以产甘油假丝酵母特征5.8S序列为整合位点的pURGAP载体构建及其应用

摘要

本发明公开了一种能用同源重组来克隆的产甘油假丝酵母整合载体pURGAP的构建及其应用。所构建的pURGAP载体包含有酵母Candida glycerinogenes的通过构建带有5.8S rDNA序列SEQ NO.2，可整合于酵母Candida glycerinogenes特征5.8S序列SEQ NO.1位点，所构建的pURGAP载体还包含有渗透压启动子P

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有表达系统的整合载体以及由该整合表达载体转化工业酵母细胞-产甘油假丝酵母；涉及蛋白质表达基因工程领域，尤其是利用产甘油假丝酵母作为细胞工厂表达外源基因的研究领域，属于微生物学，基因工程和分子生物学领域。 

背景技术

产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，曾获得国家发明二等奖，能在55％葡萄糖或15％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗，目标产物高产量、高转化率、生产强度大的特点。C.glycerinogenes具有两个显著特性，即耐高渗透压(超高浓醪发酵，节省提取能耗)和葡萄糖代谢途径完备，是一个可基因改造、具有的很好应用前景的潜在节能型模式菌株，对其进行遗传改良和途径工程改造就必须建立高效的遗传转化体系。 

虽然常用的实验室酵母，如酿酒酵母S.cerevisiae的转化方法已经十分成熟，但这些方法用于工业酵母菌株的基因改造不理想，严重阻碍采用基因工程手段对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造从而改进产甘油假丝酵母的性能，其主要原因是该工业酵母菌株的遗传背景复杂多样。因此，这就需要根据工业酵母菌株自身的特点，如细胞壁结构、生理生化特性、遗传背景等，建立起相应的转化体系。 

实现建立起相应的转化体系这一目标首先要获得有效的载体，而构建酵母整合型载体的一项重要工作是获得整合位点。为建立有效的产甘油假丝酵母转化系统，本发明选择产甘油假丝酵母5.8S rDNA特征序列作为同源重组整合位点，构建适合于产甘油假丝酵母转化的整合载体，建立了一套高效、简单的产甘油假丝酵母转化系统。 

发明内容

针对目前未见产甘油假丝酵母5.8S rDNA序列在产甘油假丝酵母表达载体中应用的现状。本发明利用产甘油假丝酵母的特征5.8S rDNA序列SEQ NO1构建产甘油假丝酵母整合表达载体如附图1所示，获得了一种能够显著提高载体转化效率的载体。 

本发明提供了以C.glycerinogenes 5.8S rDNA序列SEQ NO1为整合位点的重组表达载体的构建，构建整合表达载体的具体步骤： 

1.产甘油假丝酵母部分核糖体DNA(ribosome DNA，rDNA)序列的克隆：引物rdna1、 rdna2扩增产甘油假丝酵母特征5.8S rDNA，特征5.8S rDNA的序列见SEQ NO1。 

rdna1：ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGC 

rdna2：ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG；序列见SEQ NO1。 

2.整合载体的构建(pUC18作为基本骨架)如附图2； 

(1)将PCR获得的特征5.8S rDNA经Sac I和Hind III连到pUC18上，得到克隆载体pUC-5.8S rDNA； 

(2)将PCR获得的启动子P_CgGAP利用限制性内切酶Sac II和Nco I酶切后连接pUC-5.8SrDNA，得到载体pUC-5.8S rDNA-P_CgGAP； 

(3)将PCR获得的zeocin抗性基因利用限制性内切酶Sal I和sph I酶切后连接于载体pUC-5.8S rDNA-P_CgGAP，即得到载体pURGAP； 

3.以线性化的同源整合载体转化产甘油假丝酵母，以zeocin抗性平板筛选阳性克隆子，并用PCR检测转化阳性克隆子。 

4.整合效果分析。对确认的阳性转化子菌落进行计数，计算整合效率。与其它同源整合载体相比，以SEQ NO2所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体pURGAP整合效率提高至其他方法的300％。 

5.本发明将构建的整合载体应用于外源基因在产甘油假丝酵母中的表达，表达载体pURGAP可效率高表达外源基因，能够加快高表达重组菌株的获得。 

通过实施本发明具体的技术方案，实现以下有益效果：通过构建含有特征5.8S rDNA序列SEQ NO2的整合载体pURGAP，提高表达载体的整合效率，与其它同源整合载体相比以SEQ NO2所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体pURGAP整合效率提高至其他方法的300％，并实现了外源基因在C.glycerolgenesis成功表达，为进一步改造重要的工业菌株Candida glycerolgenesis提供了一种有效的方法。 

具体实施方案

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但本发明并不限于下述的实施例。 

本发明所使用的菌种：产甘油假丝酵母Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018、E.coliDH5a。 

实施例1：PCR扩增产甘油假丝酵母5.8S rDNA序列 

以引物rdna1、rdna2扩增产甘油假丝酵母5.8S序列： 

rdna1：ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGC 

rdna2：ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG；序列见SEQ NO1。 

实施例2：重组整合表达载体pURGAP的构建 

构建的重组表达载体(pUC18作为基本骨架)参见附图2： 

(1)将PCR获得的特征5.8S rDNA经Sac I和Hind III连到pUC18上，得到克隆载体pUC-5.8S rDNA； 

(2)将PCR获得的启动子P_CgGAP利用限制性内切酶Sac II和Nco I酶切后连接pUC-5.8SrDNA，得到载体pUC-5.8S rDNA-P_CgGAP； 

(3)将PCR获得的zeocin抗性基因利用限制性内切酶Sal I和sph I酶切后连接于载体pUC-5.8S rDNA-P_CgGAP，即得到载体pURGAP； 

实施例3：重组表达载体的转化和筛选 

通过构建的重组表达载体pURGAP重组质粒用热击方法转化E.coli DH5a扩增质粒。提取质粒，以HindIII线性化。采用原生质体转化法转化C.glycerinogenes，以0.7M的NaCl作为渗透压稳定剂，涂布含有zeocin的YEPD抗性再生平板(1M山梨醇为再生稳定剂)。对转化的阳性转化子菌落计数，取三次重复的平均值，pURGAP的转化效率可达到3×10²cell/ng质粒，而同样条件下其它以非SEQ NO2所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体转化效率只能达到1×10²cell/ng质粒，与其它同源整合载体相比以SEQ NO3所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体整合效率提高至其他方法的300％。 

实施例4：诱导外源荧光蛋白在产甘油假丝酵母中表达 

利用荧光基因gfp构建荧光蛋白表达载体pURGAP-gfp，构建过程参见附图3。所构建载体pURGAP-gfp转入宿主Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018，从含150ug/mL zeocin的YEPD从平板上挑取阳性克隆，利用PCR确定阳性转化子，阳性转化子接种于10mL含有150ug/mL zeocin的YEPD液体培养基中。30℃培养20h，离心收集菌体，转接入10mL含25％葡萄糖的YEPD液体培养基中。30℃培养24h，摇床转数200r/min。离心后获得菌体。 

利用Olympus荧光显微镜对所获得的菌体进行荧光分析。可以看到绿色荧光蛋白在宿主Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018的高表达，与其它同源整合载体相比，以SEQ NO2所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体荧光蛋白表达强度增强明显(图4)。