大肠埃希氏菌O157:H7的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种大肠埃希氏菌O157:H7的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2；P1探针的序列为SEQ ID NO：3；P2探针的序列为SEQ IDNO：4。同时本发明还提供一种包含上述引物探针序列的，用于恒温扩增快速检测大肠埃希氏菌O157:H7的试剂盒，以及应用方法。本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计引物和探针，从而保证检测方法的特异性。且具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可。结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。

说明书

技术领域

本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种利用切刻内切酶恒温扩 增(NEMA)技术进行菌样的快速检测的方试剂盒及其应用。

背景技术

1982年，由于大肠埃希氏菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)污染的 汉堡，美国爆发了一次严重的出血性腹泻，自此，大肠埃希氏菌O157:H7被确认 为致病菌。大肠埃希氏菌O157:H7是全球重要的食源性病原菌，感染患者和牛、羊、 猪等主要宿主为主要传染源。大肠埃希氏菌O157:H7是大肠杆菌的一个亚型，根 据血清型分类法，被美国科学家定为O抗原家族中的第157位成员而得名。大肠埃 希氏菌O157:H7轻则引起发烧、腹痛、反胃，重则出现出血性腹泻、水肿等症状， 甚至因肾功能衰竭和多脏器受损而死亡。1996年，日本爆发了严重的由大肠埃希 氏菌O157:H7引起的疫情，引起全世界的关注。近年来，大肠埃希氏菌O157:H7 感染在亚洲、欧洲、非洲、南美洲、大洋洲时有发生。我国一些地区也曾有疫情 发生。目前，大肠埃希氏菌O157:H7已成为世界各国进出口肉禽类产品检测的主 要病原菌之一。因此，需要建立一种有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠埃希氏菌O157:H7的切刻内切酶核酸恒温扩增 快速检测试剂盒及其检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科 学的依据和指导作用。

本发明的主要原理如下：

(1)设计一对5′端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC 标记的探针；

(2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq Platinum DNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列 引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；

(3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形 成切口，暴露其3′端；

(4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3′端为起点， 以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下 一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；

(5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列；

(6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测。

核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置 在操作台上，取杂交产物10μL加入检测板的样品孔中，再加入100μL缓冲液进 行层析，10min左右判读结果。

通用型核酸扩增物快速检测板的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控 区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物； 仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中为检出目标物；质控区C 和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。

本发明的一个方面涉及大肠埃希氏菌O157:H7的切刻内切酶核酸恒温扩增快 速检测的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1：

5-AATAGAATAGTTAGCTCTTCGTCTGGACTCAACGTGGATTT-3

反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-CTAACATAGCTAAGCTCTTCGCAACCGTTCCATTACTTACA-3

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

P1探针的序列为SEQ ID NO：3：

P1：5-TGGACTCAACGTGGATTTCATCAAAA-3   5端标记生物素；

P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-TATGCAACTACTGTAAGTAATGGAACGG-3  3端标记FITC。

本发明的另一个方面涉及一种大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒，包括如 下的组分：

(1)模板预处理反应液：

其中包括10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，0.1～ 1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase 2.5U；

所述的10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液成分为：200mM Tris-HCl pH8.8， 100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgCl₂；

(2)NEMA恒温扩增反应液：

包括10×NEBuffer 3反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，5％～30％DMSO， 0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物和100μg/mL牛血清蛋白 (BSA)；

其中所述的10×NEBuffer 3反应缓冲液成分为：100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L dithiothreitol pH 7.9；

(3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

(4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

(5)5′端标记生物素探针P1和3′端标记FITC的探针P2各10μmol/L

(6)通用型核酸扩增物快速检测板。型号：3号。

上述试剂盒应用于检测食品中的大肠埃希氏菌O157:H7，其使用方法，依次 包括下列步骤(1)-(4)：

(1)待检样品或细菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内， 浓度在10～100ng/μL范围内；

(2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃ 水浴7min后迅速放入低于所检菌引物Tm值温度2℃的水浴中50s；然后94℃ 水浴20s和低于所检菌引物Tm值温度2℃水浴50s，此过程反复进行5个以上 循环；产物用于NEMA模板；

(3)NEMA恒温扩增反应：

在装有46μL NEMA扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA， 1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入低于所检菌引 物Tm值温度2℃的水浴中60min。反应结束后取出；

(4)产物检测：

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷 却至恒温，用通用型核酸扩增产物快速检测板检测产物。检测线T和质控线C均 显示红色，说明待检样品为阳性。

本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计5′端带切刻内切酶识别序 列的引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的切刻内切酶核酸恒温扩增 (NEMA)技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要 昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用 通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用 于食品检测机构。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于 此，其中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件运行。

实施例1：对大肠埃希氏菌O157:H7标准菌株的检测

按下列配方制作大肠埃希氏菌O157:H7的切刻内切酶核酸恒温扩增试剂盒：

1)模板预处理反应液：

每23μL含有2.5μL 10×Taq Platinum buffer II，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，1.0μL 2.5U/μL Taq Platinum DNA Ploymerase和16.5μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-AATAGAATAGTTAGCTCTTCGTCTGGACTCAACGTGGATTT-3

反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-CTAACATAGCTAAGCTCTTCGCAACCGTTCCATTACTTACA-3

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

2)NEMA恒温扩增反应液：

每46μL含有5μL 10×NEBuffer 3，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L 正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，0.5μL 10mg/ml BSA，4μL DMSO和33.5 μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-AATAGAATAGTTAGCTCTTCGTCTGGACTCAACGTGGATTT-3

反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-CTAACATAGCTAAGCTCTTCGCAACCGTTCCATTACTTACA-3

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

5)探针P1和P2：10μmol/L；

其中所述的探针P1的序列为SEQ ID NO：3

P1：5-TGGACTCAACGTGGATTTCATCAAAA-3    5端标记生物素；

P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-TATGCAACTACTGTAAGTAATGGAACGG-3  3端标记FITC。

6)核酸薄层层析检测板。型号：3号；

按照以下(1)-(4)程序进行检测：

(1)样品大肠埃希氏菌O157:H7标准菌株ATCC 35150DNA的提取：

将大肠埃希氏菌O157:H7ATCC 35150增菌培养后，提取待检样品核酸，其中 提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内。

(2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃ 水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s 过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。

(3)进行NEMA恒温扩增反应：

将装有46μL NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板 DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的 水浴中60min。反应结束后取出；

(4)产物检测：

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷 却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。在质控区C和检测区T均 出现红色条带，说明待检样品为大肠埃希氏菌O157:H7，并证明本发明的引物和 探针在进行检测的时候不会产生假阴性。

实施例2：对大肠埃希氏菌ATCC 25922的检测

按下列配方制作大肠埃希氏菌O157:H7的切刻内切酶核酸恒温扩增试剂盒：

1)模板预处理反应液：

每23μL含有2.5μL 10×Taq Platinum buffer II、1.0μL 2.5mmol/L Dntp，1.0μL 10 μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，1.0μL 2.5U/μL Taq Platinum DNA Ploymerase和16.5μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-AATAGAATAGTTAGCTCTTCGTCTGGACTCAACGTGGATTT-3

反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-CTAACATAGCTAAGCTCTTCGCAACCGTTCCATTACTTACA-3

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

2)NEMA恒温扩增反应液：

每46μL含有5μL 10×NEBuffer 3，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L 正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，0.5μL 10mg/ml BSA、4μL DMSO和33.5 μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

5-AATAGAATAGTTAGCTCTTCGTCTGGACTCAACGTGGATTT-3

反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-CTAACATAGCTAAGCTCTTCGCAACCGTTCCATTACTTACA-3

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

5)探针P1和P2：10μmol/L；

其中所述的探针P1的序列为SEQ ID NO：3

P1：5-TGGACTCAACGTGGATTTCATCAAAA-3    5端标记生物素；

P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-TATGCAACTACTGTAAGTAATGGAACGG-3  3端标记FITC。

6)核酸薄层层析检测板。型号：3号；

按照以下(1)-(4)程序进行检测：

(1)待检样品(大肠埃希氏菌ATCC 25922)DNA的提取：

提取待检样品大肠埃希氏菌ATCC 25922核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内。

(2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃ 水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s 过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。

(3)进行NEMA恒温扩增反应：

将装有46μL NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板 DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的 水浴中60min。反应结束后取出；

(4)产物检测：

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷 却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。质控区C显示红色条带， 检测区T无红色条带出现，说明待检样品不是大肠埃希氏菌O157:H7。这个结果 也证实了本发明的引物和检测试剂盒在应用的时候不会产生假阳性。

实施例3：对疑似感染大肠埃希氏菌O157:H7食品样品的检测

将食品样品按照实施例1描述的方法进行DNA的提取和扩增检测，用通用型 核酸扩增物快速检测板检测产物。结果质控区C显示红色条带，检测区T也有红 色条带出现，说明待检样品受到了大肠埃希氏菌O157:H7的感染。

本发明的引物、探针和试剂盒还可以对其它的样品进行大肠埃希氏菌O157: H7的检测。