一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒

摘要

本发明属于分子生物学领域，涉及一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒。本发明根据番茄潜叶蛾特有的线粒体DNA序列，设计一对特异性引物，该引物只对番茄潜叶蛾具有扩增能力，扩增产物大小为256bp，对单粒卵及成虫残体亦有良好的检测效果。是对番茄潜叶蛾RAPD和rDNA ITS、mtDNA COI技术检测方法的补充和改进。同时，本方法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸推广。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI 引物及快速PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

番茄潜叶蛾Tuta absoluta(Meyrick)，属鳞翅目、麦蛾科，是番茄的一种世界性 毁灭性检疫害虫，2004年被列为欧洲和地中海植物保护组织(European and  Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)的A1类检疫性有害生物之一。番 茄潜叶蛾为寡食性害虫，对番茄的危害尤为严重，且大田和温室均可发生；此外， 亦可为害茄子、马铃薯、青椒、人参果、烟草等经济作物，龙葵、银叶葵、拟刺茄、 皂味茄等非栽培茄科植物，以及多刺曼陀罗、曼陀罗、光烟草等天然茄科植物；亦 有报道显示，番茄潜叶蛾还可以为害茄科的灯笼果和豆科的豇豆，以及茄科枸杞属 和锦葵科锦葵属的植物等。番茄潜叶蛾可在寄主植物的整个生长期进行为害，主要 以幼虫潜入寄主植物的果实、叶片以及嫩茎等组织中取食为害，以顶芽、花、幼果 受害后损失最为惨重，露地及保护地番茄均可严重受害。花和幼果受害时，或造成 落花落果，或招致病害原微生物寄生而腐烂，直接减产明显；为害叶片时，幼虫仅 取食叶肉组织而留下上下表皮，并形成不规则的潜道，严重影响植物光合作用，最 终导致叶片枯死；蛀食嫩茎形成的隧道，常使受害植株生长畸形，且易于倒折；而 顶芽受害时，植株完全停止生长。为害马铃薯时，只取食其地上部分，不为害地下 部块茎，但会使产量明显降低。通常，番茄潜叶蛾可在寄主植物的任何时期进行为 害，但以叶片受害最为严重，其次为叶脉和茎，花萼及绿色的果子亦可受害，严重 受害时植株呈火烧状。如若不及时控制，可使番茄减产达90-100%，番茄产业（包 括鲜食和深加工）遭受的经济损失达50-100%，因此被国际马铃薯研究中心认定为 是为害马铃薯叶片的最为重要的害虫之一。

番茄潜叶蛾原产于南美洲，自二十世纪60年代以来一直是该洲番茄作物上的一 种重要害虫，其发生区域主要有阿根廷、玻利维亚、巴西、智利、哥伦比亚、厄瓜 多尔、巴拉圭、秘鲁、乌拉圭、委内瑞拉等10个国家。然而，自2006年底在西班 牙东部首次发现番茄潜叶蛾为害温室番茄以来，很快便在摩洛哥、突尼斯以及芬兰、 意大利、荷兰、阿尔巴尼亚、阿尔及利亚、葡萄牙、保加利亚、塞浦路斯、德国、 以色列、匈牙利、立陶宛、塞尔维亚、英国、俄罗斯、瑞士等近20个国家严重发生， 近期又在希腊发现它的踪迹，在地中海盆地呈迅速扩张之势，使欧洲番茄生产遭受 了严重打击，堪称世界番茄和马铃薯产业的一种毁灭性害虫。此外有研究显示，1962 年日本曾有疑似番茄潜叶蛾为害野茄子的报道，之后未曾提及，故其在日本的发生 尚有待商榷。目前，我国尚未有番茄潜叶蛾的发生，因此加强对番茄潜叶蛾的检疫 检验，是保障我国番茄和马铃薯、烟草等产业健康发展的首要前提。

番茄潜叶蛾为小型蛾类昆虫，成虫体长6-7mm；卵长0.36mm，宽0.22mm， 圆柱形，奶白色至桔黄色，肉眼难以发现。雌性成虫主要将卵产于叶片背面，亦可 产在叶片正面、芽、茎或绿色的果子上，幼虫一经孵化即潜入叶片、茎秆或果实内 进行取食为害；老熟幼虫可在土中化蛹，亦可在叶片表面或潜道内化蛹。而加强检 疫和监测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于番茄潜叶蛾鉴定 的方法主要有：1）形态特征鉴定；2）PCR技术等。但目前国内针对番茄潜叶蛾尚 没有标准的检测方法。

RAPD和ITS、COI技术曾用于区分番茄潜叶蛾的不同地理种群。RAPD技术 检测是以基因组DNA为模板，以单条人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在 DNA聚合酶的催化下，进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、 溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上根据多态性来判断检测结果。rDNA ITS技术和 mtDNA COI技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA 进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构 建来判断检测结果。SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来 的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断 检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性 好和稳定性强等优点。

发明内容

本发明的目的为提供一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI引物。

本发明的另一目的为提供一种番茄潜叶蛾的特异性快速PCR检测方法。

本发明的再一目的为提供一种番茄潜叶蛾的特异性快速PCR检测试剂盒。

本发明根据番茄潜叶蛾的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物 只对番茄潜叶蛾具有扩增能力。是对番茄潜叶蛾RAPD技术和rDNA ITS技术及 mtDNA COI技术检测方法的补充和改进。同时，本方法采用SS-COI PCR技术，提 高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在番茄潜叶蛾检测/监测方面具有很 高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国各口岸推广。

根据本发明的一对番茄潜叶蛾特异性SS-COI引物为：

SEQ ID No.1引物TAZJCE1：5′-AGAATCGTAGAAAATGGAGCAGGTA-3′；和

SEQ ID No.2引物TAZJCF1：5′-CTGGCAATGATAAAAGAAGGAG-3′。

根据本发明的番茄潜叶蛾种特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行 PCR扩增的步骤。

根据本发明的番茄潜叶蛾种特异性检测试剂盒包括上述番茄潜叶蛾特异性 SS-COI引物。

本发明的番茄潜叶蛾种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检 测番茄潜叶蛾。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1）检测准确性高。本方法根据番茄潜叶蛾种特异性SS-COI标记设计的引物 TAZJCE1和TAZJCF1，在PCR快速检测番茄潜叶蛾时，可扩增出256bp的片段， 不仅对番茄潜叶蛾的单头成虫可以进行检测，对于单粒卵和成虫残体包括触角、头 部、胸部、腹部、前翅、后翅、前足、中足、后足等也能准确检测。

2）操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般 整个过程可在5个小时内完成。

3）特异性强。本发明设计的引物可特异性检测番茄潜叶蛾，在其同域发生的其 他潜叶类害虫中无扩增产物。

因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。

附图说明

图1为引物TAZJCE1/TAZJCF1对番茄潜叶蛾以及其他常见潜叶类害虫的 SS-COI PCR扩增结果，

M:分子量标准DGL2000；1:番茄潜叶蛾Tuta absoluta(Meyrick)；2:美洲斑潜 蝇Liriomyza sativae Blanchard；3:南美斑潜蝇Liriomyza huidobrenisis(Blanchard)； 4:三叶草斑潜蝇Liriomyza trifolii(Burgess)；5:葱斑潜蝇Liriomyza chinensis(Kato)； 6:豌豆潜叶蝇Phytomyza horticola Goureau；7:桃潜叶蛾Lyonetia clerkella L.；8:水 （阴性对照）

图2为引物TAZJCE1/TAZJCF1对番茄潜叶蛾卵以及成虫残体的SS-COI PCR 扩增结果，

M:分子量标准DGL2000；1:卵；2:触角；3:头部；4:胸部；5:腹部；6:前 翅；7:后翅；8:前足；9:中足；10:后足；11:水（阴性对照）。

图3为引物TAZJCE1/TAZJCF1对番茄潜叶蛾最低检测阈值的测定，

M:分子量标准DGL2000；1-15:80×10³,40×10³,20×10³,10×10³,5.0×10³,2.5×10³, 1.25×10³,625.0,312.5,156.25,78.125,39.06,19.53,9.76和4.88pg/μL，相当于1/50, 1/100,1/200,1/400,1/800,1/1600,1/3200,1/6400,1/12800,1/25600,1/51200,1/102 400,1/204800,1/409600,1/819200头雌性成虫；16:水（阴性对照）。

具体实施方式

实施实例1：引物TAZJCE1/TAZJCF1对番茄潜叶蛾的扩增效果

1）潜叶类害虫模板DNA的制备

将单头潜叶类害虫成虫置于1.5mL的离心管中，加入液氮后以研磨棒充分研磨， 然后以220μL缓冲液（50mM Tris-HCl、lmM EDTA、1%SDS、20mM NaCl,pH8.0） 分2次清洗研磨棒，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60℃水 浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴8min，加入220μL氯仿/异戊醇（V:V=24:1） 抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离心20min，取 上清液约400μL移入另一离心管，加入800μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现 少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心20min，小心弃去 上清液。加入500μL预冷的75%乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15min，小心 弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥30min后每管加入100μL 超纯水，充分溶解后于-30℃保存备用。

2）检验番茄潜叶蛾的特异性引物的合成

Primer TAZJCE1：5′-AGAATCGTAGAAAATGGAGCAGGTA-3′

Primer TAZJCF1：5′-CTGGCAATGATAAAAGAAGGAG-3′由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成。

3）PCR扩增反应

反应体系为25μL，其中10×PCR buffer2.5μL、dNTP(10mM)0.5μL、Taq聚 合酶(5U/μL)0.25μL、上游引物和下游引物(10pM)各0.5μL、模板DNA2.0μL、 超纯水18.75μL。

4）PCR扩增程序

94℃预变性5min；30个循环：94℃30sec、58℃30sec、72℃50sec；最 后72℃延伸5min。

5）PCR产物的鉴定

取5μL PCR产物用1.0%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

结果

利用引物primer TAZJCE1/TAZJCF1以番茄潜叶蛾DNA为模板，以美洲斑潜蝇、 南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇以及桃潜叶蛾等6种其他常见 潜叶类害虫为对照进行SS-COI PCR扩增。在1泳道的番茄潜叶蛾中扩增出了256bp 的目的条带（见附图1的1泳道），在其他6种潜叶类害虫中均无扩增产物。说明我 们所筛选的来自番茄潜叶蛾线粒体DNA的特异性SS-COI PCR扩增引物的特异性 强。

SEQ ID No.3256bp片段的序列：

agaatcgtag aaaatggagc aggtactggt tgaactgtct atccccccct atcttctaat attgctcatg      70

gaggtagttc agtagattta gctatttttt ctttacattt agctggtatt tcatcgattt taggagctat     140

taattttatt accactatta ttaatatacg agttaatgga ctttcatttg atcaaatacc tttatttgtt     210

tgagctgttg gtattactgc tttactcctt cttttatcat tgccag                               256

实施实例2：引物TAZJCE1/TAZJCF1对番茄潜叶蛾卵及成虫残体的扩增效

（1）番茄潜叶蛾模板DNA的制备

将番茄潜叶蛾单粒卵和成虫残体（包括单根触角、头部、胸部（1/2）、腹部（1/5）、 前翅、后翅、前足、中足、后足）分别置于滴有20μL提取缓冲液（50mM Tris-HCl、 lmM EDTA、1%SDS、20mM NaCl,pH8.0）的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部 作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液 分4次清洗匀浆器和Prafilm膜，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20 mg/mL)，充分混匀后于60℃水浴1.5h(中途混匀1次)；然后沸水浴8min，加入 220μL氯仿/异戊醇（V:V=24:1）抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、 12000r/min离心20min，取上清液约200μL移入另一离心管，加入440μL预冷的 无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min 离心20min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75%乙醇洗涤，4℃、12000 r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥30 min后每管加入25μL超纯水，充分溶解后于-30℃保存备用。

（2）检验番茄潜叶蛾的特异性引物的合成

Primer TAZJCE1：5′-AGAATCGTAGAAAATGGAGCAGGTA-3′

Primer TAZJCF1：5′-CTGGCAATGATAAAAGAAGGAG-3′由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成。

（3）PCR扩增反应

反应体系为25μL，其中10×PCR buffer2.5μL、dNTP(10mM)0.5μL、Taq聚 合酶(5U/μL)0.25μL、上游引物和下游引物(10pM)各0.5μL、模板DNA 2.0μL、 超纯水18.75μL。

（4）PCR扩增程序

94℃预变性5min；30个循环：94℃30sec、58℃30sec、72℃50sec；最 后72℃延伸5min。

（5）PCR产物的鉴定

取5μL PCR产物用1.0%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

结果

利用引物TAZJCE1/TAZJCF1以番茄潜叶蛾的卵以及成虫残体DNA为模板进行 PCR扩增。番茄潜叶蛾的卵扩增出了256bp的目的条带（见附图2的1泳道）；同 时番茄潜叶蛾的单粒卵以及成虫的单根触角、头部、胸部（1/2）、腹部（1/5）、前翅、 后翅、前足、中足、后足等也扩增出了256bp的目的条带（见附图2的2、3、4、5、 6、7、8、9、10泳道），说明我们所筛选的番茄潜叶蛾的种特异性SS-COI PCR扩增 引物的准确性高。

实施实例3：引物TAZJCE1/TAZJCF1对番茄潜叶蛾最低检测阈值的测定

（1）番茄潜叶蛾模板DNA的制备

将单头番茄潜叶蛾雌性成虫置于1.5mL的离心管中,加入液氮后以研磨棒充分 研磨，然后以220μL缓冲液（50mM Tris-HCl、lmM EDTA、1%SDS、20mM NaCl, pH8.0）分2次清洗研磨棒，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后 于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴8min，加入220μL氯仿/异戊醇 （V:V=24:1）抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、12000r/min离 心20min，取上清液约400μL移入另一离心管，加入800μL预冷的无水乙醇，轻轻 混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心20min， 小心弃去上清液。加入500μL预冷的75%乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心15 min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥30min后每管 加入100μL超纯水。然后将原模板溶液以2倍进行递减梯度稀释至1/819200头，取2 μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。

（2）检验番茄潜叶蛾的特异性引物的合成

Primer TAZJCE1：5′-AGAATCGTAGAAAATGGAGCAGGTA-3′

Primer TAZJCF1：5′-CTGGCAATGATAAAAGAAGGAG-3′由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成。

（3）PCR扩增反应

反应体系为25μL，其中10×PCR buffer2.5μL、dNTP(10mM)0.5μL、Taq聚 合酶(5U/μL)0.25μL、上游引物和下游引物(10pM)各0.5μL、模板DNA2.0μL、 超纯水18.75μL。

（4）PCR扩增程序

94℃预变性5min；30个循环：94℃30sec、58℃30sec、72℃50sec；最 后72℃延伸5min。

（5）PCR产物的鉴定

取5μL PCR产物用1.0%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

结果

利用引物primer TAZJCE1/TAZJCF1做最低检测阈值的测定，以不同稀释倍数 的番茄潜叶蛾线粒体DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最低模板DNA浓度为 312.5pg/μL，相当于1/12 800头雌性成虫（见附图3）。