降低锌指蛋白CTCF表达的物质在制备治疗白血病药物中的应用

摘要

本发明公开了降低锌指蛋白CTCF表达的物质在制备治疗白血病药物中的应用。降低锌指蛋白CTCF表达的物质具体可为形成茎环结构的短发夹RNA，其名称为shRNA-3，所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQ ID No.1，所述茎环结构中茎的另一条链序列是SEQ ID No.2。本发明证明锌指蛋白CTCF是一个抗凋亡因子，在ALL细胞中具有抑制细胞凋亡的作用，干扰CTCF的表达可促进肿瘤细胞白血病细胞发生凋亡。本发明为白血病治疗提供了一条新的途径，锌指蛋白CTCF有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有十分广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及降低锌指蛋白CTCF表达的物质在制备治疗白血病药物中的应用。

背景技术

锌指蛋白CTCF又称CCCTC结合因子，是由727个氨基酸组成的高度保守的多锌指 结构蛋白。它参与多种生物学调节功能，包括转录激活或抑制、染色质绝缘、基因印 记及X染色体失活等。

研究发现CTCF参与多种人类肿瘤的发生发展过程。人们已在乳腺癌、前列腺癌及 肾母细胞瘤中找到了CTCF锌指结构的肿瘤特异性突变。该突变使得CTCF丧失与下游 肿瘤靶基因的结合能力，导致这些基因表达异常，由此引发肿瘤。此外，CTCF可通过 表观遗传学机制参与肿瘤的发生。研究者在肾母细胞瘤、结肠癌和直肠癌中发现CTCF 结合位点存在异常甲基化现象，并推测由此可引发CTCF结合功能丧失，进而诱发肿瘤。 可见CTCF遗传学及表观遗传学改变在肿瘤发生中起到关键作用。

白血病是造血干/祖细胞在分化不同阶段发生凋亡障碍、分化受阻及恶性增殖而引 发的造血系统恶性疾病。该疾病是儿童时期最常见的恶性肿瘤和最常见的死亡原因。 我国每年新发儿童白血病1.5万例左右，其中儿童急性淋巴细胞白血病（Acute  Lymphoblastic Leukemia，ALL）是最常见的类型，占儿童白血病的75%。20世纪80年 代后，由于多药联合强化疗及有力的支持治疗，儿童ALL的治愈率已达80%左右，但近 30年来ALL治愈率无明显提高，主要原因是白血病的发病机理至今不明。此外，白血病 复发也是重要因素之一。目前儿童白血病的复发率高达15%左右，已成为影响白血病患 儿康复的最关键因素，不仅给患儿本身、而且给家庭及社会带来了不可弥补的严重伤 害和不和谐因素。

因此，深入探讨白血病的发病机理、探索儿童白血病的药物靶点将有助于儿童白 血病的诊治。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种可促进白血病细胞凋亡的短发夹RNA （shRNA，short hairpin RNA）及其相关生物材料。

本发明所提供的可促进白血病细胞凋亡的短发夹RNA，名称为shRNA-3，形成茎 环（Stem-loop）结构，所述茎环结构中茎（Stem）的一条链序列是SEQ ID No.1，所 述茎环结构中茎的另一条链序列是SEQ ID No.2。

其中，SEQ ID No.1由19个核糖核苷酸组成，SEQ ID No.2由19个核糖核苷酸 组成。

所述短发夹RNA中的环（loop）只要满足使所述短发夹RNA能产生由SEQ ID No.1 所示的单链RNA和SEQ ID No.2所示的单链RNA组成的双链小干扰RNA（siRNA）即可。 在本发明的一个实施例中，所述短发夹RNA的核苷酸序列是SEQ ID No.3。

其中，SEQ ID No.3由47个核糖核苷酸组成，SEQ ID No.3的第1-19位与SEQ ID  No.1相同，SEQ ID No.3的第29-47位与SEQ ID No.2相同。

本发明所提供的shRNA-3相关的生物材料为1）至6）中任一种：

1）编码shRNA-3的DNA分子；

2）含有1）所述DNA分子的表达盒；

3）含有1）所述DNA分子的重组载体、或含有2）所述表达盒的重组载体；

4）含有1）所述DNA分子的重组微生物、或含有2）所述表达盒的重组微生物、 或含有3）所述重组载体的重组微生物；

5）含有1）所述DNA分子的转基因细胞系、或含有2）所述表达盒的转基因细胞 系、或含有权利要求3）所述重组载体的转基因细胞系；

6）小干扰RNA，一条链的核苷酸序列如SEQ ID No.1，另一条链的核苷酸序列如 SEQ ID No.2。

上述shRNA-3相关的生物材料中，1）所述编码shRNA-3的DNA分子具体可为1） 至3）中的任一种的双链DNA分子：

1）一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.4，另一条链的的核苷酸序列是SEQ ID No.5。

2）所述DNA分子的编码序列是SEQ ID No.4的第1-47位；

3）所述DNA分子的编码序列是SEQ ID No.5的第12-58位。

其中，SEQ ID No.4由54个脱氧核糖核苷酸组成，SEQ ID No.5由58个脱氧核 糖核苷酸组成。SEQ ID No.4的第1-47位与SEQ ID No.5的第12-58位反向互补。

上述shRNA-3相关的生物材料中，2）所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达 shRNA-3的DNA，该DNA不但可包括启动shRNA-3基因转录的启动子，还可包括终止 shRNA-3基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。在本发明的 一个实施例中，所述表达盒由U6启动子（其序列如SEQ ID No.8所示）、编码shRNA-3 的DNA分子和终止编码shRNA-3的DNA分子的PolⅢ终止子（序列为5’-TTTTT-3’） 组成。3）所述重组载体具体可为用编码shRNA-3的DNA分子替换pDsU6的SacⅠ和 HindⅢ之间片段得到的表达shRNA-3的重组表达载体pDsU6-sh-3，或为用编码 shRNA-3的DNA分子替换pDsU6-GFP的BamHⅠ和HindⅢ之间片段得到的表达shRNA-3 的重组表达载体pDsU6-GFP-sh-3。pDsU6-GFP是用GFP（绿色荧光蛋白）基因替换pDsU6 的AflⅡ和BamHⅠ之间片段得到的表达GFP的重组表达载体。4）所述重组微生物具 体可为细菌,酵母,藻和真菌。5）所述的转基因细胞系不包括动物和植物的繁殖材料。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供shRNA-3及其相关生物材料在治疗和/ 或预防白血病方的面应用。

本发明所提供的应用为C1至C4中的任一种：

C1、治疗和/或预防白血病的产品（如药物），它的活性成分包括b1-b3中的至少 一种：

b1、shRNA-3；

b2、编码shRNA-3的DNA分子；

b3、上述shRNA-3相关的生物材料。

C2、促进白血病细胞凋亡的产品（如药物），它的活性成分包括所述b1-b3中的至 少一种；

C3、所述b1-b3中至少一种物质在制备治疗和/或预防白血病的产品（如药物）中 的应用；

C4、所述b1-b3中至少一种物质在制备促进白血病细胞凋亡的产品（如药物）中 的应用。

上述C1和C2的产品中，活性成分也可只为b1-b3中的至少一种。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供降低锌指蛋白CTCF基因表达的物质的 用途。

本发明所提供的降低锌指蛋白CTCF基因表达的物质的用途，为a1或a2：

a1、降低锌指蛋白CTCF基因表达的物质在制备治疗和/或预防白血病的产品（如 药物）中的应用；

a2、降低锌指蛋白CTCF基因表达的物质在制备促进白血病细胞凋亡的产品（如药 物）中的应用。

其中，所述降低锌指蛋白CTCF基因表达的物质为所述b1-b3中的至少一种。

上述用途中，所述锌指蛋白CTCF的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所述锌指蛋 白CTCF基因的编码序列如SEQ ID No.6的第445-2628位所示。

其中，SEQ ID No.7由727个氨基酸残基组成，SEQ ID No.6由3946个脱氧核糖 核苷酸组成，其编码序列是第445-2628位。

上文中所述白血病细胞可为体内的细胞，也可为细胞系，如人前B细胞急性淋巴 细胞白血病细胞系NALM-6。

实验证明，以锌指蛋白CTCF的mRNA为靶点，将RNA干扰重组表达载体——表达 shRNA-3的重组表达载体pDsU6-GFP-sh-3转入B淋巴细胞白血病的细胞系NALM-6中 获得的白血病重组细胞，其锌指蛋白CTCF表达水平明显低于对照，细胞总体凋亡比例 为28%，是对照的3.8倍。本发明证明锌指蛋白CTCF是一个抗凋亡因子，在ALL细胞 中具有抑制细胞凋亡的作用，干扰CTCF的表达可促进肿瘤细胞白血病细胞发生凋亡， 并增加白血病细胞对化疗药物的敏感性。本发明为白血病治疗提供了一条新的途径， 锌指蛋白CTCF有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有十分广阔的应 用前景。

附图说明

图1为RNA干扰重组白血病细胞中CTCF的Western blot结果。其中，上一排为 以CTCF单克隆抗体为一抗检测锌指蛋白CTCF，下一排为以GAPDH单克隆抗体为一抗 检测内参GAPDH。

图2为流式细胞仪检测RNA干扰重组白血病细胞中的Annexin V(+)/PI(-)细胞比 例。

图3为重组白血病细胞早期凋亡比例柱形统计图。

图1-3中的sh-luc、sh-CTCF-1、sh-CTCF-2和sh-CTCF-3分别代表重组白血病 细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc、NALM-6/pDsU6-GFP-sh-1、NALM-6/pDsU6-GFP-sh-2 和NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值。

载体pDsU6：记载在下述文献中：Shilai Bao,Tao Lu,Xin Wang,Huyong Zheng, Li-E Wang,Qingyi Wei,Walter N Hittelman and Lei Li.Disruption of the  Rad9/Rad1/Hus1(9–1–1)complex leads to checkpoint signaling and replication  defects.Oncogene,2004,23,5586–5593。公众可从首都医科大学附属北京儿童医 院获得，以重复本申请实验。

B-ALL细胞系NALM-6（前B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系NALM-6）记载在下述 文献中：郜慧芳,张寒,裴珮,刘怡,李志刚,姜锦,张瑞东,高超,戚豫,郑胡镛. 剪接因子SF2/ASF在儿童白血病细胞中的表达.《首都医科大学学报》,2009年6月 第30卷第03期。公众可从首都医科大学附属北京儿童医院获得，以重复本申请实验。

实施例1、锌指蛋白CTCF的RNA干扰重组表达载体构建

1、RNA干扰靶序列的选择

针对锌指蛋白CTCF编码基因CTCF的全长cDNA序列（SEQ ID No.6），选择如下三段 DNA序列为RNA干扰的靶序列：

sh-1：SEQ ID No.6的第809-827位（即5’-TGACTGTACCTGTTGCTAC-3’）

sh-2：SEQ ID No.6的第1103-1122位（即5’-ATGTAGATGTGTCTGTCTAC-3’）

sh-3：SEQ ID No.6的第1398-1416位（即5’-TACTCGTCCTCACAAGTGC-3’）

SEQ ID No.6中第445-2628位为开放阅读框，编码SEQ ID No.7所示的锌指蛋白 CTCF。

2、小干扰RNA（siRNA）

分别设计针对步骤1锌指蛋白CTCF的三种靶序列的三种siRNA（siRNA-1、siRNA-2 和siRNA-3）。siRNA-1的靶序列为sh-1，siRNA-2的靶序列为sh-2，siRNA-3的靶序列为 sh-3。

1）siRNA-1

siRNA-1-F：5’-ugacuguaccuguugcuac-3’；

siRNA-1-R：5’-guagcaacagguacaguca-3’；

2）siRNA-2

siRNA-2-F：5’-auguagaugugucugucuac-3’；

siRNA-2-R：5’-guagacagacacaucuacau-3’。

3）siRNA-3

siRNA-3-F：5’-uacucguccucacaagugc-3’（SEQ ID No.1）；

siRNA-3-R：5’-gcacuugugaggacgagua-3’（SEQ ID No.2）。

3、短发夹RNA（shRNA）

根据步骤2的三种siRNA，设计产生siRNA-1的shRNA-1、产生siRNA-2的shRNA-2、 产生siRNA-3的shRNA-3。

shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3的序列如下（大写字母为环序列，其余序列为茎序列， 形成反向重复序列）：

shRNA-1：

5’-ugacuguaccuguugcuacUUCAAGAGAguagcaacagguacaguca-3’；

shRNA-2：

5’-auguagaugugucugucuacUUCAAGAGAguagacagacacaucuacau-3’；

shRNA-3：

5’-uacucguccucacaagugcUUCAAGAGAgcacuugugaggacgagua-3’（SEQ ID No.3）。

同时，将沉默荧光素酶基因的shRNA-luc作为对照：

shRNA-luc：5’-gaagcgcauccaauaccagcUUCAAGAGAgcugguauuggaugcgcuuc-3’

荧光素酶（luciferase）是一个在前B急性淋巴细胞白血病细胞系NALM-6细胞中 没有表达的蛋白，所以将以荧光素酶为靶点的shRNA-luc作为对照。

4、编码siRNA及shRNA的DNA分子的设计与合成

1）以sh-1为靶点的表达shRNA-1的双链DNA分子（名称为sh-CTCF-1）的两条单链 DNA序列如下：

CTCF-ssDNA809-1-F：

5’-tgactgtacctgttgctacTTCAAGAGAgtagcaacaggtacagtcacTTTTTA-3’；

CTCF-ssDNA809-1-R：

5’-AGCTTAAAAAgtgactgtacctgttgctacTCTCTTGAAgtagcaacaggtacagtca-3’。

2）以sh-2为靶点的表达shRNA-2的双链DNA分子（名称为sh-CTCF-2）的两条 单链DNA序列如下：

CTCF-ssDNA1103-2-F：

5’-atgtagatgtgtctgtctacTTCAAGAGAgtagacagacacatctacatcTTTTTA-3’；

CTCF-ssDNA1103-2-R：

5’-AGCTTAAAAAgatgtagatgtgtctgtctacTCTCTTGAAgtagacagacacatctacat-3’。

3）以sh-3为靶点的表达shRNA-3的双链DNA分子（名称为sh-CTCF-3）的两条 单链DNA序列如下：

CTCF-ssDNA1398-3-F（SEQ ID No.4）：

5’-tactcgtcctcacaagtgcTTCAAGAGAgcacttgtgaggacgagtacTTTTTA-3’；

CTCF-ssDNA1398-3-R（SEQ ID No.5）：

5’-AGCTTAAAAAgtactcgtcctcacaagtgcTCTCTTGAAgcacttgtgaggacgagta-3’。

4）以荧光素酶为靶点的表达shRNA-luc的双链DNA分子（名称为sh-luc）的两 条单链DNA序列如下：

lucDNA-F：

5’-gaagcgcatccaataccagcTTCAAGAGAgctggtattggatgcgcttccTTTTTTTA-3’；

lucDNA-R：

5’-AGCTTAAAAAAAggaagcgcatccaataccagcTCTCTTGAAgctggtattggatgcgcttc-3’。

上述8条单链DNA由Invitrogen公司合成,下划线部分为HindⅢ粘性末端序列。

各取5μg（10ng/μl）互补的单链DNA混合，100℃热处理5分钟后，室温退火， 获得双链DNA分子，取双链DNA分子5μg进行磷酸化处理，获得双链DNA反应体 sh-CTCF-1、sh-CTCF-2、sh-CTCF-3和sh-luc。

其中，上述磷酸化处理的反应体系（50μl）：双链DNA5μg，10×T₄Kinase Buffer 5μl，ATP（10mM）5μl，T₄Polynucleotide Kinase（10U/μl）2μl，用ddH₂O补充 至50μl。

上述磷酸化处理的反应条件：37℃水浴反应1小时，再100℃10分钟后慢慢冷却 到室温，得到可用于构建重组质粒的双链DNA反应体。

5、锌指蛋白CTCF的RNA干扰重组表达载体构建

1）RNA干扰重组表达载体pDsU6-sh-1、pDsU6-sh-2、pDsU6-sh-3和pDsU6-sh-luc 的构建

取载体pDsU6先用SacⅠ酶切后，用T4Polymerase Klenow片段进行末端补平处 理，凝胶回收的线性化片段再用HindⅢ酶切消化，回收pDsU6载体的骨架片段，分 别与步骤4获得的四种双链DNA反应体连接，得到四种RNA干扰重组表达载体 pDsU6-sh-1、pDsU6-sh-2、pDsU6-sh-3、pDsU6-sh-luc，经测序证实，pDsU6-sh-1为 用sh-CTCF-1替换pDsU6的SacⅠ和HindⅢ之间片段得到的表达shRNA-1的重组表 达载体，pDsU6-sh-2为用sh-CTCF-2替换pDsU6的SacⅠ和HindⅢ之间片段得到的 表达shRNA-2的重组表达载体，pDsU6-sh-3为用sh-CTCF-3替换pDsU6的SacⅠ和 HindⅢ之间片段得到的表达shRNA-3的重组表达载体，pDsU6-sh-luc为用sh-luc替 换pDsU6的SacⅠ和HindⅢ之间片段得到的表达shRNA-luc的重组表达载体。

2）GFP标记的RNA干扰重组表达载体的获得

载体pDsU6-GFP-sh-1、pDsU6-GFP-sh-2、pDsU6-GFP-sh-3、pDsU6-GFP-sh-luc 的构建方法：分别取上述构建的RNA干扰重组表达载体pDsU6-sh-1、pDsU6-sh-2、 pDsU6-sh-3、pDsU6-sh-luc及表达GFP的重组表达载体pDsU6-GFP进行BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切，消化后的片段经凝胶回收；将上述四种RNA干扰重组表达载体的回收片段 分别与pDsU6-GFP载体片段进行连接，从而获得表达GFP的RNA干扰重组载体 pDsU6-GFP-sh-1、pDsU6-GFP-sh-2、pDsU6-GFP-sh-3、pDsU6-GFP-sh-luc，经测序证 实pDsU6-GFP-sh-1为用sh-CTCF-1替换pDsU6-GFP的BamHⅠ和HindⅢ之间片段得到 的表达GFP和shRNA-1的重组表达载体；pDsU6-GFP-sh-2为用sh-CTCF-2替换 pDsU6-GFP的BamHⅠ和HindⅢ之间片段得到的表达GFP和shRNA-2的重组表达载体； pDsU6-GFP-sh-3为用sh-CTCF-3替换pDsU6-GFP的BamHⅠ和HindⅢ之间片段得到的 表达GFP和shRNA-3的重组表达载体；pDsU6-GFP-sh-luc为用sh-luc替换pDsU6-GFP 的BamHⅠ和HindⅢ之间片段得到的表达GFP和shRNA-luc的重组表达载体。

上述载体pDsU6-GFP的构建方法如下：以pGFP-N1（购自Clontech）为模板，在 引物P5（5’-AAGGATCCATTACCGCCATGCATTAG-3’）和P6 （5’-CCTACGCCTTAAGATACATTG-3’）的引导下PCR扩增GFP基因，扩增产物经BamHⅠ 单酶切，消化片段经凝胶回收；取载体pDsU6进行AflⅡ单酶切，用T4Polymerase  Klenow片段进行末端补平处理，凝胶回收之后线性化片段再用BamHⅠ酶切消化，消 化后片段经凝胶回收；将这两种回收片段连接，获得载体pDsU6-GFP，经测序证实 pDsU6-GFP是用GFP（绿色荧光蛋白）基因替换pDsU6的AflⅡ和BamHⅠ之间片段得 到的表达GFP的重组表达载体。

实施例2、RNAi基因敲除重组载体转染白血病细胞

1、转染用细胞的培养

转染前24h，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基在15ml培养皿、37℃ 和5%CO₂条件下培养B-ALL细胞系NALM-6达到75％～90％时进行转染。

2、转染

将实施例1获得的带有GFP标签的RNA干扰重组表达载体pDsU6-GFP-sh-1、 pDsU6-GFP-sh-2、pDsU6-GFP-sh-3以及载体pDsU6-GFP-sh-luc（RNAi阳性对照，用 于沉默荧光素酶基因）分别转染步骤1培养的细胞，获得含RNA干扰重组表达载体 pDsU6-GFP-sh-1的重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-1、含RNA干扰重组表达载 体pDsU6-GFP-sh-2的重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-2、含RNA干扰重组表达 载体pDsU6-GFP-sh-3的重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3和含载体 pDsU6-GFP-sh-luc的重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc。

上述转染的具体方法如下：

计数步骤1培养的NALM-6细胞密度，取含2×10⁶个细胞的培养液，90g离心5 分钟，弃培养基，采用100μl电转液（Nucleofector Solution,Lonza）重悬细胞； 转移细胞悬液至1.5ml Eppendorf管，加入2μg DNA质粒，指腹轻弹充分混合；将细 胞/DNA混悬液转移至电转杯中，避免气泡，盖上杯盖；将电转杯放置于电转仪的电转 座（Nucleofector Device,Lonza）上，选择电转程序C-005（专适用于NALM-6细胞 系）；取2ml预热的RPMI-1640培养基（10%FBS）与电转杯中的细胞悬液混合，转移到 细胞培养皿中，避免对细胞悬液进行反复抽吸；转染的细胞放置培养箱中，37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养，用于下述实施例的检测和实验。

实施例3、Western Blot检测重组白血病细胞中锌指蛋白CTCF的表达

取实施例2中转染72h后的四种重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-1、 NALM-6/pDsU6-GFP-sh-2、NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3和NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc，分 别提取总蛋白，以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为内参，进行Western blot检测， 检测锌指蛋白CTCF的一抗为CTCF(分子量83KDa)单克隆抗体（购自Millipore），检 测内参GAPDH的一抗为GAPDH（分子量34KDa）单克隆抗体（购自中国上海康城公司）， 结果如图1所示，结果表明：含RNA干扰重组表达载体pDsU6-GFP-sh-1的重组白血病 细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-1、含RNA干扰重组表达载体pDsU6-GFP-sh-2的重组白血 病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-2和含RNA干扰重组表达载体pDsU6-GFP-sh-3的重组白 血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3中，锌指蛋白CTCF表达水平均低于对照含载体 pDsU6-GFP-sh-luc的重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc，其中RNA干扰重组 表达载体pDsU6-GFP-sh-1和RNA干扰重组表达载体pDsU6-GFP-sh-3的干扰效果较好。

上述提取总蛋白的具体方法如下：

90g离心5分钟收集重组白血病细胞，用预冷的PBS洗两遍，加150～300μl RIPA 缓冲液[20mM Tris pH7.5，50mM NaCl，2mM Na₃VO₄,10mM NaF,1mM EDTA,0.1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂(Roche)]，冰上裂解30min，收集细胞。8V电压超声10秒×2 次，间隔40秒；4℃，12000rpm离心30min；吸取上清，利用Brandford法进行蛋白 定量；各取20μg总蛋白进行Western blot检测。

Western blot检测的具体方法如下：

1）电泳及转膜：对待测蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，先在电压80V下电泳10-30 分钟，待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到160V继续电泳约1小时，直至溴酚蓝 到达分离胶的底部。电泳结束后，用电转移法将分离的蛋白样品转移至硝酸纤维素膜 （NC膜），400mA（100V），1小时（或350mA（95V），1.5小时）。

2）封闭膜：用TBS-T溶液洗(Nacl8.0g、20ml1M Tris-Hcl、Tween-202ml，加 蒸馏水950ml，标定PH值至7.6，再定容至1L)NC膜10-15分钟。将NC膜放入含5％ 脱脂奶粉的TBS-T溶液中，室温封闭1小时（或4℃12-24小时）。

3）免疫杂交：

A、一抗孵育：将CTCF单克隆抗体或GAPDH单克隆抗体按1:2000稀释于含5％ 脱脂奶粉的TBS-T溶液中，室温下与NC膜在脱色摇床上一起孵育约1小时（40分钟 至1小时20分钟），用TBS-T溶液50mL洗NC膜10分钟，重复3次。

B、二抗孵育：将结合辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG抗体按1:3000稀释在含5％ 脱脂奶粉的TBS-T溶液中，室温下与NC膜在脱色摇床上一起孵育约45分钟（40分钟 至1小时20分钟），用TBS-T溶液50mL洗NC膜10分钟，重复3次。

4）ECL试剂显色：使用ECL蛋白杂交检测试剂盒(瑞典Amersham公司），参照操 作说明进行NC膜显色反应。

实施例4、重组白血病细胞的凋亡检测

选取RNA干扰效果较好的重组表达载体pDsU6-GFP-sh-1和pDsU6-GFP-sh-3进行 细胞凋亡检测。取实施例2中转染72h后的三种重组白血病细胞 NALM-6/pDsU6-GFP-sh-1、NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3和NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc，分 别用流式细胞仪对细胞凋亡百分比进行统计分析，结果如图2和图3所示。

结果表明：重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-1、NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3 和对照（重组白血病细胞NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc）的细胞总凋亡比例分别为7.5%、 28%和7.4%，说明RNA干扰重组表达载体pDsU6-GFP-sh-3能有效降低/抑制CTCF在细 胞中的表达，NALM-6/pDsU6-GFP-sh-3细胞总体凋亡比例是对照（重组白血病细胞 NALM-6/pDsU6-GFP-sh-luc）的3.8倍。

上述流式细胞仪统计细胞凋亡百分比的具体方法如下：

300g离心5分钟收集重组白血病细胞，用预冷的PBS洗两遍，使用Annexin  V-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（购自美国BD公司，BD Pharmingen556547）标 记细胞。采用流式细胞仪（美国BD公司,FACSAriaⅡ）收集10000个GFP阳性的细 胞，对细胞的凋亡百分比进行统计分析，观察白血病细胞系在凋亡方面的变化特点。

实施例3、4证明，锌指蛋白CTCF是一个抗凋亡因子，在ALL细胞中具有抑制细 胞凋亡的作用，干扰CTCF的表达可促进肿瘤细胞——白血病细胞发生凋亡，并增加白 血病细胞对化疗药物的敏感性。