检测红脂大小蠹的方法及检测试剂盒

摘要

本发明提供了检测红脂大小蠹的方法及检测试剂盒，该检测方法为巢氏PCR，所用的第1对引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~2所示，第2对引物序列如SEQ ID NO.3~4所示。本发明还提供了检测红脂大小蠹的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确、特异性强，简便快速的优点，能够将红脂大小蠹与四种相近的小蠹（脐腹小蠹，圆穴材小蠹，坡面材小蠹和横坑切稍小蠹）区分开，检测灵敏度为40pg，具有良好的检测红脂大小蠹的能力。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测红脂大小蠹 的靶基因以及检测该基因的引物，本发明还涉及利用该引物进行红 脂大小蠹检测的巢氏PCR方法及试剂盒。

背景技术

红脂大小蠹是原产于北美针叶林的钻蛀性害虫，尽管其在当地 分布广泛，但对植物未造成严重危害，因此被认为是次生害虫。然 而，近年来它已成为入侵我国的重大外来入侵林业害虫，该虫为蛀 干、蛀根毁灭性害虫，入侵后危害特别严重。上世纪随木材贸易进 入我国以后，1998年在山西首次发现，随后迅速爆发蔓延，目前已 扩展到河南、河北、陕西等省。2000年山西省发生面积达25万hm2， 其中成灾12．9万hm2，涉及山西省8个地市的54个县(区)，造成 351．6万株20年以上油松枯死；1999年秋，河北、河南两省也相 继发现大面积灾情。至2000年初，3省共发生灾情52万hm2，油 松死亡600多万株；2001年在陕西延安等地又发现该虫危害，呈现 严重蔓延之势。在国家林业局发布的19种危险性外来有害生物名录 上，红脂大小蠹高居榜首，是近年来入侵我国的重大外来有害生物 之一，严重危害被入侵地区的生态环境和野生动植物的安全，造成 了巨大的经济损失。国家林业局已将红脂大小蠹的治理工作作为应 急项目纳入国家级林业有害生物工程治理项目。

尽管红脂大小蠹对我国松树和其他树种造成巨大危害，但是依 然无有效和环保的方法来防止和根除红脂大小蠹。植物检疫为防止 健康树种感染提供了最有效的方法。为了成功将红脂大小蠹和其他 小蠹区别开，已有许多形态学研究，这些研究大多费时、费力且需 要专业的形态学知识。而且，处于不同生活史和来自不同国家的小 蠹可能会表现出不同的形态特征。近些年，越来越多的研究已证明 分子生物学手段能够为鉴定害虫提供有力依据。

基于PCR的技术已广泛用于病原微生物、植物线虫和某些害虫 的鉴定中，然而传统一步PCR法因待鉴定物的低数量或基因组DNA 低浓度可能导致误鉴定从而引起病原感染或害虫入侵。与传统PCR 相比，巢式PCR包括两对引物，具备以下优势：1.模板和引物在两 轮PCR中的改变大大降低了非特异性扩增的概率；2.一步PCR中的 平台效应克服了，因此大大提高了扩增效率和第二步PCR中的灵敏 度；3.内部PCR中的模板是外部PCR的产物，表明二轮PCR的成 功扩增是对一轮PCR对应基因序列完整与否的验证。

核酸分子标记基因种类很多，有线粒体DNA，核糖体DNA， 微卫星DNA和核蛋白编码基因等，它们均被广泛应用于昆虫的分类 鉴定和系统发育研究中。线粒体DNA严格母性遗传，属于细胞器基 因组，缺乏细胞核基因组中的保护机制，因而变异较为明显，能够 反应较短时间内的进化事件，因而被广泛应用于进出境检验检疫害 虫的鉴别。线粒体DNA上的细胞色素氧化酶I基因（COI）因为高 度保守，结构稳定，无内含子经常被用于物种分类、鉴定和亲缘关 系的研究。本发明以线粒体的COI基因为靶基因设计红脂大小蠹的 特异性引物，以达到对其快速检测的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测红脂大小蠹的引物组合。

本发明的另一目的在于提供检测红脂大小蠹的方法和试剂盒。

基于以上目的，本发明对红脂大小蠹的COI基因与NCBI上公布的 其他昆虫的核苷酸序列进行反复比对和筛选，发现红脂大小蠹种内 COI基因同源性达99%，而与其他昆虫序列差异大，因此该区段可以 很好的区分红脂大小蠹与其他种属昆虫。

本发明提供了一种用于检测红脂大小蠹（Dendroctonus valens  LeConte）引物组合，其能够特异地扩增COI基因或其特异性片段。

本发明提供的引物组合第1对引物为通用引物，其核苷酸序列 为：LOC1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’,（SEQ ID  NO.1）

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ （SEQ ID NO.2）如所示；

第2对引物为检测红脂大小蠹的特异性引物，其核苷酸序列为：

F：5’-GAAGGGTCAAAGAAAGTA-3’，（SEQ ID NO.3）

R：5’-GTCAGGGATAGTAGGAAC-3’（SEQ ID NO.4）所示。

本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒。

本发明提供了含有上述引物组合的检测试剂。

本发明还提供了一种检测红脂大小蠹的方法，包括如下步骤：

（1）提取昆虫基因组DNA；

（2）以基因组DNA为模板，使用通用引物进行第一轮PCR， 扩增目的条带为709bp；所述通用引物序列如SEQ ID NO.1~2所述；

（3）以第一轮PCR产物按1:50~100稀释后的产物为模板，使 用特异性引物进行第二轮PCR扩增目的条带为594bp，则结果为阳 性；所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所述。

第一步PCR中，其25μL总工作体系为：

第一步PCR反应条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变 性30s，53.7℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

第二步PCR中，其25μL总工作体系为：

第二步PCR反应条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变 性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

本发明提供了上述检测红脂大小蠹的方法在植物保护中的应用。

本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确、灵敏度高、特异 性强，简便快速的优点，具有良好的检测红脂大小蠹的能力。本发 明巢式PCR方法与传统的一步法比较，该方法包含两步PCR，更加 稳定可靠，且操作简单，不需测序，结果简单直观。小蠹体小，体 长约1~9mm,gDNA的低浓度是其鉴定的主要限制因子。巢式PCR 通过在一轮PCR中对目标DNA的积累从而保证二轮PCR的高灵敏 性，从而解决了gDNA低浓度的问题。本发明的巢式PCR可以检测 到低至40pg的红脂大小蠹质粒DNA，比传统PCR灵敏度高出10³。

大量研究得出一致结论：PCR反应的灵敏度和重复性主要由样 品DNA的质量决定。复杂的前处理和DNA提取过程中操作时间过 长都会影响DNA的纯度和浓度，本实验通过将目标DNA克隆到T 载体，从而解决了浓度和纯度的问题，保证了红脂大小蠹的稳定、 准确鉴定。本发明可视为入侵害虫鉴定工作中的一项重大突破，它 的应用一定会推动基于PCR技术在植物检疫工作中应用。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳对五种小蠹PCR扩增产物的检测图，其 中图1a为第一轮PCR产物电泳图；图1b为第二轮PCR产物电泳图； M：DL2000DNA marker(2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道： 1-红脂大小蠹，2-脐腹小蠹，3-圆穴材小蠹，4-坡面材小蠹，5-横坑 切稍小蠹，6-阴性对照。

图2为巢式PCR灵敏度检测图，其中图2a:引物对F/R在传统PCR中 的检测图；图2b:为引物对F/R在巢式PCR中的检测图；M：DL2000 DNA marker(2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道1-7分别代表： 400ng,40ng,4ng,400pg,40pg,4pg和400fg的红脂大小蠹质粒 DNA，泳道8-阴性对照。

图3为特异性引物实时定量PCR产物琼脂糖电泳检测图；泳道 1-6分别代表：40ng,4ng,400pg,40pg,4pg和400fg的红脂大小蠹 质粒DNA;泳道7-10-代表40ng脐腹小蠹，圆穴材小蠹，坡面材小 蠹和坑切稍小蠹质粒;泳道11为阴性对照。

图4为实时定量PCR反应的质粒浓度与Ct值之间的标准曲线。 点1-6分别代表40ng,4ng,400pg,40pg,4pg和400fg的质粒DNA.

图5为红脂大小蠹实时定量PCR的熔解曲线。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。

EZgene^TMInsect gDNAKit（GD2413-02）试剂盒，购自BIOMIGA 公司；TaKaRa TaqTM（Code：DR001B）94kDa耐热性DNA聚合 酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；TaKaRa Agarose Gel DNA  Purification Kit Ver.2.0试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司； PMD19-Vector，购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α感受态 细胞，购自TIANGEN公司；6×loading buffer(TaKaRa)，购自宝 生物工程（大连）有限公司；Taq2×Master Mix(New England  BioLabs)；引物由赛百盛基因技术有限公司合成；50×TAE（Tris-乙 酸）：24.2g Tris碱，5.71g冰乙酸，10mL0.5M EDTA(pH8.0),加 去离子水定容至100mL,工作液为1×TAE。溶液Ⅰ：200mmol/L葡 萄糖25ml，1mol/L Tris-Cl(pH8.0)2.5ml，250mmol/L EDTA(pH8.0) 4ml；加去离子水定容至100ml，121℃高压灭菌15min，4℃贮存。 溶液Ⅱ：10mol/LNaOH200μl，10%SDS(W/V)l ml现配现用，临用前 加去离子水定容至10ml。溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸 11.5ml，加去离子水定容至100ml，4℃贮存。TE Buffer(pH8.0)： Tris-碱1.21g，EDTA-Na20.37g，加去离子水800ml，用盐酸调pH 值至8.0，用去离子水定容至1L，高压灭菌。

分光光度计SpectrophotometerND1000V3.5.2，基因有限公司， 中国香港；紫外凝胶成像仪，购自基因有限公司，中国香港；梯度 PCR仪，购自基因有限公司，中国香港；ABI7500Real-Time PCR  System(Applied Biosystems)。测序由英俊测序公司北京分公司完成

实施例1红脂大小蠹COI基因DNA序列的确定

本发明对红脂大小蠹的COI基因与NCBI上公布的其他昆虫的核 苷酸序列进行反复比对和筛选，发现红脂大小蠹的种内COI基因同源 性达99%，而与其他昆虫序列差异大，可以用于区分红脂大小蠹与其 他种的昆虫。

实施例2昆虫基因组DNA的提取

本实验所涉及到的昆虫为脐腹小蠹（Scolytus schevyrewi Semenov），圆穴材小蠹（Xyleborus artecomans Schedl），坡面材小蠹 （Xyleborus interjectus Blandford），横坑切稍小蠹（Blastophagus  minor Hartig），红脂大小蠹（Dendroctonus valens LeConte），由北 京市出入境检验检疫局提供。昆虫基因组DNA提取都采用 BIOMIGA公司的EZgene^TM Insect gDNA Kit（GD2413-02）试剂盒。

具体操作步骤：

（1）将在纯酒精中浸泡的昆虫标本用超声波仪器清洗干净晾干 后，成虫去头和鞘翅，幼虫取其腹部组织。取＜50mg的组织于研钵 中充分研磨，置于1.5ml的离心管中。

（2）向离心管中加入350ul的Buffer ITL与25ul的蛋白酶K （25mg/ml），充分混匀后置于60℃恒温水浴锅两个小时直到组织完 全被消化。

（3）在离心管中加入350μl的氯仿：异戊醇（24:1）缓慢混匀， 在室温，10,000转速下离心2min，并小心的将上清液转移到新的干 净的1.5ml离心管中。

（4）加入1倍体积的的BufferBL与5μl的RNaseA,缓慢混匀， 70℃水浴半小时。

（5）加入1倍体积的无水乙醇（室温），缓慢混匀。

（6）将前一步的溶液和絮状沉淀700μ加入吸附柱内（吸附柱 安放于收集管内），10,000xg室温下离心1min，移除废液，吸附柱 重新置于收集管内。如此时仍有剩余混合液则重复第6步。

（7）将吸附柱重新置于新的收集管内，加入500μl的BufferKB， 10,000xg室温下离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。

（8）加入600μl的DNAWashBuffer，10,000xg离心30s，移除 废液，吸附柱重新置于收集管内。

（9）重复第8步，将吸附柱置于新的收集管内，在吸附柱的盖 子打开的条件下，13,000sg室温离心2min，后置于室温下数分钟， 使酒精充分挥发。

（10）将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部位 悬空加入30μl的Elution Buffer，Elution Buffer在60℃-70℃条件 下预热，室温放置2分钟，在13,000xg下离心2min。

（11）重复第10步，以便提高产量。

实施例3检测红脂大小蠹的巢氏PCR的引物的设计

1、通用引物的设计

根据已发表的昆虫COI序列合成一对扩增天牛COI序列的通用 引物LCO1490和引物HCO2198，引物序列如：

LOC1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’（SEQ ID NO.1），

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ （SEQ ID NO.2）。PCR扩增反应的总体积为25μl，各反应体系加入 量为：

混匀后放入PCR仪中进行扩增，扩增的程序为：94℃预变性 5min，94℃变性30s，53.7℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环； 最后72℃延伸7min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以 排除系统误差。取5μl产物与1μl6×loading buffer混匀后上样到 1.5%TAE琼脂糖凝胶上。经110V电泳30min后，将胶块浸泡于EB 染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。

2、COI序列的克隆

将PCR产物切胶回收纯化后进行一下步骤：将回收的COI片段 与PMD19-Vector载体的连接。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α 感受态细胞。重组质粒的PCR鉴定

3、多重序列比对及引物设计

根据重组质粒的PCR检测结果，选取菌液进行测序，测序工作 由生工生物测序部（北京）公司完成，得到COI序列。在保证测序 结果正确的基础上，对序列进行比对，除去序列两端冗余，保留共 有序列进行同源比对。将得到的红脂大小蠹的COI序列导入Primer  Premier5.0引物设计软件，设计红脂大小蠹的特异性引物。

检测红脂大小蠹的特异性引物的设计，该特异性引物的核苷酸 序列如下：

F：5’-GAAGGGTCAAAGAAAGTA-3’（SEQ ID NO.3），

R：5’-GTCAGGGATAGTAGGAAC-3’（SEQ ID NO.4）。

上述特异性引物扩增的片段总长为594bp，经测序鉴定并NCBI 比对确认该序列属于红脂大小蠹COI基因。

4、本发明经反复筛选和验证，得到用于检测红脂大小蠹的巢氏PCR 引物组合。

本发明得到的应用于巢氏PCR的第一对引物(产物大小为709bp) 为：

LOC1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’，

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

第二对引物(产物大小为594bp)为：

F：5’-GAAGGGTCAAAGAAAGTA-3’，

R：5’-GTCAGGGATAGTAGGAAC-3’。

实施例4检测红脂大小蠹的巢氏PCR检测方法的建立

1、检测红脂大小蠹的荧光定量PCR检测方法包括如下步骤：（1） 提取昆虫基因组DNA；（2）以基因组DNA为模板，使用实施例3 的通用引物LCO1490和引物HCO2198进行第一轮PCR，扩增目的 条带为709bp；（3）以第一轮PCR产物按1:50稀释后的产物为模板， 使用实施例3记载的特异性引物进行第二轮PCR扩增目的条带为 594bp，则结果为阳性。

第一步PCR中，其25μL总工作体系为：

第一步PCR反应条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变 性30s，53.7℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

第二步PCR中，其25μL总工作体系为：

第二步PCR反应条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变 性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

2、标准品的制备

将红脂大小蠹阳性质粒进行浓度和纯度测定后，按照梯度稀释 原理（1:10）依次稀释作为标准品，储存于4℃备用。

3、以实施例2提取的5种昆虫基因组DNA为模板，同时设阴性 对照，按照本实施例建立的巢氏PCR方法进行检测，结果显示，第 一轮PCR一致扩增出709bp的产物，巢式PCR中，只有红脂大小蠹成 功扩增，产物为594bp，其他四种小蠹和阴性对照都不能得以扩增。 见图1a，图1b。

实施例5红脂大小蠹荧光定量PCR检测方法的特性评价

1、灵敏度评价（最低检测限）

为比较和评价巢式PCR引物的灵敏度，模板浓度梯度的实验在 传统PCR和巢式PCR中同时开展。结果显示（见图2a，图2b）：传 统PCR的检测限最小为40ng的质粒DNA，而巢式PCR的检测范围 为400ng~40pg。说明巢式PCR至少比传统PCR灵敏10³倍。

2、特异性评价

由于实施荧光定量PCR方法比巢氏PCR方法灵敏度更高，考虑到 巢氏PCR方法对于模板量小的阳性物质检测结果呈现假阴性，因此本 发明利用实时定量PCR方法来验证本发明的巢氏PCR引物的特异性。 利用本发明的特异性引物，即实施例3记载的第二对引物进行real-time PCR，结果能检测的最小浓度为4pg的质粒DNA（见图3），而其他四种 小蠹40ng质粒DNA均未得到扩增。标准曲线结果显示模板浓度和Ct值 之间呈现很好的相关性（r²=0.991），反应扩增效率很高（Eff％=99.7%, slope=-3.328）（见图4）。熔解曲线是整个反应过程的质量控制途径， 红脂大小蠹的熔解温度为82.21℃，整个反应过程中没有次峰和非正常 扩增，说明实验过程中无污染，引物二聚体和非特异性扩增（见图5）。

3、重复性评价

3.1批内可重复性评价每组实验3个平行实验，结果一致，证明实 验样品浓度梯度稀释可靠，批内重复性强。

3.2批间可重复性评价该实验结果通过至少三次实验验证，结果稳 定，证明实验操作无误，批间重复性强。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明 作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。