A作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株1H2。 

实施例2：抗赭曲霉毒素A单克隆抗体杂交瘤细胞株1H2抗体可变区序列测定 

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株1H2的总RNA； 

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得； 

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃1min、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3’(22mer)和5’-TGAGGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3’(24mer)和5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。 

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长353bp，序列如SEQ ID NO：1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由117个氨基酸组成，序列如 SEQ ID NO：3所示。轻链可变区编码基因序列长329bp，序列如SEQ ID NO：2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由109个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO：4所示。 

实施例3：抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定 

将实施例1获得的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体杂交瘤细胞株1H2注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用； 

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。 

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株1H2分泌的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的亚型为IgGl。 

用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得注射杂交瘤细胞株1H2的BALB/c小鼠腹水抗体效价可达7.2×10⁵，即小鼠腹水抗体稀释7.2×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。 用常规间接竞争ELISA法鉴定其对赭曲霉毒素A的灵敏度为52pg/mL，与赭曲霉毒素B，黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮，伏马毒素的交叉反应率均小于0.1％。 

实施例4：抗体应用 

将杂交瘤细胞株1H2分泌的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体制备赭曲霉毒素A免疫层析试纸条，用于抗赭曲霉毒素A含量的检测，其具体制备方法包括以下步骤： 

(1)吸水垫的制备 

将吸水纸剪裁成长15～20mm宽3.4mm的规格，即得吸水垫； 

(2)检测垫的制备 

检测线的包被： 

将赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白的偶联物OTA-BSA用包被缓冲液配制成浓度为0.4mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为160ng，然后于37℃条件下干燥30分钟； 

质控线的包被： 

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的包被液；于距检测线6mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100ng，然后于37℃条件下干燥1小时； 

所述的包被缓冲液中每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g； 

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3.4mm； 

(3)样品垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3.4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； 

(4)金标垫的制备： 

将玻璃纤维膜剪裁成长10mm宽3.4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体为210ng，然后真空冷冻干燥2.5h，置干燥器中室温保存； 

所述步骤(3)和(4)中的封闭液为1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得； 

所述纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液的具体标记方法为：量取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用400μL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值；在搅拌的状态下缓慢加入1.5mL0.1mg/mL的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体水溶液，继续搅拌反应30min；加入质量浓度为10％牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入30.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用，其中纳米金标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶液的质量浓度为0.03mg/mL； 

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm； 

所述0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述0.1mg/mL抗赭曲霉毒素A单克隆抗体水溶液为1mg抗赭曲霉毒素A单克隆抗体溶解在10mL纯水中制成；所述10％牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；所述标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得； 

(5)试纸条的组装： 

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处 交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得赭曲霉毒素A免疫层析试纸条，见图1和图2。 

实施例5：上述赭曲霉毒素A免疫层析试纸条的应用： 

玉米样品的处理：取20g玉米样品用研磨机研磨，磨碎后加入80m L70％(体积分数)的甲醇水，搅拌反应2分钟，制得样品混合液，并将该混合液手动摇晃3分钟，然后用双层滤纸过滤，收集滤液2mL，加入4mL纯水稀释滤液，混匀，得到样品检测液。另取已知的赭曲霉毒素A空白玉米样品经同样处理获得空白玉米样品检测液。 

赭曲霉毒素A试纸条检测玉米样品：吸取1#和2#玉米样品检测液各100μL，分别逐滴加入赭曲霉毒素A免疫层析试纸条的样品垫，将其作为检测试纸条；同时取100μL不含赭曲霉毒素A的空白玉米样品检测液逐滴加入另一赭曲霉毒素A免疫层析试纸条的样品垫，将其作为对照试纸条，15分钟后读取结果。 

检测结果：对照试纸条的质控线和检测线均均显示出红色条带；1#样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色，由此判定其为阳性结果，且待测样品溶液中赭曲霉毒素A的含量等于或高于2ng/mL，见图3-1，再经换算得1#玉米样品中赭曲霉毒素A的含量等于或高于24ng/g。 

2#样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅，由此判定：其阳性结果，且待测样品溶液中赭曲霉毒素A的含量等于或高于0.5ng/mL，并小于2ng/mL，见图3-2，再经换算得2#玉米样品中赭曲霉毒素A含量等于或高于6ng/g，并小于24ng/g。