一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法

摘要

本发明公开了一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，其包括使用跨膜白介素21，CD14，CD19，CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活NK细胞。本发明的优点是与现有的类似复合物相比，本发明的复合物扩增和激活淋巴细胞的能力更强，效率更高。本发明在免疫治疗方面具有广阔的前景。

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体是指使用跨膜白介素21，CD14，CD19， CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活自然 杀伤细胞(NK)的方法。

背景技术

NK细胞治疗对肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝 癌和急性白血病等肿瘤治疗有明显疗效。目前NK细胞治疗在美国主要用来和 手术、化疗和放疗联合使用。NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗 中存在的问题在于获得大量NK细胞非常困难。传统使用的高剂量白介素2激 活生长倍数有限，端粒酶活性降低，扩增后的NK细胞杀伤功能低下。本公司 之前的发明采用K562细胞转染跨膜IL-21和CD137复合物解决了这一问题。用 该方法扩增的NK细胞纯度和活性显著增强，数量上可以达到临床治疗的需 要。然而在肿瘤微环境(tumor microenvironment)中存在有大量的TAMs(肿瘤相 关巨噬细胞)和CD19+B细胞，这些细胞为肿瘤细胞的生长提供营养因子。用仅 转染跨膜IL-21和CD137复合物的K562细胞激活扩增的NK细胞虽然对肿瘤细 胞有很强的杀伤能力，对肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和B细胞的杀伤能 力却很弱。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提出一种更具有发展潜力的方法，实现 NK细胞的扩增。

本发明是通过下述技术方案得以实现的：

在第一方面，本发明提供一种扩增激活淋巴细胞的方法，其特征在于，使 用跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的混合物与白介素2共同作 用扩增激活淋巴细胞，其中所述跨膜白介素21为白介素21与膜蛋白或膜蛋白 的胞外结构域相连而成的复合物，优选地为白介素21与CD8α的胞外结构域相 连而成的复合物；优选地，所述CD8α、白介素21、CD14、CD19、CD86和 CD137分别包含CD8α、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的完整氨基 酸序列或具备其功能的氨基酸序列片段。

在本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，可以加入两次或更多次跨膜白介 素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物，优选地，所述跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137混合物的剂量可以为50pM-1000pM，更优选地 可以为500pM～800pM。

在本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述跨膜白介素21、CD14、CD19、 CD86和CD137的混合物可以为纯化后的蛋白混合物或由同一宿主细胞即时表 达。

在本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述淋巴细胞可以为纯化的或未 纯化的，优选地，所述淋巴细胞可以是外周血淋巴细胞、纯化的NK细胞、纯 化的NK细胞和外周血淋巴细胞的组合、纯化的NK细胞或外周血淋巴细胞和别 的淋巴细胞的组合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射进人体 血管后作用的血液中所有白细胞，优选地所述纯化可以是指NK细胞为细胞总 数的50％以上。

在本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，跨膜白介素21、CD14、CD19、 CD86和CD137可以分别采用蛋白稳定表达系统，优选地，所述跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137各自的表达载体中均可以含有病毒启动子和选择 标记基因。

在本发明的扩增激活淋巴细胞的方法中，所述宿主细胞可以为K562细胞； 优选地，当所述跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137混合物同时由 K562细胞即时表达时，所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例可以为K562细 胞：淋巴细胞=1-10：1，更优选地，可以为K562细胞：淋巴细胞=1-4：1，最 优选地可以为2∶1-3∶1。

7、根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，其中所述白介 素2的最低剂量可以为50单位/毫升，优选地，可以加入两次或更多次所述白介 素2。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法，所述方法可以包括：

（1）在含有所述淋巴细胞的培养液中，加入同时表达跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的经过辐照的K562细胞以及白介素2共同培养 7天；

（2）将培养后的培养液离心，获取细胞沉淀，并用与步骤（1）中等量的 培养液重悬；和

（3）加入所述K562细胞，培养7天；

其中，优选地，所述培养液为：Eagle培养液加入10％人血清或10％小牛 血清；或RPMI1640加入10％人血清或10％小牛血清；或F-10(Ham’s)Nutrient  mixtures加入10％人血清或10％小牛血清；优选地，所述辐照的剂量为 100Gy-1000Gy。

本发明的扩增激活淋巴细胞的方法，可以通过所述方法扩增的淋巴细胞溶 于生理盐水溶液，优选地用于静脉滴注。

在第二方面，本发明提供了根据第一方面中所述的方法在制备在用于在受 治疗者中治疗癌症或传染性疾病的药物的制备中的应用，

其中，优选地所述受治疗者是哺乳动物，更优选地是人类；

所述癌症优选地为急性髓细胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺肿 瘤、恶性黑色素瘤和肾细胞恶性肿瘤中的一种或至少两种；

所述传染性疾病优选为细菌、病毒、真菌或寄生虫感染，更优选地为乙肝 病毒，甲肝病毒，丙肝病毒和艾滋病毒感染。作为优选，当使用纯化后的蛋白 混合物时，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的总剂 量在50pM～1nM；为了更好实现本发明，上述方法的跨膜白介素21、CD14、 CD19、CD86和CD137的总剂量在500pM～800pM。

作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137是 经过纯化处理的蛋白质，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％。

作为优选，跨膜IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137转染的K562细胞∶ 淋巴细胞＝1-10∶1。作为更佳选择，上述方法的淋巴细胞中加入白介素2 (10-500单位)，且K562细胞∶淋巴细胞＝1∶1、2∶1、3∶1或4∶1。

作为优选，上述方法的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137扩 增的NK细胞过程是通过溶于生理盐水溶液的方法进行。

本发明中跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137转染的K562细胞 对外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞扩增和激活有重要的作用。扩增和激活后 产生的NK细胞有重要的医疗作用。本发明利用的方法可以得到的足够数量和 功能的NK细胞，是理想的识别和摧毁肿瘤微环境中的肿瘤细胞、CD14+单核 细胞和CD19+B细胞，增强病人免疫反应的方法。肿瘤的类型参考前专利(专利 申请号：CN201110075736)。NK细胞还可以识别和杀伤病原体感染的细胞，其 中包括但不限于：乙肝病毒，甲肝病毒，丙肝病毒和艾滋病毒。

本发明中的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137、CD8α和白介 素2是该蛋白质的全部多肽，其中也包括这些蛋白质中具备功能的多肽成分。 本发明中的外周血单核细胞来自于外周血，脐带血和骨髓，是脱离人体的组 织。本发明中用于扩增的细胞可以是NK细胞；也可以是NK细胞和外周血单核 细胞的不同组合；也可以是NK细胞或外周血单核细胞和别的淋巴细胞的不同 组合；也可以是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/ 或CD137混合物注射进人体血管后所作用的血液中所有白细胞的总和。本发明 中的白介素2、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137来源于人，但不仅仅 限于人，如注射或处理的对象是其它物种，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以 是其它物种的白介素2、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137。

除非另有说明，本发明中所有的技术和科学词汇的含义是本行业内的具有 普通技能的人士通常理解的含义。常用术语的定义在所有分子生物学书中可以 找到，例如，Benjamin Lewin，Genes VIII，Oxford University Press， 2004(ISBN 0-13-145140-5)。

为了确保长期，高收益的生产重组白介素21、CD14、CD19、CD86和 CD137，本发明采用了蛋白稳定表达系统。构建蛋白稳定表达系统是本行业内 的具有普通技能的人士所通常采用的技术，具体方法可详见(Imai等Leukemia， 2004，18，676-684)。例如，K562细胞系转录了稳定表达跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，这个载体中含有病毒启动子和选 择标记基因，如抗生素抗性基因。CD8α是一种在细胞膜上表达的膜蛋白， CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋 白；CD14、CD19、CD86和CD137为膜蛋白。外源表达载体进入宿主细胞 后，用恰当的方法激活启动子，培养细胞一段时间后即可以得到在细胞膜上高 水平表达的白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137多肽。这些方法是本行 业内的具有普通技能的人士通常理解的方法。

在K562细胞膜上高水平表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 CD137的细胞可以通过高速离心的方法收集，K562细胞可以通过这些技术包括 但不限于下面所列的方法处理：强酸，强碱和辐照。处理后的细胞可以直接与 外周血淋巴细胞(PBMC)或NK细胞共同培养，激活扩增NK细胞，也可以纯化 分离后与PBMC共同培养，激活扩增NK细胞。

在细胞膜上高水平表达的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137 可以通过本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的技术来纯化和分离。这些技 术包括但不限于下面所列的方法：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离 子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集 素。如有必要，蛋白质复性的方案可用来帮助纯化表达的蛋白多肽。如果有必 要，高效液相色谱法(HPLC)可作最后的纯化步骤进一步纯化蛋白质。本发明中 在宿主细胞内表达的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137会有一部 分分泌到细胞培养上清液中。本行业内的具有普通技能的人士都可以根据普通 的生物化学技术来验证。分泌到细胞培养上清液中的跨膜白介素21、CD14、 CD19、CD86和CD137也可以通过上述方法纯化和分离。

细胞膜为跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137提供了固相支 撑，所述固相支撑包括但不仅仅限于金属、玻璃、塑料、聚合物、颗粒、微小 颗粒、磷脂、磷脂双分子层、细胞膜和类似物。重要的是固相的表面能够粘附 上述蛋白质。

跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137也可以通过标准的操纵核 苷酸编码序列的方法来生产。例如，用特定的，非特定的定点突变或其他分子 生物学技术来生产功能等同的，但一级结构不相同的多肽。简单的一个或多个 氨基酸修改如果不影响蛋白质的生化特性，这些通过氨基酸保守替换产生的蛋 白质也在本发明保护的范围之内。

本发明中转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞 扩增的NK细胞，可以用来进行自体移植，也可以进行异体移植。在受捐助人 (成年人或者未成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原与捐助人(成年人或者未 成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和扩增 的细胞可以通过静脉滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些应用中，细 胞系(例如，NK细胞系，NKT细胞系)也可以通过转染跨膜白介素21、CD14、 CD19、CD86和CD137的K562细胞进行激活和扩增。扩增的细胞系用于制备 治疗疾病的药物也是本发明的保护范围。

淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞可从来源于包含有大量淋巴细胞和前体细胞 的任何组织。例如，外周血(包括脐带血)，骨髓，脾脏和淋巴结。淋巴细胞或 淋巴细胞前体细胞通常取自于外周血或骨髓。在其他应用中(例如，实验研 究)，脾脏和/或淋巴结也是合适的来源。

例如，淋巴细胞可以通过抽外周血和/或骨髓来获得。淋巴细胞可以进一步 经过纯化得到NK细胞和NKT细胞。纯化NK细胞，NKT细胞的步骤和工艺是 本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴细胞可以通过密度梯度离心的 方式来分离血液或骨髓中的血红细胞，淋巴细胞和其他细胞。NK细胞和NKT 细胞可以利用抗体介导的亲和制备方法进一步纯化，例如抗体结合磁珠法。纯 化淋巴细胞并不要求纯化的淋巴细胞绝对纯，而是指纯化的细胞比其在来源组 织中所占的比例更高。通常情况下，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％，或 者60％，或者更高。纯化的NK细胞和NKT细胞悬浮在一个合适的生理缓冲溶 液中，然后悬浮生长于但不局限于下列培养液中，Eagle′s培养液加入10％人血 清，RPMI 1640加入10％人血清，F-10(Ham′s)Nutrient mixtures加入10％人血 清。人血清也可以用10％胎牛血清取代，但人血清对NK细胞的扩增效果更 好。

淋巴细胞和/或纯化的淋巴细胞和/或淋巴细胞前体细胞悬浮生长于细胞培 养液中，加入辐照后转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的 K562细胞和低剂量白介素2培养，每周加入新的转染跨膜白介素21、CD14、 CD19、CD86和CD137的K562细胞。通常情况下为了降低成本和避免感染， 本发明采用最小的剂量来扩增NK淋巴细胞。白介素2的剂量在50单位/毫升到 1000单位/毫升之间。在某些情况下，白介素2复合物的剂量至少在500单位/ 毫升以上。在某些情况下，有必要进行高剂量的处理，激活浓度约为500单位/ 毫升或1000单位/毫升。另外，跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137 直接注射入人体，用来在体内扩增NK细胞时，所用剂量在0.5pM到0.5nM之 间。转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞的采用剂 量按照跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137在K562中的表达剂量来 确定。在某些情况下，按照K562∶外周血单核细胞＝1∶1，2∶1，3∶1，4∶1 或以上加入转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞。 在某些情况下，有必要进行高剂量的处理，按照K562∶外周血单核细胞＝10∶ 1或以上加入转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细 胞。在体外扩增的NK细胞可以移植给单核细胞的捐助人本身或者受捐助人， 以加强天生或抗原特异性免疫反应。通常情况下，扩增的NK细胞通过溶于生 理盐水溶液的方法静脉滴注。

有益效果：

（1）本发明在跨膜白介素21和CD137的K562细胞的基础上，转染了 CD14、CD19和CD86。K562细胞上转染的CD14有助于激活NK细胞识别并 杀伤肿瘤相关巨噬细胞；转染CD19有助于激活NK细胞识别并杀伤B细胞； 转染CD86有助于提升NK细胞对肿瘤细胞、微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和微 环境中的B细胞的杀伤作用。

（2）本发明提供体外扩增和激活NK的方法比用仅转染跨膜白介素21和 CD137的K562细胞激活扩增NK细胞的方法，扩增的效率高2.4倍，扩增后的 NK细胞对肿瘤相关巨噬细胞的杀伤能力提高了2.7倍。动物实验结果表明：与 用仅转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞激活扩增的NK细胞相比，采用 本发明扩增的NK细胞显著提高了对小鼠体内肿瘤的杀伤能力。

（3）本发明通过转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的 K562细胞和低剂量白介素2培养扩增激活的NK提高病人的免疫力来帮助病人 抵抗肿瘤，抵抗病毒和细菌。

附图说明

图1是本发明中宿主细胞同时表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 CD137的结构示意图；

图2NK细胞体外扩增线性图，显示NK淋巴细胞在转染跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下线性 增长，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增NK细胞作为对照；

图3PBMC细胞体外扩增线性图，显示淋巴细胞在转染跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下线性 增长，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增淋巴细胞作为对照；

图4PBMC细胞体外扩增前后流示仪数据图，PBMC细胞在转染跨膜白介 素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用 下培养14天后NK细胞(CD56+，CD16+和CD56+/CD16+)的比例显著增长，转 染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增PBMC细胞作为对照；

图5NK细胞杀伤肿瘤细胞图，人PBMC细胞在转染跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下，培 养14天后NK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤作用，转染跨膜白介素21和CD137 的K562细胞扩增PBMC中的NK细胞作为对照；

图6NK细胞杀伤TAM细胞，人PBMC细胞在转染跨膜白介素21、CD14、 CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素2共同作用下，培养14天 后NK细胞对TAM细胞的杀伤作用，转染跨膜白介素21和CD137的K562细 胞扩增PBMC中的NK细胞作为对照；

图7扩增激活后人NK细胞对小鼠体内PC3肿瘤细胞系的杀伤作用图，转 染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介素 2共同作用下，培养14天后NK细胞对小鼠体内的PC3细胞有较强的杀伤作 用，转染跨膜白介素21和CD137的K562细胞扩增PBMC中的NK细胞作为对 照图；

图8转染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和 低剂量白介素2共同作用下扩增PBMC中的NK细胞图，培养14天后NK细胞 显著提高肿瘤小鼠的存活率和延长小鼠平均寿命，转染跨膜白介素21和CD137 的K562细胞扩增PBMC中的NK细胞作为对照图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

下面对本发明的实施作具体说明：

以K562细胞系转录稳定表达跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 CD137的表达载体（参见图1），CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基 因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白，而 CD14、CD19、CD86和CD137均为膜蛋白，其各自的载体分别中含有病毒启 动子和选择标记基因；当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，培养 K562细胞一段时间，即可以同时得到在细胞膜上的白介素21、CD14、CD19、 CD86和CD137多肽；经培养后的K562细胞膜上同时具有表达跨膜白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的细胞，通过强酸，强碱、和/或辐照、及通过 高速离心收集K562细胞；或对K562细胞的依次用硫酸铵或乙醇沉淀，强酸提 取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱 法，色谱法和凝集素进行纯化收集；将上述离心收集的K562细胞与NK细胞、 或NK细胞和外周血单核细胞的组合、或是NK细胞与淋巴细胞的组合、或是外 周血单核细胞和其它淋巴细胞的组合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14 和/或CD19和/或CD86和/或CD137与白细胞的组合进行共同培养、或在纯化 分离K562细胞后与PBMC共同培养，激活扩增NK细胞，直至NK细胞代表总 数的50％以上。

实施例1扩增NK细胞。

取NK细胞(2x107)培养在RPMI1640中，辅以10％的人血清。在培养液中 加入转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞(辐 照，100Gy)和白介素2(50单位/毫升)后培养7天。7天后离心，用等量的培养液 重悬，加入经过辐照的转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137 的K562细胞（Imai等Leukemia，2004，18，676-684），再培养7天，如图1 所示。高剂量白介素2(200单位/毫升)作为对照组。如图1所示，NK细胞在转 染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细胞和低剂量白介 素2的共同作用下，数量显著增加。细胞数量的增加可以通过插入胸苷的方法 来测定。胸苷插入之后细胞继续培养12小时，然后再开始测量细胞数量的变 化。在K562∶NK淋巴细胞＝1∶1浓度的作用下NK细胞数量在7天时进入对 数生长期，14天的时约增长了2200倍。在加入滋养细胞后，NK细胞在50单 位/毫升的白介素2作用下即可开始增长。转染CD8α-白介素21、CD14、 CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞对于促进NK细胞生长的作用明显强 于转染跨膜白介素2和CD137的K562滋养细胞(14天时约强2.4倍)。

实施例2扩增未经纯化的外周血淋巴细胞

转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞不 仅可以扩增纯化的NK细胞，还可以扩增未经过纯化的淋巴细胞。健康捐献人 的PBMC培养在RPMI1640中，辅以10％的人血清。在培养液中加入转染 CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞(辐照， 100Gy)和低剂量白介素2后共同培养7天。7天后离心，用等量的培养液重悬， 加入经过100Gy辐照的滋养细胞，再培养7天，如图2所示。转染CD8α-白介 素21和CD137的K562滋养细胞作为对照。NK细胞在转染CD8α-白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2的共同作用 下，数量显著增加。NK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天的时约增长 了2100倍。转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋 养细胞对于促进外周血淋巴细胞中NK细胞生长的作用明显强于转染跨膜白介 素2和CD137的K562滋养细胞(14天时，2.1倍)。

在转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞 和低剂量白介素2共同作用下，第14天时95％的淋巴细胞变成NK细胞 (CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)，如图3所示。对照组细胞在转染CD8α-白介 素21和CD137的K562滋养细胞作用下，外周血淋巴细胞有91％细胞变成NK 细胞(CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)。

实施例3扩增后的NK细胞对肿瘤细胞和TAM(肿瘤相关巨噬细胞)的裂解作用

在转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞 和低剂量白介素2共同作用下扩增的NK细胞对肿瘤细胞的裂解作用

以前的研究表明给患肿瘤的小鼠注射白介素2能够增强小鼠的抗肿瘤能 力，延缓小鼠的寿命。本实施例采用转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、 CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下扩增的NK细胞 与肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞共同培养的方法，来研究用扩增的NK细胞进 行抗肿瘤的可行性。本实施例采用转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、 CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下扩增的NK细胞 注射小鼠体内治疗小鼠体内肿瘤的方法，来研究扩增的NK细胞抗肿瘤的效 果。

将健康捐献者的淋巴细胞中分离出来后，加入转染CD8α-白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞和低剂量白介素2共同作用下 扩增的NK细胞生长14天。K562和肿瘤相关巨噬细胞被用来作为裂解的靶细 胞。K562是B细胞肿瘤细胞系，该细胞系是血液肿瘤细胞系。IL-4，IL-10和 IL-13处理后的单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞被用来作为裂解的靶细胞。扩 增的NK细胞和靶细胞按照适当的比例共同培养6小时后检测存活的靶细胞。 转染CD8α-白介素21和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞作为对照组。

转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩 增的NK细胞与对照组NK细胞对K562靶细胞的杀伤作用相当，而对肿瘤相关 巨噬细胞的杀伤作用则显著增强，p＜0.05，如图5所示。

体外用Lentivirus系统构建Fluc报告基因稳定表达的PC3细胞系。Fluc  Lentivirus系统购自System Biosciences(美国，加州)，具体构建方法详见产品介 绍。PC3-Fluc细胞静脉注射进严重免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)，21天后荧光检 测器检测肿瘤的生长情况，随机分组。扩增后的NK细胞按照1x10⁷细胞/每只 小鼠自尾静脉注射，一周两次。连续治疗四周后停止治疗，观察治疗效果。图 6显示治疗14天后肿瘤报告基因的荧光信号。转染CD8α-白介素21和CD137 的K562滋养细胞扩增的NK细胞对肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用。转染 CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩增的NK 细胞比对照组NK细胞PC3肿瘤细胞的杀伤作用强。图7显示，对照组的NK 细胞对延长小鼠的存活率有一定的作用。而与对照组相比，转染CD8α-白介素 21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞显著提高 了对肿瘤的治愈率，显著延长了小鼠的存活率。这提示转染CD8α-白介素21、 CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋养细胞扩增的NK细胞可以用于临床 的肿瘤治疗。

在本发明的实施例中提供了一个可以用来制成药物的方案，按照这个方案 制成的药物可以有下面所描述的多种用途。这个方案包括白介素2、白介素 21、CD14、CD19、CD86和CD137。利用本方案扩增的NK细胞适用于需要增 强病人免疫力的各种情景。例如，扩增NK细胞对治疗肿瘤特别有效，如急性 髓细胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺肿瘤，恶性黑色素瘤和肾细胞恶 性肿瘤，但不仅仅限于上述肿瘤。例如，扩增NK细胞对治疗细菌，真菌或寄 生虫内感染特别有效。扩增的NK细胞对治疗病毒感染特别有效，如乙肝病 毒，甲肝病毒，丙肝病毒和艾滋病毒但不仅仅限于上述病毒感染。扩增的NK 细胞可以显著提高抗原的作用效果。

本发明中转染CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562细 胞可用来扩增NK细胞，也可以移植病人。体外扩增的NK细胞可移植病人。 例如，CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD137和低剂量白介素2扩增 激活NK细胞的方法比用仅转染CD8α-白介素21和CD137的K562细胞激活扩 增NK细胞的方法，扩增的效率高2.4倍。两个星期后，NK细胞的纯度可以达 到95％，细胞的数量可以达到1.0x10¹⁰以上，满足临床治疗的需求，如图4所 示。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法， 但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述 详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的 任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增 加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。