一种重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法

摘要

本发明提供了一种重组猪IL2-Fc融合蛋白及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。IL2在疾病发生过程中起到十分重要的免疫调节作用，但其也存在血浆中清除速度较快、产业化成本高的缺陷。为大量获取半衰期较长的猪IL2，本发明采用大肠杆菌原核表达体系提供了一种重组猪IL2-Fc融合蛋白。其中，猪IL2部分为猪IL2胞外区的全部序列，Fc片段部分包括抗体的铰链区、CH2区和CH3区，猪IL2与Fc片段部分之间为直接融合。本发明提供的重组猪IL2-Fc融合蛋白，不仅保存了IL-2的大部分生物活性，而且极大的延长了其半衰期，为低成本大量表达及其产业化提供了保障。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白及其编码基因， 以及其表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

白细胞介素2（Interleukin-2，简称IL-2）是由活化的T淋巴细胞产生的一种重要的细胞因 子，能激活T细胞和促进B细胞分化和分泌抗体，诱导产生干扰素，增强单核细胞以及自然杀 伤细胞（natural killer cell，简称NK）的杀伤活性，在机体的免疫反应中具有重要的调节作用， 是一类天然的免疫增强剂。在医学治疗领域，商品化的重组人白细胞介素2已经用于肿瘤、艾 滋病、乙型肝炎等疾病的辅助治疗。在兽药中，由于白细胞介素2能提高疫苗的免疫应答、减 少疾病的发生，也展现出广阔的应用前景。目前，对鸡、牛白细胞介素2基因的研究较多，两 者均已在原核和真核表达系统中表达。研究显示，鸡的重组白细胞介素2与多种病原疫苗联合 使用，可显著提高免疫水平，减少应激，降低疫苗的副作用，从而达到更强的治疗作用。我 国是世界上养猪大国，猪的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率和死亡率最高， 每年给养猪业造成巨大的经济损失，因此对这些病毒性疾病的治疗和预防成为养猪业的首要 任务。白细胞介素2增强免疫、抵御病毒的性质使得其在猪的病毒性疾病方面显示出广阔的应 用前景，但是针对猪白细胞介素2的研究却并不多见。

另一方面，作为小分子量蛋白，猪白细胞介素2也与其他白细胞介素2一样，存在血浆清 除速度较快的缺陷，从而导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。同样，半 衰期短及用药的频繁也将成为使用猪白细胞介素2治疗猪病毒性疾病的瓶颈。IgG免疫球蛋白 是人和动物体内的主要抗体，它在体内的半衰期约为20天。其稳定性是由于IgG的Fc片段可与 新生Fc受体（FcRn）结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。由此可见，可以考虑在猪白细胞介 素2上增加IgG的Fc片段来构成融合蛋白，以提高猪白细胞介素2体内半衰期，达到长效的目的。

由此，本发明提供一种既能保留猪白细胞介素2原有活性，又可以延长体内半衰期的猪白 细胞介素2与Fc片段的融合蛋白。

然而，通过大肠杆菌表达的重组蛋白多为不溶解、无活性的细胞内聚集物，即包涵体。 包涵体的复性是一个非常复杂的过程，如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配， 分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合 格，同时又产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是采用合适 的方法将大肠杆菌表达的蛋白包涵体进行复性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠 杆菌内高效表达的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白以及其基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括猪白细胞介素2部分和 Fc片段部分，其中，猪白细胞介素2部分为猪白细胞介素2胞外区的全部序列，Fc片段部分包 括铰链区、CH2区和CH3区，猪白细胞介素2与Fc片段部分之间为直接融合。

其中的Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白Fc，是Fc全长或是部分序列，Fc选自IgG、IgM、 IgD、IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。本发明的融合蛋 白中的Fc片段部分特别优选来自猪的IgG1。

优选地，本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列， 其中第1-134位氨基酸残基为猪白细胞介素2的胞外区序列，第135-334位氨基酸残基为猪 IgG1序列。

本发明提供了编码上述所述重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显 著提高异源基因在宿主菌中的表达。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因的质粒，所 述的质粒优选为原核表达质粒，最优选为pET21b载体。

本发明还提供了包含有上述所述质粒的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌 BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取1个或多个含有上述所述重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌落，接入LB 培养液，于37℃培养过夜；

2.取适量过夜培养物，接入于所述过夜培养物的100倍量的LB培养液中，于37℃震荡培 养至对数中期OD₆₀₀=1.0；

3.在培养物中加入IPTG至1mmol/L，于37℃，诱导表达4h后，于4℃以转速5000rpm， 离心处理15min，收集含有重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌体。

所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100μg/ml。

本发明的上述所述表达方法是经过发明人反复多次实验摸索和验证得到的用于表达重组 猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性 后活性更高。

本发明还提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的包涵体纯化方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的 PBS重悬，并于4℃高速离心处理；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A3-10mL，用磨光 玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3.每克（湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL 的溶菌酶，于冰上搅动。

4.破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4℃高速离心处理。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4℃高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30-60min。

7.充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋 白变性溶液。

该纯化方法优选步骤如下：

1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的 PBS重悬，于4℃，以12000rpm的转速离心15min；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻璃 棒搅动，使菌体悬起。

3.每克（湿重）菌体加入5μL浓度为100mmol/L的PMSF，5μL浓度为100mg/mL的溶菌酶， 冰上搅动20min。

4.用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次， 每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。于4℃，以12000rpm的转速离心15min， 弃上清。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，于4℃，以12000rpm的转速离心15min，沉淀包涵体， 重复一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。

7.充分混匀后室温下以12000rpm的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白 细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶液。

本发明还提供了优化后的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的包涵体复性方法，包括如下 步骤：

取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶液，用复 性缓冲液Buffer D将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，4℃复性至24h时，将复性后重组蛋白溶 液用0.45μm滤膜过滤，即得到低浓度的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白溶液。用截留分 子量10KDa的超滤管脱盐、浓缩，低温真空干燥，即获得重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白 粉末。各缓冲液的成分及其含量如下表所示：

本发明还提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白在制备治疗和预防猪繁殖与呼吸综合 征、猪流感以及猪蓝耳病疾病的药物中的用途。在动物医疗中，由于白细胞介素2能提高疫苗 的免疫应答和减少疾病的发生率，重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白与多种病原疫苗联合使用， 可显著提高免疫水平，减少应激，降低疫苗的副作用,从而达到较强的治疗作用。

重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白也可作为新型免疫佐剂使用，不仅能避免常规佐剂的不 良反应，还可以显著增强机体对病毒、细菌和寄生虫疫苗的免疫效力，提高抗体整齐度和延 长抗体持续时间，并且还可以降低某些疫苗的副作用。

本发明的经优化过的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白重组基因序列，更适于大肠杆菌表 达系统的表达，所表达的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白远高于猪白细胞介素2-Fc融合蛋白 天然基因序列在大肠杆菌表达系统的表达量，并且，与猪白细胞介素2相比，本发明的重组猪 白细胞介素2-Fc融合蛋白在保证了猪白细胞介素2活性的基础上较大程度上延长了其在生物 体内的半衰期，实现了长效和避免反复用药的目的。同时，本发明所提供的是一种猪源型融 合蛋白，更适于用针对猪类病毒性疾病兽药的制备，而本发明所提供的该融合蛋白的原核细 胞表达、纯化和复性方法也极大的控制了其制备成本，为其产业化提供了保障。

附图说明

图1表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前后核苷酸序列比较

其中，奇数行（即“原始序列”对应的行）为猪白细胞介素2-Fc融合蛋白天然基因核苷 酸序列，即密码子优化前的序列；偶数行（即“优化序列”对应的行）为本发明的重组猪白 细胞介素2-Fc融合蛋白的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图2-a、图2-b为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中 CAI指数。

其中，图2-a表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中 CAI指数为0.64；图2-b表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠杆菌表达宿 主中CAI指数为0.87。

图3-a、图3-b为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子在大肠杆菌表达宿主中最优密码 子频率分布区域图。

其中，图3-a表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中最 优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前 序列的低利用率密码子（<30%）出现百分比为9%；图3-b表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋 白密码子优化后在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，重组猪白细胞介素2-Fc 融合蛋白密码子优化前序列的低利用率密码子（<30%）出现百分比为0。

图4-a、图4-b为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子中在大肠杆菌表达宿主中平均GC 碱基含量分布区域图。

其中，图4-a表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中平 均GC碱基含量为：51.19%；图4-b表示重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠 杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：51.34%。

图5-a、图5-b为猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前后mRNA的二级结构预测图。

图5-a猪白细胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化前mRNA的二级结构预测图，图5-b为猪白细 胞介素2-Fc融合蛋白密码子优化后mRNA的二级结构预测图。

图6为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白表达质粒构建过程图。

图7为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白优化基因琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2为NdeI和XhoI双酶切后的pET21b载体；泳道3 为两端含有NdeI和XhoI酶切位点的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因PCR产物。

图8为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图及相应的免疫印迹图。

图8-a为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为未加入IPTG诱导 的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道3为加入IPTG诱导的重组猪白细胞介 素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。

图8-b为重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白免疫印迹图。

其中，泳道1（10-230KDa）宽范围的预染的蛋白上样Marker，泳道2为未加入IPTG诱导 的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液：泳道3为加入IPTG诱导的重组猪白细胞介 素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。

图9重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白高效表达诱导条件优化SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为0.5mmol/L IPTG 诱导1h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道3为0.5mmol/L IPTG诱导2h重 组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道4为0.5mmol/L IPTG诱导3h重组猪白细胞 介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道5为0.5mmol/L IPTG诱导4h重组猪白细胞介素2-Fc 融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道6为1mmol/L IPTG诱导1h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大 肠杆菌裂解液；泳道7为1mmol/L IPTG诱导2h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解 液；泳道8为1mmol/L IPTG诱导3h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道9 为1mmol/L IPTG诱导4h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道10为 1.5mmol/L IPTG诱导1h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道11为 1.5mmol/L IPTG诱导2h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道12为 1.5mmol/L IPTG诱导3h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道13为 1.5mmol/L IPTG诱导4h重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。

图10为复性后的猪白细胞介素2-Fc融合蛋白包涵体SDS-PAGE电泳图

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为超声裂解含有重 组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的全菌裂解液；泳道3为用Buffer B第一次清洗后重组猪白细胞 介素2-Fc融合蛋白包涵体沉淀；泳道4为Buffer B第二次清洗后重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋 白包涵体沉淀。

图11为重组白细胞介素2-Fc在猪血清中稳定性免疫印迹图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为未加猪白细胞介 素2和重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白猪血清样品；泳道3为加入1μmol/mL猪白细胞介素2和 1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白0h的猪血清样品；泳道4为加入1μmol/mL猪白细 胞介素2和1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白0.25h的猪血清样品；泳道5为加入 1μmol/mL猪白细胞介素2和1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白0.5h的猪血清样品； 泳道6为加入1μmol/mL猪白细胞介素2和1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白1.5h的 猪血清样品；泳道7为加入1μmol/mL猪白细胞介素2和1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融 合蛋白3h的猪血清样品；泳道8为加入1μmol/mL猪白细胞介素2和1μmol/mL重组猪白细胞介 素2-Fc融合蛋白6h的猪血清样品；泳道9为加入1μmol/mL猪白细胞介素2和1μmol/mL重组猪 白细胞介素2-Fc融合蛋白24h的猪血清样品；泳道10为加入1μmol/mL猪白细胞介素2和 1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白48h的猪血清样品；泳道11为加入1μmol/ml猪白细 胞介素2和1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白72h的猪血清样品；泳道12为加入 1μmol/mL猪白细胞介素2和1μmol/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白120h的猪血清样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。

实施例1重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因优化设计

1.密码子优化

遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频 繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码 子(rare or low-usage codons)。实际上，常用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌， 酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。 大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的 基因的表达效率。因此，在异源表达系统中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的 表达。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因 的重新设计叫密码子优化。优化过程充分考虑到蛋白表达不同阶段可能遇到的多种复杂因素， 如：密码子适应性、mRNA结构以及转录和翻译过程中不同的顺式元件。因此，本发明对猪 白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因设计不仅包括密码子优化，还包括mRNA结构修正、翻译起始 位点的优化等。

2.密码子偏爱性优化

密码子偏爱性在原核基因表达中已经被证实是一个很重要的影响因素，它引起了同一密 码子在不同生物体之间，蛋白的表达水平之间以及同一操纵子的不同部位间利用率的改变。 引起这种偏爱性差异的主要原因是不同细胞内可用的tRNAs量的差异。因此优化翻译系统最 佳的方法就是保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡。在大肠杆菌中表达哺乳动物基 因是不可预测和具有挑战的，如在大肠杆菌中，AGG和AGA所对应的tRNA分子就很少，这种 差异很明显会影响基因的表达。

3.将低利用率的密码子替换成宿主常用密码子

通常基因中包含的密码子在特定宿主中的利用率越低，该种蛋白的表达量也就越少，甚 至当这种密码子存在与蛋白簇间或者N末端的时候表达量会更少。在不改变氨基酸序列的前 提下将低利用率的密码子替换为宿主常用密码子能提高功能蛋白的表达水平。

任何来源的密码子如果在宿主生物体内的利用率低于5%到10%时,就会出现表达抑制， 当这些低利用率密码子临近或相连时，对蛋白表达的影响更大。成簇的低利用率的密码子抑 制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。核糖体翻译由九个密码 子组成的信使（含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子）时的运动速度要比翻译不 含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。即使低利用率密码子簇位于3’端，信使最后也 会被核糖体“拥挤”而损害，核糖体又回到5’端。3’端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全 部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。如果低利用率密码子簇位于5’端，其效 应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密码子或 者容易被误读为终止信号的密码子能够防止低表达或者不表达。

4.表达载体和转录启动子

虽然密码子偏爱在基因表达中起着重要的作用，但表达载体和转录启动子的选择同样重 要，N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感。 翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，虽然降低翻译效率会使mRNA由于缺少了核糖 体的保护而更容易被endo-RNAses分解，但目前还没有它们之间影响的完整解释。

其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。稳定mRNA二级结构和接近 5'端的分子也对基因表达有重要的影响。利用翻译时目的基因上游的开放式阅读框能够成功 提高难度基因的表达效率。

发明人根据GenBank已公开的猪白细胞介素2（Sus scrofa interleukin2）的cDNA序列 (GenBank登录号：NM_213861.1)和猪IgG Fc片段（Sus scrofa IgG heavy chain）的cDNA序列 (GenBank登录号：NM_213828.1)中铰链区、CH2区和CH3区，对这2个基因直接融合并进行 密码子优化得到本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因，如SEQ ID No：1所示。

下面是对重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因进行密码子优化具体步骤：

对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因，如SEQ ID No：1所示。

下面是对重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白进行密码子优化，优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(CAI)

由图2-a可知，密码子没有优化前，重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中密 码子适应指数（codon adaptation index,CAI）为0.64。由图2-b可知，通过密码子优化后，使 得重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中CAI指数为0.87。通常CAI=1时被认为该 基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平 越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高重组猪白细胞介素2-Fc融 合蛋白基因在大肠杆菌中的表达水平。

2.最优密码子使用频率（FOP）

由图3-a可知，基于大肠杆菌表达载体，密码子没有优化前，猪白细胞介素2-Fc融合蛋白 基因序列的低利用率密码子出现百分比为9%。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，

这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，

重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌系统中出现低利用率密码子的频率为0。

3.GC碱基含量（GC curve）

GC含量理想分布区域为30%-70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录 和翻译效率。由图4-a、图4-b的猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因的GC碱基平均含量分布区域 图对比可知，由图4-a中显示猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因中在优化前GC碱基平均含量为 51.19%，由图4-b中显示出优化后的序列消除了GC含量在30%-70%区域外的60个碱基，最终 得到优化后重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的GC碱基平均含量为51.34%。

3.顺式作用元件

顺式作用元件 优化前 优化后 E.coli_RBS(AGGAGG) 1 0 PolyT(TTTTTT) 0 0 PolyA(AAAAAAA) 0 0 Ch位点(GCTGGTGG) 0 0 T7Cis(ATCTGTT) 0 0

4.去除重复序列

5.mRNA的二级结构预测图

在DNA转录成mRNA后，由于mRNA是单链线性分子，通过自身回折使得互补的碱基对相 遇，通过氢键结合而成的发卡结构(Hairpin)。5’发卡结构可以在翻译起始阶段起调控作用。 但是如果发卡结构很长，解链所需的能量很高，就有可能影响到翻译。所以需要表达的序列 应该尽量避免长而且能量高的发卡结构。通过密码子优化后，由图5-a、图5-b猪白细胞介素 2-Fc融合蛋白密码子优化前后mRNA的二级结构预测图可知，优化后的5’发卡结构和解链所需 的能量更适于目的蛋白的表达。

实施例2：重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白基因的表达质粒构建

将优化后的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白全基因（如SEQ ID No：1所示）合成的片段， 构建到pUC57质粒（由南京金斯瑞科技有限公司提供）中，得到一种长期保存质粒，记为 pUC57-pIL2-Fc质粒。以pUC57-pIL2-Fc质粒为模板，上、下游分别引入NdeI和XhoI酶切位点， 进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

P1:GGAATTCCATATGGCTCCGACCTCGTCGTCC

下游引物：

P2:GCCGCTCGAGTTATTTGCCCTGGGTTTTGCTG

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL， 所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase（购自Theromo-Fisher scientific）， 2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5s、55℃45s、72℃30s，25个循环后，产物经1.0%琼脂 糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小（1098bp）一致。（如图7所示）

将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）纯化。纯 化后，用NdeI和XhoI（购自New England Biolabs公司）双酶切，用T4连接酶（购自New England  Biolabs公司）将双酶切后的产物连接到pET21b质粒（购自Merck公司）中，转化到DH5α感 受态细胞（购自北京天根生化科技有限公司）中，在含有100μg/mL的氨苄青霉素（购自 Amresco公司）的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌，测序，比对结果显示与 预期序列完全一致，即得到重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白一种形式的表达质粒，记为 pET21b-pIL2-Fc。

实施例3重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达和鉴定

具体步骤如下：

1．将实施例2中测序比对正确的pET21b-pIL2-Fc质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受 态菌株（购自北京天根生化科技有限公司）中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。

2．第二天挑1-4个含有pET21b-pIL2-Fc质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素 的LB培养液（购自Amresco公司），37℃培养过夜。

3．取50μL步骤2中过夜培养物，接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃振 荡培养。

4．接种后每隔1h测菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀=1.0时，用1mmol/L的IPTG（购自Amresco公 司）进行诱导表达。

5．诱导表达4h后收集菌液，高速离心（转速：12000rpm/min）3min，用预冷的PBS清 洗沉淀，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温高速离心（转速： 12000rpm/min）1min，取上清。未加入IPTG的重组大肠杆菌培养物也按此步骤处理。

6．各取10μL未加入IPTG和加入IPTG诱导的按步骤5处理后的样品，10%SDS-PAGE凝胶 电泳分析。

7．8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8．考马斯亮蓝染色和免疫印迹，观察表达产物条带，见图8-a和图8-b。

实施例4重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白高效表达诱导条件优化

许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、培养温 度、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制，生长过度或过速都会影响大肠杆菌中 重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白包涵体的表达量。运用三因素四水平，建立IPTG浓度和诱导 时间正交表，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白表达量。

具体步骤如下：

1．将实施例2中测序比对正确的pET21b-pIL2-Fc质粒转化到BL21（DE3）感受态菌株（购 自北京天根生化科技有限公司）中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。

2．次日，挑取1-4个含有pET21b-pIL2-Fc质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉 素的LB培养液，37℃培养过夜。

3．取50μl步骤2中过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃ 振荡培养。

4．接种后测菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀=1.0时，按照下表加入浓度为0.5m mol/L、1.0m mol/L、1.5m mol/L IPTG进行诱导表达。

表1考察重组蛋白表达的诱导剂浓度和诱导时间

5．1，2，3，4h后依次收集重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白菌液，高速离心（转速： 12000rpm）3min，用预冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min， 室温高速离心（转速：12000rpm）1min。

6．取10μL未加入IPTG诱导和加入不同浓度IPTG、不同诱导时间的重组猪白细胞介素2-Fc 融合蛋白培养物悬液，10%SDS-PAGE凝胶电泳分析。

7．8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8．考马斯亮蓝染色，观察重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白表达产物条带。（见图9）

9．凝胶成像系统薄层扫描分析表达重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白含量鉴定猪白细胞介 素2-Fc融合蛋白的表达。最终确定适合本实施的诱导条件为1m mol/L IPTG，诱导时间为4h。

实施例5重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白包涵体纯化及复性

1．将实施例3中收集得到的含有诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的大肠杆菌沉淀， 用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min；重复一次。

2．吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻 璃棒搅动，使菌体悬起。

3．每克（湿重）菌体加入5μL100mmol/L PMSF，5μL100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。

4．用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次， 每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min。

5．沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm，离心15min，沉淀包涵体，重复 一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。

7.充分混匀后室温12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素 2-Fc融合蛋白变性溶液。

8.采用稀释复性法对步骤7中的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶液进行复性。

稀释复性：取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶 液，用Quick Start Bradford1x Dye Reagent（美国bio-rad公司）测其浓度，然后用复性缓冲 液BufferD将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，4℃复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液用0.45μm 滤膜（Merck Millipore公司）过滤，即得到低浓度的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白溶液。 用截留分子量10KDa的超滤管（Merck Millipore公司）脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机（北 京四环科学仪器厂有限公司）低温真空干燥，即获得重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白粉末。

各缓冲液按下表配制：

表2各缓冲液成分

9.分别以步骤5中洗涤缓冲液Buffer B两次洗涤产物进行SDS-PAGE凝胶电泳（图10）， 在目的范围可见明显条带。

实施例6重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白生物学活性测定

白细胞介素2的生物活性检测主要是通过检测白细胞介素2对靶细胞（或反应细胞）的促 增殖作用的能力。NK92细胞系是人自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK）的稳定株，其正 常增殖需要100IU/mL人白细胞介素2的条件下，否则，72h后便会大量死亡。本实验主要以 NK92细胞（购买自ATCC）作为反应细胞，用以检测重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白复性后的 生物活性。

人白细胞介素2与猪白细胞介素2的同源性高于80%，在生物学活性方面有着较大的一致 性。本实验首先采用8种不同浓度的阳性对照人白细胞介素2（购买自江苏金丝利药业有限公 司，国药准字S10970058）检测其对人自然杀伤细胞NK92细胞系的增殖作用，证明实验方案 的可行性。然后检测复性后重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白及阴性对照不含白细胞介素2的培 养基对NK92细胞增殖作用的影响。最后通过测定阳性对照猪白细胞介素2（Recombinant  Procine Interteukin-2，货号907RPIL201。购买自ProSpec公司，PO Box6591,East Brunswick, 08816 NJ，USA）对人自然杀伤细胞NK92细胞系的增殖作用绘制标准曲线，通过四参数回归 方程计算本发明重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的活力：

重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白生物学活性

P_r为阳性对照猪白细胞介素2标准品生物学活性，1×10⁷IU/mL

D_s为本发明猪白细胞介素2-Fc融合蛋白稀释倍数；

D_r为阳性对照猪白细胞介素2标准品稀释倍数；

E_s为本发明猪白细胞介素2-Fc融合蛋白相当于标准品半效量的稀释倍数；

E_r为阳性对照猪白细胞介素2半效量的稀释倍数。

表3及表4的数据显示，猪白细胞介素2与人白细胞介素2一样，对NK92细胞增殖作用，即 可以通过检测重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白对NK92细胞增殖作用检测其生物学活性。此 外，本发明制备的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白与阳性对照猪白细胞介素2、人白细胞介素 2对NK92细胞的生长均具有促进作用。与未经白细胞介素2处理的细胞相比，在浓度为 100ng/mL重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白样品处理条件下，NK92细胞增殖了约4倍（表5）。 通过公式计算，本发明所得的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白活力为0.8x107IU/mL，其活性 为未连接Fc片段的阳性对照猪白细胞介素2的80%，基本保持了其原有的生物学活性。

表3 不同浓度的阳性对照人白细胞介素2对NK92细胞增殖作用

表4 不同浓度的阳性对照猪白细胞介素2对NK92细胞增殖作用

表5重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白对NK92细胞增殖作用

实施例7重组猪白细胞介素2的制备（详细可参见申请人的在先申请：201210584912.9）

具体步骤如下：

1.构建可表达重组猪白细胞介素2的重组大肠杆菌。

根据GenBank已公开的猪白细胞介素2（Sus scrofa interleukin2）的cDNA序列(GenBank 登录号：NM_213861.1)，按照大肠杆菌表达系统对该基因进行密码子优化后得到重组猪白细 胞介素2基因，如SEQ ID No：3所示。将优化后的重组猪白细胞介素2全基因合成的片段，构 建到pUC57质粒中，得到pUC57-prIL2质粒。

以pUC57-prIL2质粒为模板，上、下游引物分别引入NdeI和XhoI酶切位点，进行PCR扩增， 所用引物序列如下：

上游引物：

P1:GGAATTCCATATGGCTCCGACCTCGTCGTCC

下游引物：

P2:GCCGCTCGAGTTACGTCAGGGTAGAGTAAATGC

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL， 所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃ 5s、55℃20s、72℃30s，25个循环。PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NdeI和XhoI 双酶切，用T4连接酶连接到pET21b质粒中，并将质粒转化到DH5α感受态细胞中扩增。将扩 增的表达质粒pET21b-prIL2转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中。

2.重组猪白细胞介素2包涵体的表达

将含有pET21b-prIL2的大肠杆菌BL21（DE3）于37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。次日 挑1-4个含有pET21b-prIL2质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液， 37℃培养过夜。取50μL过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃ 振荡培养。待OD₆₀₀=1.0时，用1mmol/L的IPTG进行诱导。4h后收集菌液，高速离心，用预冷 的PBS清洗沉淀。

3.重组猪白细胞介素2包涵体的复性及纯化

将步骤2中经预冷的PBS清洗沉淀用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min； 重复一次。弃上清，按每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，使菌体悬起。每 克（菌体湿重）菌体加入5μL100mmol/L PMSF，5μL100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。用 探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环 至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min。沉淀用洗涤缓冲 液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm，离心15min，沉淀包涵体，重复一次。包涵体沉淀用变 性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。充分混匀后室温12000rpm，离心15min，弃沉 淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素2变性溶液。采用透析复性法复性包涵体：用变性缓 冲液Buffer C将重组猪白细胞介素2变性溶液浓度稀释到0.2mg/mL，注入截留分子量10KDa的 透析卡中，4℃透析复性，每隔6h换一次复性缓冲液Buffer D。复性至24h时，将复性后重组 蛋白溶液过0.45μm滤膜，即得到低浓度的重组猪白细胞介素2复性溶液。用截留分子量10KDa 的超滤管脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机低温真空干燥，即获得重组猪白细胞介素2粉末。各 缓冲液按下表配制如表2所示。重组猪白细胞介素2粉末4℃冰箱存放待用。

实施例8重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白稳定性试验

为了检测猪白细胞介素2-Fc融合蛋白在血清中的稳定性，发明人特殊设计了一种体外模 拟猪血清环境，将1μmol/ml的实施例7中制备重组猪白细胞介素2和1μmol/ml本发明的重组 猪白细胞介素2-Fc融合蛋白共同置于新鲜的猪血清50uL中，37℃,120rpm，分别反应0，0.25， 0.5，1.5，3，6，24，48，72，120h后保存-20℃。以鼠抗猪白介素2单克隆抗体（Porcine IL-2 Antibody,Monoclonal Mouse IgG2B Clone#100312,Catalog Number:MAB6521，R&D Systems）为一抗对猪血清中的重组猪白细胞介素2及猪白细胞介素2-Fc融合蛋白进行蛋白免 疫印迹试验，如图11可知重组猪白细胞介素2在反应3h后已经被血清中的酶消化殆尽，而重 组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白在血清中120h仍然保持稳定。由此可见，本发明制备的猪白细 胞介素2-Fc融合蛋白与重组猪白细胞介素2相比具有较高的稳定性，延长了其体内半衰期，达 到了长效给药的效果。