基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测方法及探针和引物组合

摘要

本发明公开了一种基于运动蛋白基因(MovementProtein,MP)的黄瓜绿斑驳花叶病毒（

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测方法，以及在该方法中应用到的检测用探针和引物组合。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle moasic virus,CGMMV)隶属番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)烟草花叶病毒属( Tobamovirus)，是严重危害葫芦科作物的重要病毒之一，为典型的种传病毒。该病毒于1935年在英国的黄瓜上首次发现并报道，因此命名为黄瓜病毒3(CV3)和黄瓜病毒4(CV4),由Anisworth记述。CGMMV株系众多，包括英国和欧洲早期报道的典型株系(Cucumber green mottle mosaic virus)、黄瓜桃叶珊瑚花叶株系(Cucumber aucuba mosaicvirus)，日本报道的西瓜株系(Watermelon strain)和日本黄瓜株系(Japanese cucumber strain)、洋东株系(Yodo strain)以及印度C株系(Indian strain C)。韩国报道了CGMMV-KW、CGMMV-KM4、CGMMV-HY和CGMMV-KOW等株系。近几年中国也有一些不同地理株系的报道，如分离自广西、辽宁等地的CGMMV-GX、CGMMV-LN、Liaoning等。

黄瓜绿斑驳花叶病毒在世界范围内广泛分布，主要分布于欧洲的英国、德国、荷兰、丹麦、芬兰、瑞典、希腊、俄罗斯、罗马尼亚、西班牙，南美的巴西，亚洲的以色列、巴基斯坦、伊朗、印度、沙特阿拉伯、日本、韩国等国家和地区。1987年中国台湾已有该病毒的报道。近年来在我国辽宁、广西、广东部分地区发现该病毒为害，造成西瓜、黄瓜、甜瓜、南瓜等农作物不同程度的减产甚至绝收，经济损失非常严重。

CGMMV的寄主范围比较窄，包括藜科、茄科和葫芦科植物，主要侵染葫芦科的黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜、丝瓜、西葫芦和葫芦等植物。CGMMV侵染引起的症状因寄主、环境及株系的不同而有差异，一般造成植株生长缓慢、矮化，叶片斑驳、凹凸、畸形及水疱，果肉变色、腐烂及纤维化。侵染黄瓜后在新叶上出现黄色的小斑点，后期呈花叶并带有浓绿色的突起，叶脉间褪色为绿带状；植株矮化，果实受损严重，表面上产生银白色条斑，产量可下降15%；侵染西瓜后表现为轻型叶斑驳，植株矮化，果实成熟期症状严重，果实表面形成浓绿色圆斑，内部出现果肉变色和腐烂。在甜瓜上造成茎端新叶出现黄斑，但随叶片老化症状减轻。南瓜植株感病后表现为矮化、绿脉和花叶的等症状。

黄瓜绿斑驳花叶病毒主要存在于花粉、种皮、病苗的胚轴、叶片、果实等组织中。是典型的种传病毒，黄瓜新鲜种子的传毒率为8%，保存5个月之后下降到1%，西瓜种子传毒率为5%，土壤带毒率很低。黄瓜叶甲有可能是媒介昆虫，目前没有蚜传的报道。介体菟丝子主要包括C. subinclusa和C.campestris。

CGMMV引起的病毒病在其发生历史上造成过严重危害。1935年英国最早报道在黄瓜上发生；1969年日本报道过该病的发生，当时被称为“魔芋病”；1974年德国温室黄瓜受到该病毒的影响面积达5%；1976年前苏联Georgia地区黄瓜上的发病率达到80～100%，导致黄瓜减产30%；1989年韩国报道该病在大田作物上大面积蔓延，造成巨大经济损失，1998年又在韩国的西瓜和黄瓜上为害，受灾面积达到463hm²，引起“西瓜血瓤病”，造成巨大损失。1987年中国台湾有该病发生危害的报道；2003年在广西的温室南瓜上分离到该病毒；2005年辽中地区的西瓜上大面积发生，造成严重危害，这是大陆首次在大田发生该病的报道。2004～2006年厦门出入境检验检疫局多次从日本进境的南瓜种子中截获该病毒。2009年甘肃局在进口自俄罗斯的黄瓜种子中到截获该病毒。2007年农业部862号公文《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为重要的对外检疫性有害生物。

CGMMV为直杆状病毒，粒子大小约300×18nm，核酸为线性单正链RNA，基因组长度约为6.5kb，为单组份。基因组编码4个蛋白分子，靠近5’端的126kDa和183kDa两个蛋白与病毒的复制有关，其中183kDa是由126kDa蛋白终止子超读产生的；另外两个蛋白分别为约30kDa的运动蛋白(Movement protein，MP)和17.5kDa的外壳蛋白(Coat protein，CP)，这两个蛋白分别由不同的亚基因组RNA表达产生。病毒基因组5’端和3’端分别含有一段非编码区(Noncoding region，NCR)，5’端含帽子结构，3’端有一个可以接受组氨酸的类似tRNA状结构。

半个世纪来，现代病毒学研究水平不断提高，病毒的检测技术也在不断发展和改进。目前病毒的检测方法主要包括枯斑和指示植物检测法 ，血清学检测法  ，酶标免疫吸附法(ELISA) ， 电镜负染检测法， 免疫电镜检测法， 电镜超薄切片法以及常规PCR检测方法。

C. Varveri采用DAS-ELISA( Double-antibody sandwich ELISA)和F(ab')2-ELISA两种酶联免疫吸附法对希腊分离物进行检测，并比较了两种方法的检测灵敏度，后者比前者灵敏性高出10³倍；Shim用DAS-ELISA方法对来自葫芦上表现CGMMV症状的样品进行了定性检测；Choi等将RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay，放射免疫沉淀检测法)发展为multi–RIPA技术,并同时检测西瓜、黄瓜、西葫芦和瓠子上的 CGMMV ,multi-RIPA检测CGMMV的最低量为50ng/ml；Kawai等使用M-ELISA ( modified ELISA) 检测黄瓜种子，结果比标准ELISA更灵敏，其灵敏度相当于检测到800 粒健康种子中的1粒病种。血清学方法是目前普遍运用的常规检测方法，可操作性强，检测结果相对可靠。但是该方法成本较高，周期性长，且灵敏度有限，难以检测含量很少的病毒。

RT-PCR是反转录RNA和利用单链寡核苷酸引物对特异性DNA片段进行体外快速扩增的方法。张永江等(2008) 对葫芦、西瓜、甜瓜 3种作物的不同种质资源以及同种种质资源的不同处理进行了 DAS- EL IS A和 RT-PCR检测，结果显示受侵染的不同种质资源均可带毒，而RT-PCR方法的灵敏度远高于ELISA，并且建立了直接从葫芦种子中检测CGMMV的技术方法。黄静等(2007)用该方法检测了黄瓜、葫芦、南瓜三种作物的病叶和苋色藜枯斑中的CGMMV病毒，均可以扩增到650bp的目的条带，但是条带清晰度一般，说明检测水平有限。此外，保存于-20℃中的冷冻黄瓜病叶经多次试验均无目的条带，不能对试验条件下保存的样品进行准确检测是该方法的一大缺陷。李红霞等(2007)运用RT-PCR方法对采自甘肃的南瓜果实进行检测，检测结果证明果实中存在CGMMV病毒。Slavokhotov等(2007) 针对CP基因设计引物，采用RT-PCR方法检测到了分离自俄罗斯的两个CGMMV病毒株系。Chang等(2005)采用RT-PCR方法从韩国西瓜叶片中检测出CGMMV病毒，得到646bp的CP基因，明确为CGMMV-HY1株系。邓丛良等(2008) 将纳米磁珠(Magnetic Nano Particles, MNP)和RT-PCR结合，建立了检测CGMMV的新方法。用纳米磁珠提取阳性材料中的RNA，用三组引物分别进行RT-PCR扩增，检测CGMMV并进行灵敏度测定，结果发现该方法可以检测出10ng植物叶组织中的CGMMV，灵敏度是常规检测方法的1/10。虽然在RNA提取过程中节省了时间和步骤，但是该方法依赖高灵敏度的抗体，提高了成本，且在检测灵敏度并没有良好的改观，所以普及和运用受到限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种针对CGMMV的运动蛋白基因（MP gene）设计一对特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物和荧光探针，并优化反应体系和反应程序，建立了实时荧光RT-PCR快速检测CGMMV病毒的方法。特异性测试结果表明该方法具有很强的特异性，可以从TMV属中10多种病毒中特异性检出CGMMV病毒，并且可同时检测四个CGMMV的不同分离物。该方法灵敏性远高于常规RT-PCR方法的检测结果，同时该方法也可直接运用于葫芦科带毒种子的检测，大大缩短了检测时间，检测结果准确可靠。

1996年美国 Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术( Real - time fluorescent quantitative PCR , FQ - PCR)，即在PCR检测过程中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术实现了PCR方法从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，具有灵敏度高、特异性强、重现性强、快速高效、成本低廉、自动化程度高、有效解决PCR 污染问题等特点，现已广泛运用于人类疾病、动物病毒、及动植物疾病检测和预防等诸多领域。

本发明所采用的技术方案是：该基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测用探针和引物组合包括上游引物MMV-F1、下游引物MMV-R1和荧光探针MMV-1，其序列分别如下：

MMV-F1：5’- CACCTTTATGTCACATTGTTG-3’；

MMV-R1：5’- GAATGCATCCTTGTGTCAAC -3’；

MMV-1：5’-FAM-CTACAGGATTCCGGTACGTTCCAT-TAMRA-3’。

所述基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：

（1）取待测样品提取植物组织总RNA；

（2）以总RNA为模板，引入所述下游引物MMV-R1进行反转录模板cDNA的合成；

（3）将所述上游引物MMV-F1、所述下游引物MMV-R1和所述荧光探针MMV-1置于荧光PCR仪中进行实时荧光PCR扩增反应；

（4）反应结束后，荧光PCR仪读取CT值并判断检测结果。

在上述步骤（2）中进行反转录模板cDNA的合成时，其反应体系为：Total RNA 2.5μL，5×PCR缓冲液 2μL，dNTP 1μL，下游引物MMV-R1 (10μmol/L) 2μL，反转录酶 0.5μL，加ddH₂O至总体系10μL；反应条件：37℃ 15min，85℃ 5sec，16℃ 30sec，反应结束后将模板于-4℃保存备用。

在上述步骤（3）中的实时荧光PCR反应体系为：2×premix Taq(Real Time)混合反应液10μL，上下游引物(MMV-F1，MMV-R1，10μmol/L)各1.25μL，荧光探针MMV-1 1μL，模板cDNA 2μL，加ddH₂O补足到20μL；反应条件为：95°C，30s；95°C 5s，60°C 30s，45个循环。

上述步骤中，所述上游引物MMV-F1和所述下游引物MMV-R1的使用浓度范围为0.1～0.8μmol/L。

进一步地，所述上游引物MMV-F1和所述下游引物MMV-R1的使用浓度均为0.5μmol/L。

所述荧光探针MMV-1的浓度范围为0.05～0.5μmol/L。

更进一步地，所述荧光探针MMV-1的浓度范围为0.25μmol/L。

本发明的有益效果是：本发明针对检疫性有害生物黄瓜绿斑驳花叶病毒（Ccucumber green mottle mosaic virus，CGMMV），设计了特异性引物和荧光探针，建立了实时荧光PCR快速检测CGMMV的方法，并将该方法直接运用于带毒种子的检测。该方法具有快速准确、灵敏度高、并且全程闭管，无需电泳检测等优点，减少了有毒试剂的接触，检测时间也缩减到2个小时之内，极大的提高了效率。整个过程采用荧光信号放大及计算机全程控制，减少人为误差，提高了灵敏度，试验证明该方法比体系优化过的普通RT-PCR灵敏度要高近100倍，适用于病毒低含量的检测。

附图说明

图1是实时荧光PCR检测CGMMV特异性检测结果分析示意图，其中，C4：来自广东雷州的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV-GD-LZ），D4：来自广东高州的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV-GD-GZ），E4：来自广州陆丰的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV-GD-LF），E5：来自Agdia的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV-DIA），F4：番茄花叶病毒（ToMV），G4：齿舌兰环斑病毒（ORSV），H4：番木瓜环斑病毒（PRSV），F5：Kyuri绿斑驳花叶病毒（KGMMV），G5：小西葫芦绿斑驳花叶病毒（ZGMMV），H5：烟草花叶病毒（TMV），F6：西瓜花叶病毒2号（WMV-2），G6：辣椒轻斑驳病毒（PMMV），H6：车前草花叶病毒（RMV），F7：土传小麦花叶病毒（WSBMV），G7：标准对照组，H7：水对照组；

图2 是带毒种子中CGMMV病毒检测结果分析示意图，其中，D7：黄瓜带毒种子1（CGMMV-Cu1），D8：黄瓜带毒种子2（CGMMV-Cu2），D9：黄瓜带毒种子：（CGMMV-Sq），D10：西葫芦带毒种子（CGMMV-Pu），G10：黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV-GD-LZ）对照组，G11：标准对照组，D11：水对照组；

图3是所述实时荧光PCR检测CGMMV灵敏度的动力学曲线，其中，1-2：CGMMV病毒10倍稀释液；3-4：10²倍稀释液；5-6：10³倍稀释液；7-8： 10⁴倍稀释液；9-10：10⁵倍稀释液；11-12：10⁶倍稀释液；13-14：10⁷倍稀释液；

图4是所述实时荧光PCR检测CGMMV灵敏度的标准曲线。

具体实施方式

下面对本发明做详细的说明。该基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：

一、选择供试验材料。本发明采用的供试验的病毒样品见表1。

                     表1 供试验病毒样品

本发明使用到的主要试剂和仪器如下：PCR扩增试剂由上海生工生物工程技术有限公司提供；引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成；其他试剂按普通分子生物学实验操作规定。荧光PCR仪：罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪； 台式高速离心机Eppendorf 5415D。

二、取待测样品提取植物组织总RNA。

采用液氮进行供试样品的前处理，植物总RNA提取按照试剂盒(TaKaRa Code:D9108A)方法,操作步骤如下：

(1)  于冰箱中取冷冻样品置于预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨至粉末状；

(2)  迅速将粉末状样品转移至2ml离心管中，加入1ml RNAiso Plus，剧烈振荡混匀，直至样品呈匀浆状，室温静置5min；

(3)  12000g，4℃离心5min；

(4)  小心吸取上清(1ml)，转移至新的2ml离心管中。   

(5)  向上述溶液中加入1/5体积的氯仿(200μL)，盖紧管盖，剧烈震荡15sec，待溶液充分乳化后，室温静置5min；

(6)  12000g，4℃离心15min；

(7)  从离心机中小心取出离心管，此时溶液分三层。小心吸取上层清液(400μL)，转移至新的2ml离心管中；

(8)  向上述清液中加入等体积(400μL)的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温静置10min；

(9)  12000g，4℃离心10min，此时管底有白色沉淀；

(10) 小心地弃去上清，沿离心管管壁缓慢加入1ml预冷的75% 乙醇，切勿碰触到沉淀。轻轻地上下颠倒离心管洗涤沉淀；

(11) 12000g，4℃离心5min，小心地弃去乙醇，保留沉淀；

(12) 室温状态下干燥10分钟左右；

(13) 待乙醇充分晾干之后，向离心管中加入60μL，RNase-free H2O溶解沉淀；

(14) 溶解后的RNA保存于-20℃冰箱,备用。

三、根据GenBank中已登录的CGMMV不同株系的核苷酸序列，利用DNAStar软件包PrimerSelect设计引物和探针。引物和探针的合成由上海生物工程有限公司完成，引物和荧光探针的相关信息如表2。

                   表2 特异性引物和探针

四、以总RNA为模板，引入所述下游引物MMV-R1进行反转录模板cDNA的合成。

以总RNA为模板，以下游引物MMV-R1作引物反转录合成cDNA，0.2mlPCR管中加入：Total RNA 2.5μL， 5×PCR缓冲液 2μL，dNTP 1μL，MMV-R1 (10μmol/L) 2μL，反转录酶 0.5μL，加ddH₂O至总体系10μL。反应条件：37℃ 15min，85℃ 5sec，16℃ 30sec，反应结束后将模板于-4℃保存备用。

五、将所述上游引物MMV-F1、所述下游引物MMV-R1和所述荧光探针MMV -1置于荧光PCR仪中进行实时定量荧光PCR扩增反应。其反应体系为：2×premix Taq(Real Time)混合反应液10μL，上下游引物(MMV-F1，MMV-R1，10μmol/L)各1.25μL，荧光探针MMV-1 1μL，模板cDNA 2μL，加ddH₂O补足到20μL；反应条件为：95°C，30s；95°C 5s，60°C 30s，45个循环。具体如下：

1、引物和探针浓度的优化

所述上游引物MMV-F1和所述下游引物MMV-R1的使用浓度范围为0.1～0.8μmol/L，所述荧光探针MMV-1的浓度范围为0.05～0.5μmol/L。所述上游引物MMV-F1和所述下游引物MMV-R1的使用浓度按0.25μmol/L为设置梯度，所述荧光探针浓度设置为0.1μmol/ L、0.25 μmol/ L、0.5μmol/ L和0.75μmol/ L四个浓度，对引物和探针浓度进行不同的配比试验，根据CT 值和曲线形态，确定最佳浓度以及配比。取所述上游引物MMV-F1和所述下游引物MMV-R1的使用浓度均为0.5μmol/L，所述荧光探针MMV-1的浓度为0.25μmol/L。

2、循环参数的优化

根据实验室使用的罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪，对退火温度、循环参数等试验条件进行了优化，以期待达到最佳的扩增效率。

3、特异性检测

用试验建立的荧光PCR技术对烟草花叶病毒属（Tobamovirus）与CGMMV同源性高的九种病毒，以及一个土传小麦花叶病毒进行特异性检测。

4、灵敏度检测

将反转录的CGMMV阳性样品产物cDNA，分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 七个浓度梯度，加入到荧光PCR反应体系中，进行灵敏度检测。每个梯度做两个重复。

六、PCR反应结束后，通过收集的荧光曲线CT值与已知标准曲线CT值比较，判断检测结果。

七、结果与分析。

1、特异性验证

对表1中的样品进行荧光PCR反应，检测引物和探针的特异性。结果如图1和图2所示，所有CGMMV病毒不同分离物均有特异性扩增，Ct值在22～25之间，其他几种病毒全部没有荧光信号。表明该试验采用的这组引物具有很强的特异性。

2、灵敏度检测

实时荧光PCR灵敏度检测结果见图3和图4，CGMMV阳性检测样品的所有测试浓度都检测到荧光信号，Ct值与DNA模板浓度相关，模板浓度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6时，扩增的Ct值分别为14.6、18.1、21.6、24.9、28.0、31.6。在10^-7的浓度下荧光PCR扩增曲线明显，两个平行样间的 Ct值分别为34.66和35.49，体现了良好重复性，表明该方法的检测限度在10^-7以下。

自2007 年1 月以来，黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR快速检测技术在珠海检验检疫局各分支口岸推广应用，在检验检疫口岸进境蔬菜种子CGMMV检疫工作中发挥了重要作用，同时与广东省植物检疫站合作使用该项成果对葫芦科种子的产地检疫和调运检疫以及种子市场检疫执法检查行动，调查发现，广东省主要有雷州市、高州市、陆丰市和海丰县发生黄瓜绿斑驳花叶病毒病，发生面积2927亩，抽查检测葫芦科种子400 余批次中，先后查出冬瓜、南瓜等带毒种子约975千克，及时按照有关法律法规采取积极有效的检疫处理措施，有效地阻止疫情传播，保护了我国农业生产安全。因此，该项技术在有效抵御CGMMV入侵、保护我国农林业生产安全、维护生态平衡、保证公共卫生安全以及对外贸易方面所获得的生态效益和社会效益巨大。

本发明依据MP基因序列特征，参照GenBank中烟草花叶病毒属(Tobamovirus)其他种序列，设计筛选了特异性引物和探针，优化反应体系和反应条件，建立特异性检测CGMMV的实时荧光PCR检测方法。检测结果表明，建立的实时荧光定量PCR检测方法能够检测出10⁷稀释浓度的样品，灵敏度远远高于常规PCR。将该方法直接用于检测带毒种子，分别从冬瓜、南瓜、黄瓜种子和西葫芦种子中检测出CGMMV，实现了对带毒种子的快速、准确和稳定的检测。本发明建立的特异性检测CGMMV的实时荧光PCR检测方法，具有准确灵敏，时效性强，成本低，检测范围广的特点，非常适合在检验检疫口岸的推广应用。

本发明针对CGMMV的运动蛋白基因（MP gene）设计一对特异性检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物和荧光探针，并优化反应体系和反应程序，建立了实时荧光PCR检测CGMMV病毒的方法。特异性测试结果表明该方法具有很强的特异性，可以从TMV属中10多种病毒中特异性检出CGMMV病毒，并且可同时检测四个CGMMV的不同分离物。该方法灵敏性远高于常规RT-PCR方法的检测结果，同时该方法也可直接运用于葫芦科带毒种子的检测，大大缩短了检测时间，检测结果准确可靠。

本发明可应用于生物物种分子诊断领域。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  陈卫东、廖力、王岚、梁玉英、权永兵、迟远丽、徐淼锋

<120>  基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测方法及探针和引物组合

<130> 

<160>  4    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)…(21)

<223>  上游引物MMV-F1

<400>  1

cacctttatg tcacattgtt g                                  21

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)…(20)

<223>  下游引物MMV-R1

<400>  2

gaatgcatcc ttgtgtcaac                                      20

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

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<221>  misc_feature

<222>  (1)… (24)

<223>  荧光探针MMV-1

<400>  3

ctacaggatt ccggtacgtt ccat                                 24

 

<210>  4

<211>  1585

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)…(1585)

<223>  黄瓜绿斑驳花叶病毒MP基因片段扩增重组质粒序列

<400>  4

catgccaacg gctgtattgt ttaccctgac cctttaaaat taattagtaa attaggtaat 60 aagagtcttg tagggtatga gcatgttgag gagtttcgta tatctctcct cgacgttgct 120 catagtttgt ttaatggtgc ttatttccat ttactcgacg atgcaatcca cgaattattt 180 cctaatgctg ggggttgcag ttttgtaatt aattgtttgt gtaagtattt gagtgataag 240 cgccttttcc gtagtcttta catagatgtc tctaagtaag gtgtcagtcg agaactcgtt 300 gaaacctgag aagtttgtca aaatctcttg ggtcgataag ttgctcccta actatttttc 360 cattcttaag tatttatcta taactgactt tagtgtagtt aaagctcaga gctatgaatc 420 cctcgtgcct gtcaagttgt tgcgtggtgt tgatcttaca aaacaccttt atgtcacatt 480 gttgggcgtt gtggtttctg gtgtatggaa cgtaccggaa tcctgtaggg gtggtgctac 540 tgttgctctg gttgacacaa ggatgcattc tgttgcagag ggaactatat gcaaattttc 600 agctcccgcc accgtccgcg aattctctgt taggttcata cctaattatt ctgtcgtggc 660 tgcggatgcc cttcgcgatc cttggtcttt atttgtgaga ctctctaatg tgggtattaa 720  agatggtttc catcctttga ctttagaggt cgcttgttta gtcgctacaa ctaactctat 780 tatcaaaaag ggtcttagag cttctgtagt cgagtctgtc gtctcttccg atcagtctat 840 tgtcctagat tctttatccg agaaagttga acctttcttt gacaaagttc ctatttcagc 900 ggctgtaatg gcaagagatc ccagttatag gtctaggtcg cagtctgtcg gtggtcgtgg 960 taagcggcat tctaaacctc caaatcggag gttggactct gcttctgaag agtccagttc 1020

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