一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶、对照和显色剂。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品RNA模板进行扩增，加入显色剂观察反应管内的颜色变化来判断扩增与否。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定1型登革热病毒的方法。

背景技术

登革热病毒（Dengue virus，DV）是一种黄病毒类RNA病毒，主要包括1～4型病毒（DV 1～4）。登革热病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播，登革热病毒的感染可以引起登革热（dengue fever，DF），严重的还可导致登革出血热（Dengue hemorrhagic fever，DHF）或登革休克综合征（Dengue shocksyndrome，DSS）等。DV广泛流行于全球的热带和亚热带地区，我国主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等省（自治区）。自1978年广东省佛山市暴发登革热以来，我国南方部分省区该病流行不断，2006年广东省又发生了DV1的流行，寻找一个合适的DV1鉴定方法可以为临床治疗提供很好的基础。

目前登革热病毒的鉴定方法主要为PCR，ELISA、免疫胶体金等方法。登革热检测常用的ELISA、免疫胶体金方法耗时长，通常需要5～7 d血清中才能达到抗体能够检测水平，同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应，出现假阳性率较高，故血清学检测作为登革热病毒检测局限性较大；DV的分离可以很好的鉴定登革热病毒，但同样耗时长，敏感度又很低，也不可以作为早期检测登革热病毒的手段。近10 多年发展起来的DV核酸检测技术，为登革热的早期诊断提供了可能，但PCR以及RT-PCR都需要昂贵的PCR仪作为基础，也在一定程度上限制了PCR方法在鉴定登革热病毒上的发展。

以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、灵敏度低、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速鉴定1型登革热病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于快速1型登革热病毒的特异性引物，及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定1型登革热病毒的方法。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

用于快速鉴定1型登革热病毒的RT-LAMP特异性引物组，其特征在于，包括：

内引物1：5’- CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC-3’（SEQ ID No.1）；

内引物2：5’- CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG -3’（SEQ ID No.2）；

外引物1：5’- TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG -3’（SEQ ID No.3）；

外引物2：5’-CAGACTCAATCCAATCGTAAGA-3’（SEQ ID No.4）。

环引物1：5’- CCAACCATGATGCATAACCTG-3’ （SEQ ID No.5）

环引物2：5’- ATGAGACCAATGTTCGCTGT-3’ （SEQ ID No.6）

一种用于快速鉴定1型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，其含有上述的RT-LAMP特异性引物组。

优选的，所述用于快速鉴定1型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下成分：（1）上述RT-LAMP特异性引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）显色剂；（6）阳性对照和阴性对照。

所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6～8：1：3～4。

所述逆转录酶为AMV逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

所述RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄、5mM 甜菜碱，四者的体积比为6～8：4～5：2～3：8～10。

所述显示剂为SYBR GREENⅠ。

所述阳性对照为含有1型登革热病毒NS1基因片段（SEQ ID NO.7）的质粒，阴性对照为DEPC水。

一种快速鉴定登革热病毒1型的方法，具体包括如下步骤：

（1）提取模板RNA；

（2）环介导等温基因扩增反应：25μl反应体系含有：内引物1、2各7～9pmol/μL，外引物1、2各1～2 pmol/μL，环引物1、2各3～5 pmol/μL，反应液 12～13μL，DNA聚合酶7～9U，待检RNA 1~100ng，逆转录酶1～2U，用灭菌去离子水补齐到25μL，然后加入18～22μL的密封液，将上述反应管于60~65℃反应60~90min；

（3）结果判断：在上述反应管中加入1-2μL显色剂10×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为登革热1型病毒，橙色则为非登革热1型病毒。

优选的，环介导等温基因扩增反应的25μl反应体系含有：内引物1、2各8pmol/μL，外引物1、2各1 pmol/μL，环引物1、2各4 pmol/μL，反应液 12.5μL，DNA聚合酶8U，待检RNA 1~100ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μL。

本发明的有益效果在于：本发明针对1型登革热病毒NS1区域特异性设计了6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性。本发明的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别1型登革热病毒，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。

附图说明

图1为本发明RT-LAMP试剂盒的阴性与阳性对照品的检测结果（－：阴性对照，＋：阳性对照）；

图2为本发明对登革热1型病毒以及对非登革热1型病毒的扩增结果（－：阴性样品，＋：阳性样品，1：非1型登革热病毒样本，2：1型登革热病毒样品）；

图3为实施例3的特异性验证结果（1:DEPC，2:HSV，3:EBV，4:JEV，5:YFV，6:DENV1，7:DENV2，8:DENV3，9:DENV4）；

图4为实施例4的灵敏度实验结果（a：普通PCR扩增结果，b: Real-time PCR扩增结果，c: 本发明RT-LAMP扩增的电泳结果，d:本发明RT-LAMP扩增的Real-time结果， e:本发明RT-LAMP扩增的显色结果：1:DEPC，2～7:含有登革热病毒NS1基因1.0、1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵ 拷贝/μL。）

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 用于快速鉴定1型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒的建立

用于快速鉴定1型登革热病毒的RT-LAMP试剂盒，包括以下成分：（1）特异性引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）显色剂；（6）阳性对照和阴性对照。

（1）特异性引物的设计：

根据1型登革热病毒（GenBank登录号为：EU848545.1）NS1区域的的特异性设计6条特异性引物，序列分别如下：

内引物1：5’- CATCCTGTCTGAAGCATTGGCTGGACAATTGACATGGAATGATC-3’（SEQ ID No.1）；

内引物2： CCTAGCTCTGATGGCCACTTTCTTCTCTAGATGTTAGTCTGCG（SEQ ID No.2）；

外引物1：5’- TGTGTTCCTCCTTCTCATAATG -3’（SEQ ID No.3）

外引物2：5’-CAGACTCAATCCAATCGTAAGA-3’（SEQ ID No.4）

环引物1：5’- CCAACCATGATGCATAACCTG-3’ （SEQ ID No.5）

环引物2：5’- ATGAGACCAATGTTCGCTGT-3’ （SEQ ID No.6）；

（2）逆转录酶为AMV逆转录酶；

（3）DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；

（4）RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄、5mM 甜菜碱，四者的体积比为8：5：3：10。

（5）显示剂为SYBR GREENⅠ。

（6）阳性对照为含有1型登革热病毒NS1基因片段（SEQ ID NO.7）的PET-32a质粒，其制备方法为：以1型登革热病毒（GenBank登录号为：EU848545.1）为模板，用引物对F: AGAGGTGATGAGATCCAGATG（SEQ ID NO.8），R:TGCAAGTCCATCCCCCAGCTCCTCC（SEQ ID NO.9）进行PCR扩增，得到433bp的扩增产物，经测序即为NS1基因片段（SEQ ID NO.7），回收该扩增片段，利用常规方法连接到PET-32a质粒中。

阴性对照为DEPC水。阳性对照和阴性对照的扩增结果见图1.

实施例2 利用实施例1的试剂盒快速鉴定1型登革热病毒

步骤如下：

（1）提取模板RNA：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；

（2）环介导等温基因扩增反应：25μl反应体系含有：内引物1、2各8pmol/μL，外引物1、2各1 pmol/μL，环引物1、2各4 pmol/μL，RT-LAMP反应液 12.5μL，DNA聚合酶8U，待检RNA 1~100ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μL，然后加入20μL的密封液，将上述反应管于63~65℃反应60~90min；

（3）结果判断：在上述反应管中加入1-2μL显色剂1×SYBR GreenⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为登革热1型病毒，橙色则为非登革热1型病毒（如图2）。

实施例3 特异性实验

利用实施例2的方法分别对2种孢疹病毒（HSV、EBV）、乙型脑炎病毒（JEV）、黄热病毒（YFV）、1型登革热病毒（DENV1）、2型登革热病毒（DENV2）、3型登革热病毒（DENV3）、4型登革热病毒（DENV4）进行检测，DEPC水为阴性对照。

检测结果见图3。仅1型登革热病毒管为绿色，其余管为橙色。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地将1型登革热病毒和2、3、4型登革热病毒以及其他非相关病毒区分开来（图3）。

实施例4 常规PCR、Real-time PCR检测方法与本发明检测灵敏度的比较

取构建好的含有1型登革热病毒NS1基因片段（SEQ ID NO.7）的PET-32a质粒，测定其浓度并计算NS1基因的拷贝数，按照10浓度梯度稀释，选取1.0×10⁰～1.0×10⁵拷贝/μL进行实验。分别用本发明的鉴定方法和常规PCR方法以及Real-time PCR方法进行鉴定。

1、本发明的LAMP-PCR检测方法

采用实施例2的方法分别对各个浓度的样品进行检测，实验结果见图4-c、d、e：1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μl的PCR管均为绿色，表示有扩增反应； 1个拷贝以及阴性对照的的PCR管为橙色，表明无扩增反应。LAMP通过显色、电泳、荧光曲线等3种方法显示了实验结果，均出现一致的结果。

2、常规PCR检测

（1）PCR引物：

F: AGAGGTGATGAGATCCAGATG（SEQ ID NO.8）；

R:TGCAAGTCCATCCCCCAGCTCCTCC （SEQ ID NO.9）。 

（2）PCR反应：PCR反应体系为25μL体系，10×PCR Buffer（PCR反应缓冲液，Promega公司）2.5μL，10mM dNTPs （Promega公司）0.5μL，上、下游引物分别为实验室内部保存引物，各1μL，Taq酶（5U/μL ，Promega公司）0.5μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补至25μL。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸7min。PCR产物取10μL与2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压下30min，通过凝胶成像分析仪观察结果，预期目的条带为385bp。常规PCR方法的灵敏度为1.0×10¹、1个拷贝/μl的显示为阴性，即无扩增。实验结果见图4-a。

3、Real-time PCR检测

（1）Real-time PCR引物：

F: AGAGGTGATGAGATCCAGATG（SEQ ID NO.8）；

R:TGCAAGTCCATCCCCCAGCTCCTCC （SEQ ID NO.9）。

（2）Real-time PCR反应：反应体系为10μL体系，2×SYBR Green II buffer 5μl， 上下游引物为实验室内部保存引物，各0.4μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水补至25μL。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸20s，72℃延伸7min。通过荧光曲线判断实验结果。实验结果见图4-b。常Real-time PCR方法的灵敏度为1.0×101、1个拷贝/μl的没有出现扩增峰，即无扩增。

实施例5 本发明对临床登革热病毒1型患者的检验

利用实施例2的方法对多个已经确定为登革热病毒1型患者病人血样进行处理检验，处理多个病人样本，其中只有2个重复管出现了阴性，其余均为阳性，正确率可以达到97%以上。

注：“+”表示检测结果为阳性，即有扩增；“-”表示检测结果为阴性，即无扩增。

以上实施例表明，本发明的方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。

<110>  中山大学

 

<120>  一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法

 

<130> 

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

catcctgtct gaagcattgg ctggacaatt gacatggaat gatc                        44

 

 

<210>  2

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

cctagctctg atggccactt tcttctctag atgttagtct gcg                         43

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

tgtgttcctc cttctcataa tg                                                22

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

cagactcaat ccaatcgtaa ga                                                22

 

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

ccaaccatga tgcataacct g                                                 21

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

atgagaccaa tgttcgctgt                                                   20

 

 

<210>  7

<211>  433

<212>  DNA

<213>  Dengue virus1

<400>  7

agtggatagc ttttcactag gactgctatg catatcaata atgatcgaag aggtgatgag       60

atccagatgg agtagaaaaa tgctgatgac tggaacactg gctgtgttcc tccttctcat      120

aatgggacaa ttgacatgga atgatctgat caggttatgc atcatggttg gagccaatgc      180

ttcagacagg atggggatgg gaacaacgta cctagctctg atggccactt ttaaaatgag      240

accaatgttc gctgtcgggt tattatttcg cagactaaca tctagagaag ttcttcttct      300

tacgattgga ttgagtctgg tggcatctgt ggagctacca aattccttgg aggagctggg      360

ggatggactt gcaatgggca tcatgatttt aaaattactg accgactttc agtcacatca      420

gctgtgggct gcc                                                         433

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

agaggtgatg agatccagat g                                                 21

 

 

<210>  9

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

tgcaagtcca tcccccagct cctcc                                             25