一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法

摘要

本发明提出了一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，包括下列步骤：1）制备均质的间充质干细胞的培养基；2）多种小RNA分子的组合；3）核酸多肽纳米粒的组装和转染；4）转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基；5）激活多种造血相关的基因，解决了现有技术造血干细胞治疗中的细胞配型困难、免疫排斥和造血干细胞数量限制的技术瓶径的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法。 

背景技术

脂肪源性干细胞（Adipose-derived stem cell，AD-MSCs）的主要来源白色脂肪（white adipose tissue，WAT）在体内分布广泛，储量丰富。细胞克隆实验证明，骨髓来源的间充质干细胞（Bone-marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）仅占成人骨髓的0.2×10^-5-0.1×10^-5，而脂肪组织中所获得的干细胞克隆形成率是BMSCs的100-500倍。骨髓中BMSCs的比例和增值能力均会随着年龄的增长和骨质疏松的发生率而下降，但脂肪组织中ADSCs数量不随供者年龄增加而减少。ADSC体外扩增和自我更新能力强，原代培养约5-7天后，细胞融合超过90%，一个月出现3个对数生长期，能较稳定传代20代以上；体外培养时对血清无特殊选择性，无需添加物即可良好的生长，液氮冻存和长期传代后的ADSCs细胞生长和表型均无改变。 

ADSCs具有多向分化能力，在不同诱导培养条件下，ADSCs能够定向分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰腺内分泌样细胞、肝脏细胞和视神经细胞等多种组织细胞。但至今不清楚它们是否能转化为造血干细胞（HSCs）。 

造血干细胞是治疗血液病尤其是白血病的最有效方法。白血病和其它肿瘤疾病一样，近年来在中国有着显著增长的趋势，并呈现低龄化的特点。白血病占恶性肿瘤的5%，发病以儿童和青年居多。治疗白血病的最有效的方法就是造血干细胞治疗。但目前的治疗手段是通过寻找配型的骨髓或造血干细胞，患者家属以及社会的相关部门动用一切可调动的资源寻找配型适合的造血干细胞，能配上的微乎其微。因此催生了国家干细胞库的设立，但每个库通常要花费2亿元左右，其经济成本之高可想而知，但从技术上乃不能完全排除免疫排斥和致瘤可能。此外，由于干细胞的数量有限，无分化扩增技术的缺少，使最终优 质的医疗结果得不到保证。上述种种原因急需人们去发现新的产生造血干细胞的来源和研制新的无分化扩增造血干细胞的技术和方法。 

近年来的研究发现不同类型的造血细胞中小RNA的表达显著不同，而且这种不同在细胞的发育过程中起着重要的调节作用。例如，miR-181和B-淋巴细胞的发育有关，miR-142和miR-223与T-淋巴细胞的发育有关，miR-221和miR-222与人的红细胞生成有关，miR-223和小鼠的粒细胞分化相关，而miR-10,miR-126和miR-17与巨核细胞减少有关。除此之外，人们还发现某些小RNA，如miR-128和miR-181，能起到阻止造血干细胞分化的作用。尽管已经发现某些miRNA，例如miR-130a和miR-10a，通过作用HOXA1基因和MAFB基因的转录因子基因从而诱导细胞分化。 

发明内容

本发明提出一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，解决了现有技术造血干细胞治疗中的细胞配型困难、免疫排斥和造血干细胞数量限制的技术瓶径的问题。 

本发明的技术方案是这样实现的：一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，包括下列步骤： 

1）制备均质的间充质干细胞的培养基； 

2）多种小RNA分子的组合； 

3）核酸多肽纳米粒的组装和转染； 

4）转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基； 

5）激活多种造血相关的基因。 

作为优选的技术方案，所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的EGF，FGF-2,lPDGF，IGF和TGF-β五因子。 

作为优选的技术方案，所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的shh，SCF，TPO，Flt3L，Delta1，IGFBP，Angiopoietin，MBP4，LIF，TGF-β十因子。 

作为优选的技术方案，所述多种小RNA分子是指miR-138-1，miR-138-2，miR-433以及靶向EID1mRNA不同位点的siR-EID1分子的序列。 

所述靶向EID1mRNA不同位点的siR-EID1分子的序列见表2。 

作为优选的技术方案，所述转决定后的造血干细胞培养是指在造血干细胞 诱导扩增培养基中以5×10⁵/ml的细胞密度进行培养至少3天。 

核酸多肽纳米粒的组装是指不同的小RNA分子与多肽转染试剂按实例3配比、程序和时间的配制过程，通过每天一次共二次的转染以达到最佳的诱导效率。 

作为优选的技术方案，所述激活多种造血相关的基因是指Runx1,Bmi1,HoxB4,Gata1,Gata2,Gfi1,Sall4,Pu.1,Scl，Mcl，C-myc，C-myb,Kcl4,Cxcr4,和Crb，但不局限于这些基因。 

间充干细胞培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括不同间充质干细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。 

造血干细胞诱导扩增培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括造血干细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。具体配方成分见表3。 

使用本发明的方法获得的诱导造血干细胞，可用于血液病如再生障碍性贫血和白血病的治疗。 

下面结合具体实例进一步说明本发明。 

实例1.间充质干细胞分离、培养和扩增 

脂肪/骨髓/脐带的获取在捐献者同意的前提下进行的。人脂肪来源干细胞的采集、分离和培养：脂肪抽吸物被分为2种成分：一种是密度小的脂质成分，另一种是密度大的水性成分，为液体部分。液体成分被用作脂肪来源干细胞的来源。无菌条件下将获取的脂肪组织用同体积的PBS液反复冲洗3到5次，加入0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃水浴振荡、消化60min，然后以含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。1000g离心10min，弃上清液及悬浮的残存组织，重悬细胞，加入2倍体积的红细胞裂解液（NH4Cl154mmol/L+KHCO310mmol/L+EDTA0.1mmol/L）静置10min，离心、弃上清液。用适量的PBS液清洗3次，200目筛网过滤，细胞悬液用细胞记数板记数，按每平方厘米1-3×10⁵细胞接种于150cm²的培养瓶，加20mL无血清的高糖DMEM/F12培养基，添加20ng/ml EGF，20ng/ml FGF-2,10ng/mlPDGF-BB，5ng/ml IGF和0.5ng/ml TGF-β混合均匀，置于37℃、5%的CO²饱和湿度培养箱内培养。本发明公开的培养基是一种快速扩增无分化的间充质干细胞培养液，它能培养出高度一致的无分化的间充质干细胞，为后续的产生造血干细胞提供了可靠的保证。相差显微镜观察细胞形态特征及增殖情况，36～48h后首次换液，以后每72h换液1次。待细胞融合超 过培养瓶底80%时，常规胰酶消化传代。 

人脂肪来源干细胞的鉴定：取第3或4代细胞以0.25%胰酶消化后，流式细胞术分析研究发现ADSCs主要表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR（见图1）。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10和CD106，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。 

实例2.miRNAs序列、结构和合成 

通过生物信息学技术和相关的预测软件(Target Scan)，我们筛选和鉴定了三种miRNAs（见图2）。第一个miRNA是miRNA-138-1,其序列相对应的短的发卡DNA序列如下： 

CCCUGGCAUGGUGUGGUGGGGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGUUGCCAAUCAGAGAACGGCUACUUCACAACACCAGGGCCACACCACACUACAGG. 

第二个miRNA是miRNA-138-2,其序列相对应的短的发卡DNA序列如下： 

CGUUGCUGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGACGAGCAGCGCAUCCUCUUACCCGGCUAUUUCACGACACCAGGGUUGCAUCA 

第三个miRNA是miRNA-433,其序列相对应的短的发卡DNA序列如下： 

CCGGGGAGAAGUACGGUGAGCCUGUCAUUAUUCAGAGAGGCUAGAUCCUCUGUGUUGAGAAGGAUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGUUCUCCAGG 

这些miRNAs都可以通过化学合成的方法获得，为了加强稳定性这些小RNA的组成单体可进行全部或部分不同的化学修饰，如甲氧或乙氧修饰。本发明中的miRNAs活性成分的制备方法如下： 

将4种不同的核苷酸单体经RNA/DNA合成仪按特定的设计序列合成三种不同的小RNA单链，这些小RNA单链序列如上所示。合成好的小RNA单链再经过分离纯化除去其它成分，进行退火形成三个特征的miRNAs。将这三种miRNA分子冷冻浓缩成干粉作为配方中的小核酸活性成分，在低温下保存，干粉包括miRNA-138-1、miRNA-138-2和miRNA-433，这些miRNA中均含有一个EID1基因的种子片段。将它们分别与含有EID1的3‘UTR区序列的荧光素酶质粒(pRL-TK)共转染脂肪间充质干细胞，转染36小时后荧光素酶活性分析结果显示这些小RNA分子(包括siR-EID1,shR-EID1和sRNA-M)均能有效的下调把基因 EID1（见图3），使不同的组蛋白乙酰化和多种转录因子乙酰化，从而激活了间充质干细胞，使其更容易向其他干细胞转化。为了加强小RNA的干扰效应，我们采用了这三种小RNA（sRNA-M）的结合战略，最终的小核酸活性成分是在miRNA-138-1、miRNA-138-2和miRNA-433合成后根据干粉重量的1：1：1比例要求加以混合配制。 

实例3．小核酸多肽纳米粒的制备和细胞转染 

分别将上述小核酸活性成分的混合物和透皮穿膜肽（从北京吉利奥生物技术发展有限公司购买）构溶解在医用级去离子水中，混合均匀10min,根据核酸与多肽的重量百分比：即1：10到1：100，在搅拌状态下再将小核酸活性成分的溶液缓慢滴加透皮穿膜肽的溶液中,继续搅拌使小核酸活性成分和透皮穿膜肽能充分混合，静止20分钟，让其充分自组装成纳米颗粒，备用。 

为了提高小RNA诱导人间质干细胞向造血干细胞转决定的效率，本发明进一步优化了具体的诱导方案，这里公开的8种诱导配方见表1。从中可见方案3中的第二种诱导配方的效率最高，即通过每天一次共二次的转染，能使80%的人间质干细胞转决定成造血干细胞。比我们原来的诱导方法大为改进，使通过此技术能获得临床级的造血干细胞成为可能。进一步将可用于血液病如再生障碍性贫血和白血病的治疗 

表1.人间质干细胞向造血干细胞转决定的诱导方案 

表2.靶向EID1mRNA不同位点的siR-EID1分子的序列 

实例4．小核酸-多肽纳米粒诱导间质干细胞转决定成造血干细胞 

转染miRNA-433和miR-138到人间质干细胞后1到2天，贴壁的梭形间充质干细胞转变成圆形的悬浮的干细胞。在造血干细胞诱导扩增培养基中（配方见表3）以5X10⁵/ml细胞密度培养至少3天，这些干细胞逐渐丢失了间充质干细胞的特征性抗原（如CD44、CD73、CD105、CD166、CD29、Flk-1）和同时获得了造血干细胞的表面抗原（如CD34、CD133、CD49f、CD38、CD45、CD41和CD90）（见图4）。并得到快速的扩增。 

对这些转化后的干细胞进行FACS双抗标记分析，结果显示这些干细胞中，90%的细胞表达长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的表面标志性抗原如CD34、CD133、CD150、CD49f、CD45、CD41和CD90，只有10%的细胞表达造血祖细胞的表面标志性抗原如CD38和FLK2（见图5）。 

用RT-PCR方法对这些转化的干细胞进行检测，发现它们能高表达许多与造血有关的重要基因如Runx1,Bmi1,HoxB4,Gata1,Gata2,Gfi1,Sall4,Pu.1,Scl。Mcl，C-myc，C-myb,Kcl4,Cxcr4,和Crb，从而使它们在基因表达方面更加相似于自然发生的造血干细胞，而不同于它们来自的间充质干细胞（见图6）。这些调控造血的关键基因的激活使间充质干细胞转决定成造血干细胞成为现实。 

为了明确证实这些转化的单一细胞通过培养能够自我更新，将转染过的单 一干细胞分离出来再接种到涂有甲基纤维素的24孔培养板（购于Corning公司）的中，并向培养基中加入诱导造血干细胞细胞扩增的细胞因子和其它必需成分（配方见表3），培养条件为37°C，5%CO₂。本发明公开的造血干细胞诱导扩增培养基的配方见表1。第15日在显微镜下观察，可以看到有细胞集落的形成（见图7）。该方法较目前广泛使用的造血干细胞集落培养方法更有效更快速。目前通常使用的培养方法容易导致造血干祖细胞的分化和较低的扩增倍数。 

表3.造血干细胞扩增用培养基配方 

成分 含量 DMEM/F12基础培养基 80-100%（v/v） Sonic hedgehog(shh) 0-1μg/ml Delta1 0-1μg/ml FGF2 0-1μg/ml IGFBP 0-1μg/ml SCF 0-1μg/ml Angiopoietin 0-1μg/ml TPO 0-1μg/ml MBP 0-1μg/ml LIF 0-1μg/ml TGF-β 0-1μg/ml MTEPA 0-100μM NAC 1-5mM

实施例5.二次移植实验表明这些转化的造血干细胞能够重建造血功能 

将转染有小RNA分子的间质干细胞分别移植到经临界致死剂量的放射处理的小鼠体内。10周后能够检测到由人脂肪间质干细胞分化成的造血细胞。然后从小鼠骨髓中分离出植入的人脂肪间质干细胞来源的造血干细胞，再次移植到经临界致死剂量的放射处理的其它小鼠体内，10周后利用抗人源性单克隆抗体对鼠的骨髓进行FACS分析，发现在经临界致死辐射剂量的放射处理的小鼠的骨髓中能够检测到造血干细胞祖细胞基因标志分子的表达，这些造血祖细胞 (M-HSCs)能够进一步分化成以特征表达CD33，CD13，CD19，CD3，CD235，CD61和CD56等分子标志物的血细胞（见图8）。可见这种诱导的造血干细胞将可用于血液病如再生障碍性贫血和白血病的治疗。 

由于采用了上述技术方案，一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，包括下列步骤：1）制备均质的间充质干细胞的培养基；2）多种小RNA分子的组合；3）核酸多肽纳米粒的组装和转染；4）转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基；5）激活多种造血相关的基因，解决了现有技术造血干细胞治疗中的细胞配型困难、免疫排斥和造血干细胞数量限制的技术瓶径的问题，这种诱导的造血干细胞将可用于血液病如再生障碍性贫血和白血病的治疗。 

本发明的方法提供了一些内源性miRNAs及其它们的衍生物，他们不同与我们原先的专利中介绍的那种干茎段全互补的shRNA，一种全新的造血干细胞的源泉，具有高的多的转化效率，比我们原先专利中介绍的方法提高了8-10倍，使临床应用成为可能，有效解决了高效将小RNA转染进原代间充质干细胞的瓶颈问题，有效防止了造血干细胞扩增中极易分化为下游血细胞的事态发生，高效地激活了与造血干细胞发生有关的多种基因。 

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 

图1是人脂肪间充质干细胞表面的特征性抗原。流式细胞仪分析显示人脂肪间充质干细胞是CD29,CD44,Flk1,CD90,CD105,CD71和CD166阳性的,CD133,CD38,CD33和CD45阴性的； 

图2是miRNA-138-1，miR-138-2和miR-433分子的二级结构； 

图3是不同的小RNA分子能够有效地沉默它们的靶基因EID1； 

图4是人间充质干细胞向造血干细胞转决定时，细胞表面特征性抗原的变化； 

图5是转决定后的造血干祖细胞的分类和所占的百分比； 

图6是PCR电泳分析比较人间充质干细胞，造血干细胞，和转染不同小RNA 分子后的干细胞中的造血相关基因的表达差异； 

图7是转决定后的造血干细胞的集落形成和细胞形态； 

图8是转决定后的造血干祖细胞在小鼠体内的第二次植入和分化为各种血细胞的情况。 

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 

一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法，包括下列步骤： 

1）制备均质的间充质干细胞的培养基； 

2）多种小RNA分子的组合； 

3）核酸多肽纳米粒的组装和转染； 

4）转决定后的造血干细胞诱导扩增培养基； 

5）激活多种造血相关的基因。 

所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的EGF，FGF-2,lPDGF，IGF和TGF-β五因子。 

所述培养基是指在无血清的高糖DMEM/F12培养基中添的shh，SCF，TPO，Flt3L，Delta1，IGFBP，Angiopoietin，MBP4，LIF，TGF-β十因子。 

所述多种小RNA分子是指miR-138-1，miR-138-2，miR-433以及靶向EID1mRNA不同位点的siR-EID1分子的序列。 

所述靶向EID1mRNA不同位点的siR-EID1分子的序列见表2。 

所述转决定后的造血干细胞培养是指在造血干细胞诱导扩增培养基中以5×10⁵/ml的细胞密度进行培养至少3天，最终使间充质干细胞转变成造血干细胞。 

核酸多肽纳米粒的组装是指不同的小RNA分子与多肽转染试剂按一定配比、程序和时间的配制过程（请见实例3），通过每天一次共二次的转染以达到最佳的诱导效率。 

所述激活多种造血相关的基因是指Runx1,Bmi1,HoxB4,Gata1,Gata2,Gfi1, Sall4,Pu.1,Scl，Mcl，C-myc，C-myb,Kcl4,Cxcr4,和Crb，但不局限于这些基因。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。