诱导渐渗系水稻RZ1和RZ2中的Homebox基因发生甲基化升高的方法

摘要

本发明公开了一种诱导渐渗系水稻RZ1和RZ2中的Homebox基因发生甲基化升高的方法。本发明提供的诱导渐渗系水稻RZ1中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ1。本发明提供的诱导渐渗系水稻RZ2中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ2。本发明为进一步研究重金属污染环境中植物的表观遗传变异与植物的抗逆性以及基因组进化的相互关系做铺垫，为培育抗逆重金属水稻新品种提供一定的参考。

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导渐渗系水稻RZ1和RZ2中的Homebox基因发生甲基化升高的 方法。

背景技术

在真核生物的DNA中，5-甲基胞嘧啶（5-m^C）是唯一存在的化学性修饰碱基。DNA 甲基化(DNA methylation)是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMTs）催 化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应。一定的 DNA甲基化类型在减数分裂或有丝分裂之后能被子细胞遗传，这在生物表观遗传中有着 极其重要的作用，被认为是表观遗传的主要形式。

CG核苷酸是最主要的甲基化位点，在哺乳动物中5-甲基胞嘧啶约占胞嘧啶总量 的2-7％。DNA的甲基化并不改变基因的碱基序列而是通过影响基因的表达而影响其功 能，一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。研究表明，基因组印记、X染色体的 失活和许多肿瘤相关基因的失活都与基因启动子区CG岛的甲基化有关。

植物中，大约有20%-30%的核基因组DNA胞嘧啶处于甲基化状态，对称的CG和CA（T） G被证明甲基化频率最高，基因组内也有CCG中外侧胞嘧啶甲基化，但频率低于以上两 种模式。大多数DNA甲基化发生于富含转座子的异染色质区，但对全基因组范围内甲基 化图谱的研究表明，有20%-33%的重要基因区也发生甲基化。

在植物中，DNA甲基化有助于转录沉默转座因子或外源DNA，维持非同源重组基因 组的稳定和控制一些基因的转录，在转座子的活跃，防御外源DNA、甚至在特异基因表 达模式上起关键作用。当基因处于表达状态时，甲基化水平往往很低，但随着生长发 育的进行需要将该基因关闭，则会在该基因的启动子或编码区发生重新甲基化，基因 转录受到抑制，基因失活，最终导致表达的沉默。

基因表达调控过程是一系列核酸-蛋白质相互作用的结果,转录过程中DNA-蛋白 质的相互作用更是密不可分。

基于以上事实,DNA甲基化调控基因表达的分子机理为：DNA的甲基化或去甲基化 会改变DNA分子构象，从而导致某些重要基团的隐蔽或暴露，使其削弱或增强了DNA与 蛋白质因子(如阻抑蛋白、转录必需酶等)的结合,最终影响到某些基因的表达，使得 有些基因表达受到抑制甚至丧失其功能，有些基因表达则被激活。

限制性内切酶HpaII和限制性内切酶MspI是一对同裂酶，均可识别CCGG位点，但对 甲基化的敏感程度不同。限制性内切酶HpaII对内外侧全甲基化敏感，对内外侧半甲基 化不敏感，即可以酶切CCGG和内外侧半甲基化的CCGG，但不能酶切内外侧全甲基化的 CCGG。限制性内切酶MspI对外侧全甲基化敏感，对外侧半甲基化敏感，即可以酶切未 甲基化的CCGG，不能酶切外侧全甲基化的CCGG和外侧半甲基化的CCGG。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导渐渗系水稻RZ1和RZ2中的Homebox基因发生甲基 化升高的方法。

本发明提供了一种诱导渐渗系水稻RZ1中的Homebox基因发生甲基化水平升高的 方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ1。

本发明还提供了一种诱导渐渗系水稻RZ2中的Homebox基因发生甲基化水平升高 的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ2。

以上任一所述Homebox基因可为编码序列表的序列1所示的Homebox蛋白的基因。

以上任一所述Homebox基因具体可为如下（1）或（2）：

（1）编码区如序列表的序列2自5’末端第110至661位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表的序列2所示的DNA分子。

以上任一所述的方法中，所述重金属可为镉或铬。

以上任一所述的方法中，所述含有重金属离子的溶液中重金属离子的浓度为 0.05-1.0mmol/L，具体可为0.05mmol/L或1.0mmol/L。

以上任一所述的方法中，所述含有重金属离子的溶液具体可为含有重金属离子的 水稻营养液。

所述含有重金属离子的溶液具体可为在水稻营养液中加入CdCl₂或CrCl₃得到的溶 液。

所述水稻营养液的pH具体可为5.3，溶剂为水，含有如下溶质：1.44mM NH₄NO₃、 0.32mM NaH₂PO₄、0.6mM K₂SO₄、1.0mM CaCl₂、1.6mM MgSO₄、0.072mM Fe-EDTA、0.2mM Na₂SiO₃、 9.1μM MnCl₂、0.154μM ZnSO₄、0.156μM CuSO₄、18.5μM H₃BO₃和0.526μM H₂MoO₄。

以上任一所述的方法中，所述渐渗系水稻RZ1为一叶一心期的渐渗系水稻RZ1。

以上任一所述的方法中，所述渐渗系水稻RZ2为一叶一心期的渐渗系水稻RZ2。

以上任一所述的方法中，所述处理的时间可为7天。所述处理的方法具体可为： 在所述含有重金属离子的溶液中培养所述渐渗系水稻。所述处理过程中，每天更换新 的所述含有重金属离子的溶液。

所述甲基化水平升高具体可为CCGG位点外侧胞嘧啶半甲基化水平升高。

本发明还保护以上任一所述方法在水稻育种中的应用。

目前有关重金属污染对作物伤害的研究多集中于研究重金属胁迫下对作物的外在 表型、内部结构、酶活性差异及氧化胁迫过程等生理、生化后果，对于重金属处理后 水稻发生DNA甲基化变异的研究极少，而具体涉及到水稻渐渗系在重金属胁迫下所发 生的DNA甲基化变异的研究还未见，本发明是世界首例。本发明侧重于单一重金属镉 和铬对渐渗系水稻RZ1和RZ2的DNA甲基化的影响，采用Southern杂交的方法对水 稻渐渗系在上述重金属胁迫下Homebox基因的甲基化情况进行分析。对于在重金属污 染环境中的植物抗性和基因组进化等关系的研究作出了基础性工作。

附图说明

图1为Homebox基因的Southern杂交图谱.

图2为Elongation factor基因Southern杂交图谱.

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。

提及渐渗系水稻RZ1（introgression line RZ1）、渐渗系水稻RZ2（introgression  line RZ2）和渐渗系水稻RZ35（introgression line RZ35）的文献如下：Extent and  pattern of DNA methylation alteration in rice lines derived from introgressive  hybridization of rice and Zizania latifolia Griseb.Dong et al.Theor Appl  Genet(2006)113:196–205。渐渗系水稻RZ1、渐渗系水稻RZ2和渐渗系水稻RZ35是通 过“复态授粉法”得到的，具体过程如下：在松前开花期，早晨四点将其去雄后用育 种袋将花序包好；第二天早上用菰的花粉给去雄后的松前授粉；40-50个小时后，用松 前的花粉进行第二次授粉；通过这种方法得到一株具有菰的特征的F1代杂种植株，细 胞学观察，该植株的染色体数目与母本水稻完全相同；该F1代杂种保持严格自交，最 后得到能够稳定遗传的渐渗系。

实施例1、通过重金属离子处理促进渐渗系水稻RZ1和渐渗系水稻RZ2中Homebox基 因的甲基化升高

一、重金属离子处理

分别将渐渗系水稻RZ1、渐渗系水稻RZ2和渐渗系水稻RZ35的种子进行如下处理：

1、选择饱满、色泽好的水稻种子，用蒸馏水清洗后放入铺有消毒纱布的培养皿， 28℃黑暗培养2天（培养过程中用蒸馏水保持纱布湿润），种子发芽。

2、将装有发芽的种子的培养皿转移到26℃光照培养箱中（每天光照12小时、黑暗 12小时；培养过程中用蒸馏水保持纱布湿润），当幼苗叶长到培养皿盖的时候将培养 皿盖打开，直至幼苗长至一叶一心时（大约培养1周后达到一叶一心）。

3、分组处理：

第一组（Cd-L）：将步骤2得到的幼苗在含有0.05mmol/L CdCl₂的水稻营养液中培 养7天，每天更换新鲜的含有0.05mmol/L CdCl₂的水稻营养液；

第二组（Cd-H）：将步骤2得到的幼苗在含有1.0mmol/L CdCl₂的水稻营养液中培养 7天，每天更换新鲜的含有1.0mmol/L CdCl₂的水稻营养液；

第三组（Cr-L）：将步骤2得到的幼苗在含有0.05mmol/L CrCl₃的水稻营养液中培 养7天，每天更换新鲜的含有0.05mmol/L CrCl₃的水稻营养液；

第四组（Cr-H）：将步骤2得到的幼苗在含有1.0mmol/L CrCl₃的水稻营养液中培养 7天，每天更换新鲜的含有1.0mmol/L CrCl₃的水稻营养液；

第五组(Mock)：将步骤2得到的幼苗在水稻营养液中培养7天，每天更换新鲜的水 稻营养液；

培养条件为：26℃，每天光照12小时、黑暗12小时。

水稻营养液（pH5.3）：溶剂为水，含有如下溶质：1.44mM NH₄NO₃、0.32mM NaH₂PO₄、 0.6mM K₂SO₄、1.0mM CaCl₂、1.6mM MgSO₄、0.072mM Fe-EDTA、0.2mM Na₂SiO₃、9.1μM MnCl₂、 0.154μM ZnSO₄、0.156μM CuSO₄、18.5μM H₃BO₃和0.526μM H₂MoO₄。

4、完成步骤3后，收集植株叶片并提取基因组DNA。

5、以步骤4提取的基因组DNA为模板，用限制性内切酶HpaII(用H表示)或限制性内 切酶MspI（用M表示）进行酶切。

6、将步骤5的酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(电压为17V，36h)，然后将凝胶 在0.25mol/L HCl水溶液中处理15分钟（使DNA脱嘌呤），用蒸馏水洗涤凝胶，然后 将凝胶上的DNA转移到Hybond N⁺尼龙膜（Amersham）上。

7、将步骤5得到的Hybond N⁺尼龙膜进行Southern杂交。

Southern杂交中用于检测Homebox基因（AB007627）的探针如序列表的序列2自 5’末端第243-1050位核苷酸所示（Homebox基因如序列表的序列2所示，编码序列 表的序列1所示的Homebox蛋白，其开放阅读框为自5’末端第110至661位核苷酸）。 Southern杂交中用于检测Elongation factor基因（D12821）的探针如序列表的序列 4自5’末端第113-907位核苷酸所示（Elongation factor基因如序列表的序列4 所示，编码序列表的序列3所示的Elongation factor蛋白，其开放阅读框为自5’ 末端第55至726位核苷酸）。探针的标记采用Amersham Pharmacia公司生产的Gene  Images Alkphos Direct Labelling System试剂盒进行。

Homebox基因的Southern杂交图谱见图1，A为渐渗系水稻RZ35，B为渐渗系水 稻RZ1，C为渐渗系水稻RZ2，箭头示甲基化的降低，*号示甲基化的升高，点样孔均 位于凝胶顶部。

对于渐渗系水稻RZ35来说：

H酶切后，各组的图谱没有明显变化；

M酶切以后，Mock组自上向下（也就是分子量自大至小）显示4条带，依次命名 为条带-Ⅰ、条带-Ⅱ、条带-Ⅲ和条带-Ⅳ；Cd-L组M酶切以后，条带-Ⅰ变浅，表示 该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平降低，从而使得大分子量片段被酶切成小 分子量片段；Cd-H组M酶切以后，条带-Ⅰ基本消失，条带-Ⅲ和条带-Ⅳ变深，表示 该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平降低，从而未使得大分子量片段被酶切成 小分子量片段；Cr-L组M酶切以后，条带-Ⅰ基本消失，表示该组处理诱导了Homebox 基因的甲基化水平降低，从而使得大分子量片段被酶切的小分子量片段；Cr-H组M酶 切以后，条带-Ⅰ基本消失，条带-Ⅱ变浅、条带-Ⅲ和条带-Ⅳ变深，表示该组处理诱 导了Homebox基因的甲基化水平降低，从而使得大分子量片段被酶切成小分子量片段。

对于渐渗系水稻RZ1来说：

H酶切后，各组的图谱没有变化；

M酶切以后，Mock组显示1条带，将其命名为条带-Ⅴ；Cd-L组M酶切以后，条 带-Ⅴ变浅，出现了一条分子量大于条带-Ⅴ的新条带，表示该组处理诱导了Homebox 基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段，小分子量片段减少；Cd-H组M酶 切以后，出现了一条分子量大于条带-Ⅴ的新条带，表示该组处理诱导了Homebox基因 的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段；Cr-L组M酶切以后，出现了一条分子 量大于条带-Ⅴ的新条带，表示该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平升高，从而 出现了大分子量片段；Cr-H组M酶切以后，出现了一条分子量大于条带-Ⅴ的新条带， 表示该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段。

对于渐渗系水稻RZ2来说：

H酶切后，各组的图谱没有变化；

M酶切以后，Mock组显示1条带，将其命名为条带-Ⅵ；Cd-L组M酶切以后，出 现了分子量大于条带-Ⅵ的新条带，表示该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平升 高，从而出现了大分子量片段；Cd-H组M酶切以后，出现了分子量大于条带-Ⅵ的新 条带，表示该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片 段；Cr-L组M酶切以后，出现了分子量大于条带-Ⅵ的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段；Cr-H组M酶切以后，出 现了分子量大于条带-Ⅵ的新条带，表示该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平升 高，从而出现了大分子量片段。

从图1A可以观察到，镉离子和铬离子处理后，渐渗系水稻RZ35的Homebox基因 出现了CCGG位点外侧胞嘧啶半甲基化水平降低，渐渗系水稻RZ1和渐渗系水稻RZ2 的Homebox基因出现了CCGG位点外侧胞嘧啶半甲基化水平升高。

Elongation factor基因Southern杂交图谱见图2，A为渐渗系水稻RZ35，B为 渐渗系水稻RZ1，C为渐渗系水稻RZ2。对于渐渗系水稻RZ35、渐渗系水稻RZ1和渐渗 系水稻RZ2来说，各组H酶切后的图谱或M酶切后的图谱没有明显变化。镉离子和铬 离子处理后，渐渗系水稻RZ35、渐渗系水稻RZ1和渐渗系水稻RZ2的Elongation factor 基因的甲基化水平均无明显变化。