三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物、其制备方法和包含所述衍生物作为活性成分用于诊断或治疗血管发生相关疾病的药物组合物

摘要

本发明涉及三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物、其制备方法和包含所述衍生物作为活性成分用于诊断或治疗血管发生相关疾病的药物组合物。本发明的三羰基锝-99m或铼188标记的环RGD衍生物对在肿瘤诱导的血管发生作用中活化的αvβ3整合素(也称作玻连蛋白受体)具有亚纳摩尔的高亲和力，反映为移植了癌细胞的动物在初始摄入三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物后的高肿瘤图像，并且专一地作用于已经选择性活化了αvβ3整合素的癌细胞，这是因为与现有已知的放射性同位素标记的环RGD衍生物相比肝和肠摄入大幅降低。这些结果表明：当通过尾静脉向肿瘤动物模型注射后，与仅注射盐水相比，铼-188标记的衍生物(与锝-99m标记的使用相同前体的治疗性核素)有效抑制肿瘤的生长，并且证明有治疗效果，因此可用作诊断或治疗血管发生相关疾病的药物。

说明书

发明背景

1.技术领域

本发明涉及三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物、其制备方法和包含所述衍生物作为活性成分用于诊断或治疗血管发生相关疾病的药物组合物。

2.相关领域的描述

因为当今医学领域具有完成对癌症之治疗的主要目标，所以核医学诊断和治疗的技术被认为比以往任何时候都重要，所述技术是能够利用特异性针对目标分子的放射示踪剂在分子水平上用于疾病的非侵入性技术。

一般使用放射性药物如[¹⁸F]-FDG(2-氟-脱氧-D-葡萄糖)利用正电子发射断层显象(positron emission tomography，PET)诊断体内癌症。但是，[¹⁸F]-FDG不能诊断脑肿瘤或区分炎症与肿瘤，并且还具有不能提供血管发生和转移征兆相关信息的局限性。

血管发生是原发性或转移性肿瘤中必不可少的。没有来自新血管的营养物和氧供应，肿瘤组织无法生长超过1～2mm³。即，血管发生导致转移癌通过新血管形成中的血管在其他部位形成。因此，靶向新血管的成像具有一般性地应用于大多数实体肿瘤的潜力。就治疗而言，常规化疗集中于迅速生长的癌细胞，因此表现出对正常细胞(包括骨髓细胞和胃肠细胞)的毒性。与以上相比，靶向血管发生的治疗(放射治疗)导致相对小的与长期施用相关的副作用以及较低的发生耐受的风险，这是由于该治疗集中于血管细胞。

众所周知，癌症的生长机制开始于癌组织附近的血管具有过多的α_vβ₃整合素。整合素是与细胞的黏附和运输相关的由α和β亚基组成的异二聚体膜蛋白质。在各种类型的整合素中，整合素α_vβ₃(还称为玻连蛋白受体)被认为在血管发生中很重要。这种特别的整合素在正常血管内皮细胞中并不表达，因为该整合素仅在当肿瘤触发的血管发生被活化时才表达。众所周知，Arg-Gly-Asp(RGD)肽序列与这种整合素结合。基于该序列，环Arg-Gly-Asp(cRGD)肽化合物被报道为具有较高结合亲和力以阻断整合素α_vβ₃正常功能的拮抗剂，并且通过向这种特别的化合物中引入多种放射性同位素，全世界很多研究组已经实施了对癌症血管发生的成像。

用于PET的放射性同位素例如氟-18、镓-68和铜-64以及用于SPECT的锝-99m、碘-123和铟-111已经被用于多种环RGD衍生物中，添加单糖以提高放射示踪剂的药物代谢动力学，或添加二聚或四聚环RGD以进一步提高结合亲和力

(Haubner，R.，Wester，H-J.，Weber，W.A.，Mang，C.，Ziegler，S.I.，Goodman，S.L.，Senekowitsch-Schmidtke，R.，Kessler，H.，Schwaiger，M.，Cancer Res.，2001，61：1781-1785；Jeong，J.M.，Hong，M.K.，Chang，Y.S.，Lee，Y.S.，Kim，Y.J.，Cheon，G.J.，Lee，D.S.，Chung，J.K.，Lee，M.C.，J.Nucl.Med.，2008，49：830-836；Chen，W.，Park，R.，Tohme，M.，Shahinian，A.H.，Bading，J.R.，Conti，P.S.Bioconjugate Chem.，2004，15：41-49；Liu，S.，Hsieh，W.Y.，Kim，Y.S.，Mohammel，S.I.，Bioconjugate Chem.，2005，16：1580-1588；Haubner，R.，Wester，H-J.，Reuning，U.，Senekowitsch-Schmidtke，R.，Diefenbach，B.，Kessler，H.，Stocklin G.，Schwaiger，M.，J.Nucl.Med.，1999，40：1061-1071；Janssen，M.，Oyen，W.J.G.，Dijkgraaf，I.，Massuger，L.F.A.G.，Frielink，C.，Edwards，D.S.，Rajopadyhe，M.，Boonstra，H.，Corsten，F.H.M.，Boerman，0.C.，Cancer Res.，2002，62：6146-6151；Wu，Y.，Zhang，X.，Xiong，Z.，Cheng，Z.，Fisher，D.R.，Liu，S.，Gambhir，S.S.，Chen，X.，J.Nucl.Med.，2005，46：1707-1718.)。

尽管迄今为止已经开发了多种的放射性同位素标记的环RGD衍生物，但是例如在肝中的高积累和从大肠排泄缓慢的缺点依然使得用于诊断的放射示踪剂的效率受限(因为肿瘤与正常组织的低积累比值)。此外，临床研究尚不积极，尤其是在放射治疗的情况中，因为在放射治疗中治疗性放射性同位素标记的放射示踪剂可不仅作用于肿瘤，而且作用于正常组织。

在各种放射性同位素中，锝-99m和铼-188被认为在实用方面很突出，这是因为能够通过单光子发射计算机化断层显象(single photon emissioncomputed tomography，SPECT)简单标记方法和分离工艺进行诊断，而仅需要发生器(generator)。此外，可利用相同前体选择性地标记铼-188用于放射治疗目的。

然而，标记锝-99m和铼-188的常规方法具有缺点，例如：标记锝-99m或铼-188的口袋大小(pocket size)很大，低体内稳定性，以及前体难以合成，这反过来以很多方式限制了高效放射示踪剂的开发。同时，三羰基锝-99m和三羰基铼-188作为高效放射示踪剂是可接受的，这是鉴于例如这样的特征：前体容易合成，以及标记口袋小且在代谢上稳定，以及还能够在制备过程中通过简单变化而改变放射示踪剂的电荷。此外，这些放射示踪剂具有良好的体内稳定性并且在代谢之后被迅速清除而不在甲状腺积累，能够实现相对较好的成像结果。三羰基锝-99m或三羰基铼-188的用途尚未被广泛知晓，但是全世界都在对其进行持续研究以开发新的放射性药物。

因此，本发明的发明人合成了新的三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物用于靶向整合素α_vβ₃(主要的生物标志物)，用于对癌症血管发生进行成像和放射治疗，并且在通过多种生物评价确证三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物能够诊断和治疗与血管发生相关的多种疾病之后完成了本发明。

发明概述

本发明的一个目的是提供有利地用于诊断或治疗血管发生相关疾病的三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物或其可药用盐。

本发明的另一目的是提供三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物的制备方法。

本发明的又一个目的是提供三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物的前体。

本发明的又一个目的是提供包含三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物或其可药用盐作为活性成分的药物组合物，用于诊断或治疗血管发生相关疾病。

为了实现上述目的，本发明提供了式1的三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物或其可药用盐。

[化学式1]

其中，M、R¹、X和Y如说明书中的定义。

此外，本发明提供了三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物的制备方法。

此外，本发明提供了三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物的前体。

此外，本发明提供了包含三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物或其可药用盐作为活性成分的药物组合物，用于诊断或治疗血管发生相关疾病。

根据本发明的三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物与整合素α_vβ₃(其通常被称为玻连蛋白受体，在肿瘤诱导的血管发生中活化)具有亚纳摩尔水平的高亲和力，反映为在初始摄入三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物后移植肿瘤细胞的动物模型中的高分辨率肿瘤成像，相比于常规已知的放射性同位素标记的环RGD衍生物显著降低了肝和大肠的摄入，因此仅对整合素α_vβ₃阳性的癌细胞有效。基于上述发现，证实与仅注射盐水溶液的肿瘤动物模型相比，当向肿瘤动物模型的尾静脉静脉内注射后，使用与锝-99m相同前体的铼-188标记的衍生物表现出有效的生长抑制作用和治疗效果，因此可有利地用作为诊断或治疗血管发生相关疾病定制的药物。

附图简述

通过参照附图阅读对某些示例性实施方案的描述，本发明的上述和/或其他方面将更加显而易见，其中：

图1是示出了根据本发明一个实施方案的三羰基锝-99m标记之环RGD衍生物在/从肿瘤模型小鼠体内的摄取率和排泄率之测量结果的图；

图2是示出了根据本发明另一个实施方案的三羰基锝-99m标记之环RGD衍生物在/从肿瘤模型小鼠体内的摄取率和排泄率之测量结果的图；

图3是示出了根据本发明又一个实施方案的三羰基锝-99m标记之环RGD衍生物在/从肿瘤模型小鼠体内的摄取率和排泄率之测量结果的图；

图4是肿瘤模型小鼠体内的根据本发明的一个实施方案的三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物的SPECT图像。

图5是肿瘤模型小鼠体内的根据本发明的另一个实施方案的三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物的SPECT图像。

图6是肿瘤模型小鼠体内的根据本发明的又一个实施方案的三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物的SPECT图像。

图7是示出了根据本发明的一个实施方案的三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物在肿瘤模型小鼠体内时间依赖方式的器官摄取水平和摄取比值，以及每个时间的肿瘤与肝、肿瘤与肾、肿瘤与正常细胞的摄取率。

图8是在小鼠施用环RGD衍生物(cRGDyV，18mg/kg)后肿瘤模型小鼠体内的根据本发明的一个实施方案的三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物的SPECT图像。

图9示出了根据本发明的一个实施方案的三羰基铼-188标记的环RGD衍生物对模型小鼠肿瘤大小和体重的影响。

图10是表明根据本发明的一个实施方案的三羰基铼-188标记的环RGD衍生物对模型小鼠肿瘤大小和体重之影响的SPECT图像和在目标器官区域之摄取率的图。

图11在施用根据本发明的一个实施方案的三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物后使用CD-31血液染色和Q-点-二聚体RGD衍生物得到的共聚焦显微镜图像，表明了三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物对肿瘤大小和肿瘤中摄取率的影响。

发明详述

接下来将详细说明本发明。

本发明提供了化学式1所示三羰基锝-99m或铼标记的环RGD衍生物或其可药用盐：

[化学式1]

其中，M是^99mTc、¹⁸⁸Re或^185/187Re，

R¹ 是N，N(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂CONH或N(CH₂CONH)_nCH₂CH₂CONH，

X是直接键、

A¹和A²各自是选自天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸的氨基酸，

R²是NH或NH(Z)_nCH₂CH₂CONH，

Z是-CH₂CH₂O-或-CH₂CONH-，

N是0至8的整数，

Y是

R³是H或OH，

R⁴是-(CH₂)_m-或-(CH₂)_m-COO-，

M是1至8的整数，并且

Y与R¹直接相连或与X中的R²相连。

根据本发明的三羰基锝-99m或铼标记的环RGD衍生物可优选选自如下所示的一组化合物：

[化学式1A]

[化学式1B]

[化学式1C]

其中，M、R¹、R²、R³、R⁴、A¹和A²如化学式1中的定义。

根据本发明的一个优选实施方案的化学式1所示三羰基锝-99m或铼标记的环状衍生物如下。

根据本发明的一个优选实施方案的化学式1所示三羰基锝-99m或铼-188标记的环状衍生物如下。

1)环{(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

2)环{(三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

3)环{(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

4)环{(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-NH₂(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

5)环{(三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-NH₂(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

6)环{(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-NH₂(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

7)环{(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

8)环{(三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

9)环{(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}；

10)(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂；

11)(三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂；

12)(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂；

13){三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂，n＝0至8)；

14){三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂，(n＝0至8)；

15){三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂，(n＝0至8)；

16){三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{(聚乙二醇)_n-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]}₂，(n＝0至8)；

17){三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{(聚乙二醇)_n-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]}₂，(n＝0至8)；

18){三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{(聚乙二醇)_n-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]}₂，(n＝0至8)；

19)(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-{天冬氨酸-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄；

20)(三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-{天冬氨酸-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄；

21)(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-{天冬氨酸-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄；

22){三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{天冬氨酸-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄，(n＝0至8)；

23){三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{天冬氨酸-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄，(n＝0至8)；

24){三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{天冬氨酸-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄，(n＝0至8)；

25){三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{天冬氨酸-(聚乙二醇)_n-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄，(n＝0至8)；

26){三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{天冬氨酸-(聚乙二醇)_n-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄，(n＝0至8)；以及

27){三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)_n-天冬氨酸}-{天冬氨酸-(聚乙二醇)_n-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂}₄，(n＝0至8)。

根据本发明的化学式1的环RGD衍生物可包含1至4个RGD环。

可以以可药用盐的形式使用根据本发明的化学式1所示环RGD衍生物。所述可药用盐可有利地是由药学上或生物学上可接受的多种有机酸或无机酸形成的酸加成盐。合适的有机酸可包括例如羧酸、膦酸(phosphonicacid)、磺酸、乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、乙醇酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、己二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、邻苯二甲酸、苯乙酸、苯磺酸、2-萘磺酸、硫酸甲酯、硫酸乙酯或硫酸十二酯，且合适的无机酸可包括例如盐酸、硫酸或磷酸。

根据本发明的化学式1所示环RGD衍生物可不仅包含可药用盐，而且可包含可用已知方法制备的任何盐、水合物和溶剂合物。

此外，本发明提供了用于制备化学式1的环RGD衍生物的方法。

具体地，可通过反应式1和2所示方法制备根据本发明的环RGD衍生物。

制备方法1

根据本发明，如反应式1所示，通过包括以下步骤的方法制备标记有放射性同位素(即，三羰基锝-99m或三羰基铼-188)的环RGD衍生物：用式2前体化合物与具有锝-99m或铼-188的三羰基部分反应以制备标记有三羰基锝-99或三羰基铼-188的环RGD衍生物。

[反应式1]

其中，M是^99mTc或¹⁸⁸Re，R¹、X和Y如化学式1中的定义。

具体地，可按以下制备标记有三羰基锝-99m或三羰基铼-188的环RGD衍生物：将三羰基锝-99m或三羰基铼-188化合物(^99mTc(CO)₃(H₂O)₃⁺或¹⁸⁸Re(CO)₃(H₂O)₃⁺)在0.5～5mL蒸馏水溶剂中稀释，将其放到具有与化学式2前体的容器中，通过在70～80℃下加热(对于锝-99m标记，加热30分钟，或者对于铼-188标记，加热60分钟)使内容物反应。

对于根据本发明的制备方法1，三羰基锝-99m或三羰基铼-188化合物可通过已知的方法或优选地通过以下文献的方法合成：

参考文献：

Alberto，R.，Schibli，R.，Egli，A.，Schubiger，A.P.，Abram，U.，Kaden，T.A.，J.Am.Chem.Soc.1998，120：7987-7988；Alberto，R.，Schibli，R.，Schubiger，A.P.，Abram，U.，Pietzsch，H-P.，Johannsen，B.，J.Am.Chem.Soc.1999，121：6076-6077；Schibli，R.，Netter，M.，Scapozza，L.，Birringer，M.，Schelling，P.，Dumas，C.，Schoch，J.，Schubiger，P.A.，J.Organomet.Chem.2003，668：67-74；Schibli，R.，Schwarzbach，R.，Alberto，R.，Ortner，K.，Schmalle，H.，Dumas，C.，Egli，A.，Schubiger，P.A.Bioconjuate Chem.2002，13：750-756。

可额外地将所制备的标记有三羰基锝-99m或三羰基铼-188的环RGD衍生物在室温冷却并且通过tC18 Sep-Pak盒(cartridge)或高效液相色谱(HPLC)分离/纯化。

制备方法2

在本发明的一个实施方案中，可通过包括以下步骤的方法制备引入了非放射性同位素(即，三羰基^185/187Re)的环RGD衍生物：将(NEt₄)₂Re(CO)₃Br₃放入化学式2的前体中，使内容物反应以形成化学式1a的引入了三羰基^185/187Re的环RGD衍生物，如以下反应式所示：

[反应式2]

其中，R¹、X和Y如化学式1中的定义，并且化学式1a包含在化学式1中。

具体地，可按以下制备化学式1a的引入了三羰基^185/187Re的环RGD衍生物：将试剂(NEt₄)₂Re(CO)₃Br₃在0.5～5mL蒸馏水溶剂中稀释，将所得物放到装有化学式2前体的反应容器中，通过在70～80℃下加热55～65分钟使内容物反应。

化学式1a的引入了三羰基^185/187Re的环RGD衍生物是反应式1的标记有三羰基锝-99m或三羰基铼-188的环RGD衍生物的标准化合物，并且与标记有三羰基铼-188的环RGD衍生物相同，因此在HPLC中具有与标记有三羰基锝-99m的环RGD衍生物相同的保留时间(有约1～2分钟的差异)。

可额外地将引入有所制备^185/187Re的环RGD衍生物在室温下冷却，并用tC18 Sep-Pak盒或高效液相色谱(HPLC)分离/纯化。

此外，本发明提供了用于诊断或治疗(放射治疗)血管发生相关疾病的药物组合物，其包含式1的三羰基锝-99m或铼-188标记的环RDG衍生物或其可药用盐作为活性组分。

此外，本发明提供了用于诊断血管发生相关疾病的方法，其包括向对象施用诊断有效量的式1三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物或其可药用盐的步骤。

此外，本发明提供了用于治疗血管发生相关疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的式1三羰基铼-188标记的环RGD衍生物或其可药用盐的步骤。

根据本发明的式1环RGD衍生物是这样的化合物，其中三羰基锝-99m、三羰基铼-188或三羰基铼反应物与由胺和两个羟基羰基甲基组成的标记口袋相连，以形成具有三个羰基、胺以及两个羟基的以锝-99m为中心的八面体结构。

式1的环RGD衍生物可构成单体、二聚体、四聚体的环RGD，其中二聚的环RGD二聚体(当构建时)与整合素α_vβ₃(肿瘤血管发生的生物标志物)具有较高的亲和力，并且通过向天冬氨酸引入多个聚乙二醇链(环RGD与标记基团之间的接头)，从而形成了环RGD二聚体可同时与两个整合素α_vβ₃结合的二价结构，可以获得较高分辨率的肿瘤图像并且基于此可获得较好的治疗效果。基于在肿瘤移植小鼠中观察到的体内分布，证实由于血管内皮细胞中包含三羰基锝-99m或三羰基铼-188环RGD衍生物的口袋基团(pocket group)的负电荷(-)，具有环RGD二聚体的化合物迅速从肝和大肠排泄。因此，获得了较高的肿瘤与正常器官比值。

此外，通过构建环RGD四聚体，以及通过向天冬氨酸引入多个聚乙二醇链(环RGD与标记基团之间的接头)，根据本发明的式1环RGD衍生物可与整合素α_vβ₃(用于肿瘤诱导血管发生的生物标志物)具有较高的亲和力，形成了在其中环RGD四聚体可同时与多个α_vβ₃整合素结合的结构。结果，可以得到较高摄取的肿瘤图像，并且基于此可获得较好的治疗效果。

此外，构成环RGD四聚体的环RGD衍生物也对α_vβ₃整合素具有高亲和力，并且迅速从肝和大肠排泄，这是因为血管内皮细胞中的包含三羰基锝-99m或三羰基铼-188标记之环RGD衍生物的口袋基团的负电荷(-)。

因此，根据本发明的式1环RGD衍生物在肿瘤诱导血管发生中对整合素α_vβ₃(所谓的玻连蛋白受体)具有亚纳摩尔水平的高水平亲和力，因此从初始摄入了三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物的肿瘤移植动物中获得了高摄取的肿瘤图像，并且相比于常规已知的放射性同位素标记的环RGD衍生物，肝和大肠的摄入率显著降低，据此提供了特异性针对具有活化的α_vβ₃整合素的阳性整合素α_vβ₃癌细胞的更好的成像和专一作用。此外，与仅注射盐水溶液的肿瘤动物模型相比，当向尾静脉注射后，铼-188标记的衍生物(与锝-99m标记中使用相同前体的治疗性放射性核素)表现出了有效的肿瘤生长抑制和抗血管发生作用。因此，根据本发明的式1的环RGD衍生物可有利地用作为诊断或治疗(放射治疗)血管发生相关疾病定制的药物。

可按以下进行诊断：向对象静脉内注射三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物或其可药用盐，并通过SPECT检查血管发生相关疾病的存在，并且当获取癌症血管发生图像时，通过使用三羰基铼-188标记的RGD衍生物(其使用相同的前体)来进行定制治疗(放射治疗)。

在一个实施方案中，血管发生相关疾病可优选地包括过量表达整合素α_vβ₃的疾病，例如血栓形成(brombosis)、心肌缺血、实体肿瘤或转移肿瘤。

以取决于患者的年龄、体重、性别、剂型、健康状况、疾病之严重程度的多种量通过静脉内注射施用根据本发明的式1环RGD衍生物或其可药用盐用于临床应用。例如对于重70kg的成年患者，对于诊断目的，一般可施用1～20mCi/剂量、优选3～7mCi/剂量或根据医生或药剂师的决定而施用，施用可以以预定时间间隔分开，例如，每天一次或每天多次。对于治疗目的，可施用1～1000mCi/剂、优选1～500mCi/剂或根据医生或药剂师的决定而施用，施用可以以预定时间间隔分开，例如，每天一次或每天多次。

此外，本发明提供了用于标记三羰基锝-99m或铼-188的化学式2所示环RGD衍生物前体。

[化学式2]

其中R¹、X和Y参照上文中化学式1中的定义。

优选地，用于标记三羰基锝-99m或铼-188的环RGD衍生物前体可选自化学式2A至2C所示化合物。

[化学式2A]

[化学式2B]

[化学式2C]

其中，M、R¹、R²、R³、R⁴、A¹和A²参照化学式1中的定义。

以下将参照实施例对用于标记三羰基锝-99m或铼-188之环RGD衍生物前体的制备进行说明，但是本发明并不仅限于具体的实施例。

在下文中，将参考实施例对本发明的实施方案进行详细说明。但是，本发明并不仅限于任何具体的实施例。

<制备实施例1>制备用于三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物前体的原料(3)

参照以下合成式3化合物，其用作根据本发明三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物前体的原料：

Haubner，R.，Wester，H-J.，Reuning，U.，Senekowitsch-Schmidtke，R.，Diefenbach，B.，Kessler，H.，Stocklin G.，Schwaiger，M.，J.Nucl.Med.，1999，40：1061-1071。

<制备实施例2>制备1-氨基-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸苄酯(7)

(步骤1)

在氩气气氛下将1-(N-(叔丁氧羰基)-氨基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷酸(224mg，0.61mmol，5)溶解在乙腈(5mL)中，添加碳酸铯(CsCO₃，596mg，1.83mmol)和苄基氯(211μL，1.83mmol)，将反应混合物在80℃下搅拌30分钟然后冷却至室温。在真空下除去溶剂，通过柱色谱得到纯的化合物(6)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.38-7.30(m，5H)，5.14(s，2H)，3.77(t，J＝6.4Hz，2H)，3.64-3.59(m，12H)，3.53(t，J＝5.0Hz，2H)，3.30(m，2H)，2.65(t，J＝6.4Hz，2H)，1.44(s，9H)。

(步骤2)

将在步骤1中制备的式6化合物(260mg，0.57mmol)溶解在二氯甲烷(10mL)中，在0℃下添加三氟乙酸(TFA，1mL)。在室温下搅拌1小时后，添加饱和NaHCO₃(25mL)。在用二氯甲烷萃取(100mL×3)后，在真空下除去有机层得到1-氨基-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酸苄酯(7)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.53(s，5H)，5.14(s，2H)，3.78(t，J＝6.2Hz，2H)，3.65-3.62(m，12H)，3.58(t，J＝4.8Hz，2H)，2.93(brs，2H)，2.66(t，J＝6.2Hz，2H)，2.51(brs，2H)。

<制备实施例3>制备三羰基锝-99m或三羰基铼-188部分(^99mTc(CO)₃(H₂O)₃⁺或¹⁸⁸Re(CO)₃(H₂O)₃⁺)

利用以下文献中公开的方法制备用于标记的三羰基锝-99m或三羰基铼-188部分：

Alberto，R.，Schibli，R.，Egli，A.，Schubiger，A.P.，Abram，U.，Kaden，T.A.，J.Am.Chem.Soc.1998，120：7987-7988；Alberto，R.，Schibli，R.，Schubiger，A.P.，Abram，U.，Pietzsch，H-P.，Johannsen，B.，J.Am.Chem.Soc.1999，121：6076-6077；Schibli，R.，Netter，M.，Scapozza，L.，Birringer，M.，Schelling，P.，Dumas，C.，Schoch，J.，Schubiger，P.A.，J.Organomet.Chem.2003，668：67-74；Schibli，R.，Schwarzbach，R.，Alberto，R.，Ortner，K.，Schmalle，H.，Dumas，C.，Egli，A.，Schubiger，P.A.Bioconjuate Chem.2002，13：750-756。

<实施例1-5>制备根据本发明三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物的前体

<实施例1>制备环{(三羰基-N-α-双-羟基羰基甲基-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}(2a)

(步骤1)

将制备实施例1中制备的式3化合物(240mg，0.26mmol)和溴乙酸叔丁酯(115mL，0.77mmol)溶解在乙腈(CH₃CN，5mL)和N，N′-二异丙基乙胺(DIEA，130μL，0.77mmol)中，将反应混合物在50℃下搅拌12小时。在真空下除去溶剂，通过使用有机溶剂(甲醇和二氯甲烷(10∶90＝MeOH∶CH₂Cl₂)溶液)的柱色谱分离式4化合物。

MALDI-TOF MS(M+Na⁺)＝1163.4

(步骤2)

将步骤1中制备的式4化合物溶解在TFA∶Et₃SiH∶H₂O(95∶2.5∶2.5，10mL)中。将反应混合物在室温搅拌12小时后，将溶液在真空下完全蒸发，然后过滤通过添加乙醚而得到的固体。将所得白色固体用乙醚充分洗涤，干燥。结果，制备了式2a化合物。

MALDI-TOF MS(M+Na⁺)＝720.8

<实施例2>制备环{(三羰基-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}(2b)

(步骤1)

利用实施例1中步骤1的方法制备式9化合物，只是区别在于用式8的甘氨酸甲酯盐酸盐代替式3化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.71(s，3H)，3.64(s，2H)，3.53(s，4H)，1.44(s，18H)。

(步骤2)

将步骤1中制备的式9化合物(550mg，1.73mmol)溶解在甲醇(MeOH，10mL)中，添加1M氢氧化锂(1M LiOH，3.4mL，3.4mmol)。在50℃下搅拌1小时后，加入1N盐酸(1N HCl，3.8mL，2.2mmol)中和。在真空下除去溶剂，得到式10化合物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.48(s，2H)，3.47(s，4H)，1.48(s，18H)。

(步骤3)

在氩气下将在步骤2中制备的式10化合物(60mg，0.19mmol)与N-羟基苯并三唑(51mg，0.38mmol)和O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲-六氟磷酸盐(144mg，0.38mmol)一起溶解在N，N′-二甲基甲酰胺(5mL)中。搅拌30分钟后，加入在制备实施例2中制备的式7化合物(47mg，0.13mmol)和N，N’-二异丙基乙胺(133mL，0.762mmol)，在室温搅拌16小时。在真空下除去N，N′-二甲基甲酰胺，通过柱色谱分离得到目标化合物(11)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.09(brs)，7.34(brs，5H)，5.13(s，2H)，3.76-3.36(m，22H)，2.65-2.64(m，2H)，1.45(s，18H)。

(步骤4)

在氮气气氛下加入10％钯炭(10％ Pd/C，34mg，0.032mmol)，将溶解在甲醇(5mL)中的步骤3的式11化合物(70mg，0.11mmol)加入到反应混合物中。将反应容器内部换成氢气，在氢气下于室温下搅拌16小时。通过硅藻土滤器将钯滤掉，通过在真空下除去甲醇得到目标化合物(12)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ9.02(brs)，8.20(brs)，3.75-3.70(m，2H)，3.63-3.56(m，14H)，3.52-3.47(m，2H)，3.38-3.36(m，2H)，2.57(t，J＝6.0Hz)，1.44(s，18H)。

(步骤5)

利用与实施例2中步骤5相同的方法制备目标化合物(13)，只是区别在于用步骤4中式12化合物和制备实施例1中式3化合物作为反应原料。

ESI MS(M+H⁺)＝1444.7

(步骤6)

利用与实施例1中步骤1相同的方法制备目标化合物(2b)，只是区别在于利用步骤5中式13化合物作为原料。

ESI MS(M+H⁺)＝1024.5。

<实施例3>制备(三羰基-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂(2c)

(步骤1)

利用与实施例1中步骤1相同的方法制备目标化合物(15)，只是区别在于用O，O′-二苄基天冬氨酸盐酸盐作为原料。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36-7.26(m，10H)，5.14-5.06(m，4H)，3.99(dd，J＝9.2，5.2Hz，1H)，3.61-3.50(m 4H)，2.94(dd，J＝16.8，9.6Hz，1H)，2.82(dd，J＝16.4，5.6Hz，1H)，1.42(s，18H)。

(步骤2)

利用与实施例2中步骤2相同的方法制备目标化合物(16)，只是区别在于用步骤1中的式15化合物作为原料。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ9.60(brs，2H)，3.90(t，J＝6.6Hz，1H)，3.55-3.40(m，4H)，2.98(dd，J＝16.4，5.2Hz，1H)，2.66(dd，J＝16.8，7.6Hz，1H)，1.46(s，18H)。

(步骤3)

利用与实施例2中步骤5相同的方法制备目标化合物(17)，只是区别在于用步骤2中的式16化合物作为原料。

MALDI-TOF MS(M+Na⁺)＝2171.06

(步骤4)

利用与实施例1中步骤2相同的方法制备目标化合物(2c)，只是区别在于用步骤3中的式17化合物作为原料。

ESI MS(M+H⁺)＝1420.5

<实施例4>制备{三羰基-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸}-{(聚乙二醇)4-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D苯丙氨酸)]}₂ (2d)

(步骤1)

使用与实施例2中步骤5相同的方法制备式18化合物，只是区别在于用式16化合物代替式3化合物作为原料。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.46(brt，1H)，7.38-7.30(m，10H)，6.84(brs，1H)，5.13(s，4H)，3.87(t，J ＝6.4Hz，1H)，3.77(t，J＝6.4Hz，4H)，3.63-3.61(m，24H)，3.57-3.53(m 4H)，3.51-3.42(m 6H)，3.31-3.27(m，2H)，2.81(dd，J＝10.8，6.4Hz，1H)，2.65(t，J＝6.6Hz，4H)，2.38(dd，J＝14.8，6.4Hz，1H)，1.44(s，18H)。

(步骤2)

使用与实施例2中步骤6相同的方法制备式19化合物，只是区别在于用步骤1中的式18化合物作为原料。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.57(brt，1H)，7.82(brs，1H)，5.13(s，4H)，3.92(t，J＝6.6Hz，1H)，3.77-3.70(m，4H)，3.64-3.55(m，31H)，3.47-3.30(m 2H)，3.34-3.29(m 3H)，2.81(dd，J＝22，7.2Hz，1H)，2.59(t，J＝12Hz，4H)，2.46(dd，J＝20.4，5.2Hz，1H)，1.45(s，18H)。

(步骤3)

使用与实施例2中步骤5相同的方法制备式20化合物，只是区别在于用步骤2中的式19化合物和制备实施例1中的式3化合物作为原料。

MALDI-TOF MS(M+Na⁺)＝2665.87

(步骤4)

使用与实施例1中步骤2相同的方法制备目标化合物(2d)，只是区别在于用步骤3中式20化合物作为原料。

MALDI-TOF MS(M+Na⁺)＝1914.65

<实施例5>制备{三羰基-N-α-双-羟基羰基甲基-(聚乙二醇)₄-天冬氨酸}-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂ (2e)

(步骤1)

使用与实施例1中步骤1相同的方法制备式21化合物，只是区别在于用制备实施例2中的式7化合物作为原料。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.37-7.34(m，5H)，5.14(s，4H)，3.77(t，J＝6.4Hz，2H)，3.63-3.58(m，14H)，3.49(s 4H)，2.94(t，J＝5.8Hz 2H)，2.65(t，J＝6.6Hz 2H)，1.45(s，18H)。

(步骤2)

使用与实施例2中步骤6相同的方法制备式22化合物，只是区别在于用在步骤1中制备的式21化合物作为原料。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.97(brs，1H)，3.74(t，J＝5.8Hz，2H)，3.64-3.60(m，14H)，3.50(s，4H)，2.95(t，J＝5.0Hz，2H)，2.57(t，J＝5.6Hz，2H)，1.44(s，18H)。

(步骤3)

使用与实施例2中步骤5相同的方法制备式23化合物，只是区别在于用在步骤2中制备的式22化合物和O，O′-二苄基天冬氨酸盐酸盐作为原料。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.36-7.27(m，10H)，5.13(d，J＝1.6Hz，2H)，5.06(d，J＝0.8Hz，2H)，4.94-4.90(m，1H)，3.67(t，J＝5.8Hz，2H)，3.64-3.55(m，14H)，3.47(s，4H)，3.06(dd，J＝22，4.8Hz，1H)，2.94-2.87(m，3H)，2.49(td，J＝6.8，2.0Hz，2H)，1.44(s，18H)。

(步骤4)

使用与实施例2中步骤6相同的方法制备式24化合物，只是区别在于用步骤3中式23化合物作为原料。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 9.49(brs，1H)，7.61(brd，J＝4.4Hz，1H)，4.69(brs，1H)，3.68-3.41(m，20H)，2.99-2.94(m，3H)，2.78(dd，J＝24，7.2Hz，1H)，2.52(brs，1H)，1.45(s，18H)。

(步骤5)

使用与实施例2中步骤5相同的方法制备式25化合物，只是区别在于用在步骤4中制备的式24化合物和在制备实施例1中制备的式3化合物作为原料。

MALDI-TOF MS(M+Na⁺)＝2418.70

(步骤6)

使用与实施例1中步骤2相同的方法制备式(2e)化合物，只是区别在于用步骤5中的式25化合物作为原料。

MALDI-TOF MS(M+H⁺)＝1667.8

<实施例6>制备环{(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}

将在实施例1中制备的式2a前体化合物(2.6mg，0.002mmol)和双-(N-四乙基)-三溴三羰基铼((NEt₄)₂ReBr₃(CO)₃，1.6mg，0.0025mmol)溶解在水∶甲醇(v/v＝1/1，1mL)中。搅拌1小时20分钟后，利用氮气除去溶剂。用HPLC纯化溶解在水中的目标化合物，用MALDI-TOF质谱分析目标化合物。

(MALDI-TOF MS(M+H⁺)＝990.85)。

对于HPLC，流动相为含有0.1％三氟乙酸的乙腈(20％)/蒸馏水(80％)，并且流动相在30分钟时升高至90∶10，并且HPLC柱为C18柱(YMC，5μm，10×250mm)。流动相以每分钟2mL流动。在21.8分钟时作为UV-检测器(214nm，UV)的检测结果检测到实施例6的目标化合物。

<实施例7>制备环{(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}

使用与实施例6相同的方法合成目标化合物，只是区别在于用实施例2中制备的式2b前体化合物代替实施例1中制备式2a前体化合物，用MALDI-TOF质谱分析目标化合物。(MALDI-TOF MS(M+H⁺)＝1293.4)。

使用与以上实施例6中所说明的相同的HPLC分离条件进行分离，在21.6分钟时通过UV-检测器(214nm)检测出实施例7的目标化合物。

<实施例8>制备(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂

使用与实施例6相同的方法合成目标化合物，只是区别在于用实施例3中制备的式2c前体化合物代替实施例1中制备式2a前体化合物，并且用ESI质谱分析目标化合物。(ESI MS(M+H⁺)＝1688.5)。

使用与以上实施例6所说明的相同的HPLC分离条件进行分离，在19.2分钟时用UV-检测器(214nm)检测出实施例8的目标化合物。

<实施例9>制备(三羰基-[^185/187Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂

使用与实施例6相同的方法合成目标化合物，只是区别在于用实施例5中制备的式2e前体化合物代替实施例1中制备式2a前体化合物，用ESI质谱分析目标化合物。(ESI MS(M+H⁺)＝2007.7)。

使用与以上实施例6所说明的相同的HPLC分离条件进行分离，在20.8分钟时用UV-检测器(214nm)检测实施例9的目标化合物。

<实施例10>制备环{(三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}

将铵基硼烷(Ammoniumboran)(NH₂-BH₃复合物，5mg)添加到10mL具橡胶帽的小瓶中。在引入10分钟的CO气体后，添加磷酸(H₃PO₄，6μL)和¹⁸⁸ReO₄^-(10mCi，1mL)。在60℃下搅拌15分钟(同时插有20mL的空注射器以使内部压力尽可能小)后反应完成。冷却至室温后，添加100mM PBS(200μL)和饱和碳酸氢钠(50μL)中和，从而合成铼三羰基化合物[¹⁸⁸Re(H₂O)₃(CO)₃⁺]，通过放射性-TLC(Radio-TLC)确证反应化合物的合成。

添加[¹⁸⁸Re(H₂O)₃(CO)₃⁺]和实施例10中制备的式2a前体化合物(0.5mg)，在75℃下加热60分钟，然后在冰水中冷却。在通过tC18 Sep-Pak盒纯化后，将所收集的溶液通过HPLC纯化。

对于HPLC，使用与实施例6相同的条件，在21.8分钟时用γ-射线检测器(NaI)检测出实施例10的目标化合物。这与实施例6化合物在检测器(UV 214nm)中的保留时间一致。达到了50～60％(经衰变修正)的放射化学收率，放射化学纯度超过97％。

<实施例11>制备环{(三羰基-[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}

使用与实施例11中所使用的相同方法制备目标化合物，只是用实施例2中式2b前体化合物代替实施例1中式2a前体化合物。

对于HPLC，使用与实施例6相同的条件，在21.6分钟时用γ-射线检测器(NaI)检测出实施例11的目标化合物。这与实施例7中化合物在检测器(UV 214nm)中的保留时间一致。达到了50～60％(经衰变修正)的放射化学收率，放射化学纯度超过97％。

<实施例12>制备(三羰基[¹⁸⁸Re]铼-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂

使用与实施例12所使用的相同方法制备目标化合物，只是用实施例3中式2c前体化合物代替实施例1中式2a前体化合物。

对于HPLC，使用与实施例6相同的条件，在19.2分钟时用γ-射线检测器(NaI)检测出实施例12的目标化合物。这与实施例8中化合物在检测器(UV 214nm)中的保留时间一致。达到了50～60％(经衰变修正)的放射化学收率，放射化学+纯度超过97％。

<实施例13>制备环{(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}

将碳酸钠(Na₂CO₃，4mg)、硼氢化钠(NaBH₄，5.5mg)和脱水L-酒石酸钠(5mg)添加到10mL具橡胶帽的小瓶中，引入CO气体10分钟。通过注射器从发生器中添加TcO₄^-(10mCi，1mL)，向橡胶帽中插入20mL的空注射器以使内部压力尽可能小。将小瓶在75℃下加热25分钟。在冰水中冷却后，加入100mM磷酸盐缓冲盐水(PBS，200μL)和1N HCl(180L)中和。通过放射性-TLC确证三羰基锝-99m化合物[^99mTc(H₂O)₃(CO)₃⁺]的合成。添加[^99mTc(H₂O)₃(CO)₃⁺]和在实施例1中制备的式2a前体化合物(0.5mg)，在75℃下加热60分钟，然后在冰水中冷却。在通过tC18 Sep-Pak盒纯化后，将所收集的溶液通过HPLC纯化。

对于HPLC，流动相为含有0.1％三氟乙酸的乙腈(20％)/蒸馏水(80％)，并且流动相在30分钟时升高至90∶10，并且使用的HPLC柱为半制备型C18柱(YMC，5μm，10×250mm)。流动相以每分钟2mL流动。在20.6分钟时作为UV-检测器(214nm，UV)的检测结果而检测出实施例6的目标化合物。因此，注意到与实施例13的目标化合物在检测器(UV 214nm)上检测到的保留时间(21.8分钟)有一分钟的差异。达到了60～70％(经衰变修正)的放射化学收率，放射化学纯度超过97％。<实施例14>制备环{(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸}

使用与实施例13所使用的相同方法制备目标化合物，只是用实施例2中式2b前体化合物代替实施例1中式2a前体化合物。

对于HPLC，使用与实施例6相同的条件，在21.4分钟时用γ-射线检测器(NaI)检测出实施例14的目标化合物。因此，注意到与实施例18的目标化合物在检测器(UV 214nm)上检测到的保留时间(21.6分钟)有0.2分钟的差异。达到了60～70％(经衰变修正)的放射化学收率，放射化学纯度超过97％。

<实施例15>制备(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-天冬氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂

使用与实施例13所使用的相同方法制备目标化合物，只是用实施例3中式2c前体化合物代替实施例1中式2a前体化合物。

对于HPLC，使用与实施例6相同的条件，在18.4分钟时用γ-射线检测器(NaI)检测出实施例15的目标化合物。因此，注意到与实施例8的目标化合物在检测器(UV 214nm)上检测到的保留时间(19.2分钟)有0.8分钟的差异。达到了60～70％(经衰变修正)的放射化学收率，放射化学纯度超过97％。

<实施例16>制备(三羰基-[^99mTc]锝-N-α-双-羟基羰基甲基-甘氨酸-CONH(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂CONH-赖氨酸)-[环(赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸)]₂

使用与实施例13所使用的相同方法制备目标化合物，只是用实施例5中式2e前体化合物代替实施例1中式2a前体化合物。

对于HPLC，使用与实施例6相同的条件，用γ-射线检测器(NaI)在19.9分钟检测出实施例16的目标化合物。因此，注意到与实施例9的目标化合物在检测器(UV 214nm)上检测到的保留时间(20.8分钟)有0.9分钟的差异。达到了50～70％(经衰变修正)的放射化学收率，放射化学纯度超过97％。

在实施例13至16的化合物中，将实施例6至8化合物的非放射性同位素^185/187Re换成放射性同位素^99mTc，因此，通过质谱验证的实施例6、7、8的各自化合物与实施例13、14、16的化合物之间的HPLC保留时间(tR)有约1分钟的差异。因此，由于大部分前体都以高收率地被标记，证实了实施例13至16的化合物仅有锝-99m的改变(锝和铼在周期表中属于同一金属离子家族，并且与相同的前体具有相同的反应性)。

<实验实施例1>测量三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物的生物活性

<1-1>测量亲和力(IC₅₀)

进行以下实验以研究根据本发明的三羰基锝或铼标记的环RGD衍生物与整合素α_vβ₃(关键的血管发生生物标志物)的结合亲和力。

将已知过量表达整合素α_vβ₃的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在含有FBS、氢化可的松、人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-B)、血管内皮生长因子(VEGF)、R3-IGF-1、抗坏血酸、人表皮生长因子(hEGF)、GA-1000和肝素的内皮细胞基础培养基-2(EBM-2)中于37℃、5％CO₂下孵育。将1×10⁶个HUVEC接种到eppendorf管中，加入2μCi三羰基锝-99m或铼-188标记的环RGD衍生物，同时，向每个管中加入用作竞争性反应之对照物质的0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、3、5nM环RGD(cRGDyV)，然后在5％CO₂下于37℃下诱导结合反应1小时。孵育后，将HUVEC用100mM PBS洗涤三次，利用γ计数器测量通过竞争反应特异性结合三羰基锝或铼标记的环RGD衍生物的放射性。利用所测量的辐射能和单位浓度竞争反应对照物质的值构建非线性回归曲线，并基于该曲线计算IC₅₀。对于IC₅₀的计算，使用sigma plot软件。

随后测量下表中所列出的与整合素α_vβ₃的结合亲和力(IC₅₀)。

[表1]

IC₅₀(nM)实施例101.4实施例120.5实施例131.6实施例141.2实施例150.4实施例160.5

参看表1，实施例13和10的化合物(各自是引入了一个环RGD的衍生物)分别表现出1.6nM和1.4nM的IC₅₀，因此表明这样的事实：当使用相同前体而仅改变放射性同位素时，与整合素α_vβ₃的结合亲和力不变。实施例14还证实这样的事实：与实施例13和10相比，引入PEG接头不产生太大影响。实施例15和12的化合物(各自是引入两个环RGD的衍生物)分别表现出0.4nM和0.5nM的亚纳摩尔结合值，因此显示了优秀的亲和力。同样，向相同前体无论是否引入锝-99m和铼-188，与整合素α_vβ₃的结合亲和力都不变，引入PEG接头的实施例16与实施例12和15之间在结合亲和力上没有显著影响。

因此，证实随着所引入的环RGD数目的增加，根据本发明的环RGD衍生物表现出更高的与整合素的结合亲和力。

<1-2>对三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物在/从肿瘤模型小鼠体内肿瘤和正常器官中摄取和排泄的评价

使用先天性缺失甲状腺的小鼠(7周龄，BALB/c-nu Sic品系，下文中称为“裸鼠”)，通过三种类型的根据本发明的三羰基锝-99m标记的环RGD衍生物(实施例13至15)的实验研究在肿瘤和正常器官中的摄取率和排泄率。

为了在裸鼠中形成肿瘤，皮下注射人成胶质细胞瘤U87-MG细胞(1×10⁶/100μL于PBS中)，在约2周的生长期后形成了0.4～0.5cc大小的肿瘤的模型被用于实验。

将实施例13～15中制备的化合物溶解在盐水中，以100μL(20μCi)注射到每只模型的尾静脉中。体内分布的时间过程设定为10、30、60、120、240分钟，每个时间使用4～5个模型。在每个时间处死小鼠，并取出血液、肿瘤和各器官(包括肝、肺、脾、肾、小肠、大肠、甲状腺、肌肉、脑)，对各器官进行称重(g)，利用γ计数器测量药物的放射性。以％ID/g(百分注射剂量/克)为单位计算各器官的放射性，如图1～3所示。％ID/g通过下式计算：

[数学公式1]

％ID/g＝(药物摄入/药物的注射量×100)/每个器官的重量(g)

测量值列在如下表2～4中。

[表2]

实施例13的化合物

器官10分钟30分钟60分钟120分钟血液0.37±0.040.10±0.010.03±0.000.02±0.00肝5.12±0.760.92±0.100.45±0.090.30±0.09肺1.72±0.860.54±0.140.27±0.070.40±0.46脾0.56±0.320.19±0.100.12±0.030.08±0.03肾1.65±0.480.50±0.090.23±0.020.13±0.01小肠4.41±1.005.59±0.863.95±0.224.00±0.41大肠0.55±0.370.31±0.060.53±0.810.11±0.01甲状腺0.05±0.020.01±0.000.01±0.000.03±0.03肌肉0.56±0.270.16±0.040.08±0.070.05±0.02脑0.04±0.010.02±0.000.01±0.010.03±0.02肿瘤1.43±0.150.78±0.400.10±0.140.33±0.06

[表3]

实施例14的化合物

[表4]

实施例15的化合物

参看表2至4和图1至3，实施例13至15的化合物在/从肿瘤和器官中摄取和排泄的时间过程表明如下：在开始时，实施例13的化合物具有低的肿瘤摄取和高的肝和小肠摄入，随着时间从整个器官中快速排泄。注射10分钟后，超过5％ID/g的肝摄取随时间快速排泄，2小时后变为低至0.3％ID/g。在肝中代谢后，大部分药物被证实排泄出了体外，通过即使是在注射2小时后也维持在4％ID/g的事实，证实进行着活跃的肠排泄。在其他器官如包含血液的脑和肌肉中未发现任何特异性的摄取，并且基于甲状腺摄取维持在0.01～0.05％ID/g范围的事实，证实了药物在体内的稳定性。肿瘤中的初始摄取很快，其从注射后10分钟的1.43％ID/g变为注射后2小时的0.33％ID/g，之后逐渐降低。

通过将PEG链与环RGD的赖氨酸相连接以降低标记口袋的负电荷(-)与环RGD之精氨酸的正电荷(+)之间的抵消作用而制备实施例14的化合物。实施例14化合物在肿瘤和器官中摄取和排泄的时间过程如下：在注射后10分钟时摄取为5.3％ID/g，药物随着时间快速代谢，注射后4小时时变为低至0.64％ID/g。还观察到被在肝中代谢的药物主要通过肠排泄出体外。从随着注射后2小时药物通过小肠时药物在大肠的吸收迅速提高的发现，证实药物在此时开始排泄出体外。少量药物通过肾的过滤收集在膀胱中，其随后与尿一起排泄出体外。在包含血液的脑和肌肉中未发现特异性的吸收，在甲状腺中的摄取也维持在0.01～0.20％ID/g的范围，因此表明药物在体内的稳定性。在肿瘤中的摄取相对较高，在注射后10分钟为5.43％ID/g，根据代谢过程，在注射后4小时摄取缓慢降低，变为1.41％ID/g。

引入2个环RGD的化合物在肝中表现出非常低的初始吸收(在注射后10分钟为3.1％ID/g)和非常快速的肝代谢(这导致在4小时时迅速降低至1％ID/g)。在肝中代谢后，药物迅速通过肾并在尿中排泄出体外，并且肾中的最大摄取出现在注射后1小时，由于通过尿的排泄，注射后60分钟超过了12％ID/g。药物通过肠(包括小肠和大肠)的排泄低至5％ID/g，大部分所施用药物被证实通过尿排泄。在包含血液的脑和肌肉中未表现出特别的摄取，通过甲状腺的摄取持续维持在的0.1％ID/g的事实，证实了药物的稳定性。药物在第一个10分钟的初始摄取高至12.44％ID/g，这表现出在肿瘤中高且快速地积累的能力并且摄取维持到注射后长达1小时。之后，观察到药物从肿瘤中缓慢释放，但是在注射后4小时，肿瘤中的摄取依然高至足以超过6％ID/g。

<1-3>通过SPECT成像对肿瘤模型小鼠体内的三羰基锝-99m环RGD衍生物进行评价

使用与实验实施例<1-2>所使用的相同的方法制备肿瘤模型小鼠。将根据本发明的实施例13～15的化合物(0.5～1mCi)溶解在100μL盐水中并注射到荷瘤小鼠模型的尾静脉。将动物模型用2％异氟烷气体麻醉至获取图像的时间，利用SPECT设备(Bioscan，nanoSPECT/CT)获得小鼠从注射开始180分钟的静态图像。图像获取方案由如下重复的发射和传输组成：

[20分钟发射+传输]×9次

实施例13～15的化合物的SPECT图像示于图4至6中。

实施例13的化合物在注射10分钟后被肿瘤吸收，这被持续观察到了约1小时。大部分药物通过在肝中的代谢，然后快速释放到肠中，仅有一些药物通过肾在尿中排泄。

实施例14的化合物在注射10分钟后表现出高肿瘤吸收率，这被观察到了约3小时。类似于实施例13的化合物，观察到实施例14的化合物在肝代谢后快速释放到肠中，仅有一些药物通过肾在尿中排泄。

实施例15的化合物在注射10分钟后表现出非常高的肿瘤吸收率，这被持续观察到了约3小时和更长时间。与实施例13和实施例14的化合物不同，大部分经代谢的药物通过肾在尿中排泄。图7示出了以肿瘤为参照的肝、肾和肌肉的相对吸收率图示，据此可以评价实施例15的化合物在/从肿瘤和各器官中的摄取率和排泄率(表4)，可以观察到与实施例15化合物SPECT成像评价的一致性(图6)。

<1-4>对注射环RGD衍生物(cRGDyV，竞争反应参照物质)后肿瘤模型小鼠体内三羰基锝-99m环RGD衍生物的SPECT成像评价

为了研究环RGD衍生物的肿瘤特异性摄取，施用作为竞争反应参照物质的环RGD(cRGDyV)并且获得SPECT/CT成像。对于参照物质，将环RGD-酪氨酸-缬氨酸衍生物以18mg/Kg的浓度注射到尾静脉。注射参照物质10分钟后，向尾静脉注射标记有锝-99m的实施例15的化合物(1mCi/200μL)。注射后，在以下条件下获取SPECT/CT图像：

在获取图像所需时间中将动物模型用2％异氟烷气体麻醉，动物模型的肿瘤大小为0.4cc。在45v、178μA的条件下获取CT图像4分30秒，以10分钟的间隔总共获取9次(即，注射后90分钟)。结果在图8示出。

参看图8，施用环RGD(cRGDyV)(已知其与整合素α_vβ₃特异性结合)后，根据本发明的实施例15化合物的SPECT图像表明，与图6的实施例15的化合物的图像相比，在注射后25分钟时肿瘤中的吸收降低了94％或更多。证实了这是由于α_vβ₃整合素特异性结合引起的肿瘤图像。

<1-5>对肿瘤模型小鼠体内三羰基铼-188标记的环RGD衍生物的肿瘤生长抑制和治疗性能的评价(I)

进行治疗效果实验以研究三羰基铼-188标记的环RGD衍生物抑制肿瘤生长的能力。

每周一次注射实施例5的铼-188标记的环RGD衍生物，注射4周。将用于确定治疗效果的模型分成小放射性注射组(300μCi)和大放射性注射组(600μCi)，同时还设置每天通过腹膜内注射无菌盐水的对照组和注射100μg环RGD(cRGDyV)的对比组。通过尾静脉施用实施例11化合物和无菌盐水。每周1次获取CT图像，以可视化地测量皮下肿瘤的生长和大小。每周3次用游标卡尺实际测量肿瘤，同时持续地每周3次测量动物模型的体重共计4周。将结果构建成图9中所示的图示。

参看图9，施用无菌盐水和环RGD的组表现为肿瘤随时间从0.69cc、0.7cc的初始肿瘤大小开始迅速生长。第2周时，肿瘤分别生长至3.0cc和3.9cc，第3周时这两组都表现为8.0cc的肿瘤大小。在治疗的最后一周，肿瘤为13.0cc和12.9cc，这是非常快速的生长模式。这两组的肿瘤生长速率彼此无有意义的区别，并且体重也由初始测量的23g大幅提高至施用无菌盐水之组的33g和施用环RGD之组的30g。这被认为归因于动物模型中肿瘤的迅速生长。施用300μCi实施例11化合物之组的初始肿瘤大小为0.23cc，其在4周的治疗结束时提高至0.66cc。与施用无菌盐水或环RGD的组相比，证实有大约50％的肿瘤生长抑制能力。由辐射能所引起的体重改变表现为由治疗前的20g提高至4周长的治疗后的25g，但是考虑到治疗期间动物体重事实上逐渐降低的事实，约5g的体重提高被认为是归因于肿瘤的生长。施用发射更多辐射能的600μCi之组中的肿瘤生长表现为由初始测量的0.3cc变为第2周时为0.3cc、第3周为0.7cc和治疗结束时的1.4cc的非常慢的生长速率，这因此证实与施用无菌盐水的组和施用环RGD的组相比有大约90％的肿瘤生长抑制能力，与施用低辐射能治疗(300μCi)的组相比有大约79％的肿瘤生长抑制能力。由于施用四次药物的高剂量辐射能所造成的动物体重变化为约14％，由治疗前的19.9g逐渐降低至治疗结束时的17.09g。因此，结果符合肿瘤放射治疗前后实验对象的体重减少不应当超过20％的机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)的规定。

<1-6>对肿瘤模型小鼠体内三羰基铼-188标记的环RGD衍生物的肿瘤生长抑制和治疗性能的评价(II)

将两只具有相同肿瘤大小(0.3cc)的体内肿瘤模型小鼠分成注射实施例12化合物(600μCi/200μL)(即，铼-188标记的环RGD衍生物)的模型和另一个不注射实施例12化合物的模型。三天后使用实施例15化合物的两个模型的SPECT成像结果示于图10中。

注射后利用小动物SPECT/CT获得小鼠60分钟的静态成像。成像方案由如下重复的发射和传输组成：

[10分钟发射+传输]×6次

在图10所示的图示中分析施用实施例12化合物的组与正常组之间的肿瘤、肝、肾和肌肉相对摄取率，在从这两组中直接摘除肿瘤后，将肿瘤周围血管的分布拍照，如图11所示。

参看图10和11，注射有实施例6化合物的模型由初始大小0.3cc生长至0.35cc，而未施用的模型表现为0.65cc的肿瘤大小。为了以SPECT成像比较肿瘤的目的，与施用实施例15化合物(即，锝-99m标记的环RGD衍生物)的组进行比较，证实在施用实施例12的组中肿瘤中的摄取率降低了59％。此外，与未施用的模型不同，从这两组获得的照片表现为施用实施例12化合物的模型具有显著更少的周围血管分布，还迅速降低了肿瘤周围血管的分布。此外，通过CD31血管染色肿瘤组织切片，在施用了实施例12化合物的肿瘤细胞中未观察到清楚的血管。此外，在利用两种引入了Q点(Q-dot)的RGD衍生物评价整合素α_vβ₃在肿瘤组织切片中分布的实验中，在施用了实施例12化合物的肿瘤组织中大部分整合素被破坏(图11)。

因此，根据本发明的三羰基铼-188标记的环RGD衍生物对于肿瘤的生长和血管发生具有良好的抑制，并且可以有利地用于治疗源自肿瘤血管发生的疾病。

同时，根据本发明的化合物可以以多种剂型提供。为了描述的目的，以下将提供可包含根据本发明化合物作为活性成分之剂型的一些例子，但是本发明的实施方案将不仅严格局限于任何具体的实施例。

<制备实施例>注射剂的制备

本发明的式1化合物          5mCi

乙醇                       100mg

盐水                       2000mg

将根据本发明的式1化合物与乙醇(或无)溶解在蒸馏水中，通过无菌滤器，储存在无菌小瓶中，并且根据已知方法制备成注射剂。

上述实施方案和优点仅是示例性的，并不能被解释为对本发明构成任何限制。可以很容易地将本发明的教导应用于其他类型的设备。同样，对本发明概念的示例性实施方案的描述旨在举例说明，而不是限制权利要求的范围，并且许多替换、修改和改变对于本领域技术人员来说将是显而易见的。