羊水间充质干细胞对肝衰竭治疗的基础研究——体外人源性羊水与骨髓间充质干细胞生物特性及肝细胞方向诱导分化能力比较研究——转IL-1Ra基因羊水间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠动物模型的治疗研究

摘要

研究表明急性肝衰竭严重威胁着人民身体健康，是人类目前主要的死亡原因之一。目前原位肝移植仍是急性性肝衰竭和终末期肝病有效的治疗途径，然而供肝来源匮乏、免疫排斥、重叠感染等并发症的各种严重缺陷而限制它的应用。对于急性肝衰竭患者在等待肝移植或自体肝细胞再生的危重期，生物型人工肝可以真正起到一个“桥梁的作用”。但是根据近来研究表明目前的生物型人工肝系统主要是包含动物肝脏细胞，故不可避免存在免疫排斥和传播动物源性疾病的限制。近来研究表明具有多向分化潜能的干细胞在特定培养条件可以分化成骨、软骨、脂肪、肌肉及内皮组织；现在研究较多的干细胞为胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞，两者都具有不可避免的缺陷：ESCs的论理学限制、体内成瘤性以及BM—MSCs数量不足和分化潜能有限的问题；最近研究发现来源孕中期羊水的干细胞可以分化成多胚层细胞，在一定条件下可以向脂肪细胞、骨细胞、肌肉细胞及肝脏细胞方向分化，而且羊水间充质干细胞可以避免伦理限制和来源受限的缺陷，故将成为临床肝细胞移植新的细胞来源。然而对于肝细胞方向的分化及与骨髓间充质干细胞比较目前没有相关报道；同时有研究显示间充质干细胞可以较为容易被外源基因转入，故成为病毒转染理想的细胞载体。 然而，近来研究报道急性肝衰竭是一种伴有大量免疫炎症因子参与的炎性疾病，发生急性肝衰竭时可见白介素-1、肿瘤坏死因子—a、白介素—6和白介素—8等炎症因子的升高；相对过急的肝内免疫炎症反应被认为是FHF发病关键的病理机制。既往的研究发现FHF患者血清对肝细胞具有毒性损害作用，同时又有研究发现FHF患者血清在体外可以诱导肝脏细胞的调亡；在FHF患者体内表现急性大量的肝脏细胞的调亡和坏死。最新的研究显示FHF时升高的免疫炎症因子不仅对自体肝细胞再生有细胞毒性作用，同时对移植入体内的干细胞向肝脏细胞的分化也有毒性损害。在这些因子中，IL-1在免疫炎症级联反应中起着始动的关键作用，并可广泛作用于多种细胞导致组织的损伤。因此，在干细胞修复治疗的基础上联合阻断炎症因子的反应将成为FHF新的治疗方法。 白介素-1受体拮抗剂是自然存在IL-1家族中的一员，它能竞争性结合IL-1来阻断IL-1的功能；研究表明IL-1Ra具有多效性生物学作用，包括T淋巴细胞共刺激、B淋巴细胞增殖、纤维细胞生长、黏附分子的诱导以及其他炎症介质产生的刺激等作用。IL-1/IL-1Ra的平衡决定机体对感染的炎症性。Sekiyama等检测了FHF和急性肝炎患者血清中IL-1b和IL-1Ra浓度发现IL-1Ra/IL-1b比值在死亡组中明显低于存在组；因此，IL-1和IL-1Ra之间的失衡是FHF的重要发病机制之一；IL-1在急性和慢性肝炎发病中起着抗炎作用。另外有研究发现IL-1Ra还具有抗调亡作用，对肝细胞具有保护性作用。 基于以上国外研究基础上，本研究拟对羊水MSCs和骨髓MSC生物学特性包括肝细胞分化潜能进行比较研究，最终为了寻找出肝脏细胞合适的干细胞来源；同时我们拟制作大鼠FHF动物模型，并应用转染外源IL-1Ra基因的羊水MSC对FHF大鼠动物模型进行治疗的动物实验研究，观察对FHF大鼠炎症反应下调、促进肝脏细胞再生和抑制肝脏细胞调亡的情况；最终改善大鼠FHF模型生存率，为FHF治疗探索出一条新的途径。全文分为两个部分： 第一章：体外人源性羊水与骨髓间充质干细胞生物特性及肝细胞方向诱导分化能力比较研究； 第二章：转IL-1Ra基因羊水间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠动物模型的治疗研究； 第一章：体外人源性羊水与骨髓间充质干细胞生物特性及肝细胞方向诱导分化能力比较研究 1.材料和方法： 羊水MSCs分离于进行产前基因诊断的18份孕中期(16-20周)羊水标本，骨髓MSCs分离于10份健康成人骨髓(平均年龄30岁)；分别在体外用细胞形态学，细胞增殖动力，流式细胞仪，RT—PCR及免役荧光(Immunofluorescence，IF)来分析和研究两种MSCs生物学特性和肝细胞分化潜能，以及未分化的和分化28天后的两种MSC进行染色体核型分析，并对其生物学特性进行相应的比较。 2.结果： 在体外羊水MSCs倍增潜能是高于骨髓MSCs；与骨髓MSCs相比AF—hMSCs表现出较好的生长特性：生长曲线较陡直、相对较短的倍增时间(约48 h与72h)和培养更多的代数(28±1.5代与12.3±1.7代).流式细胞仪分析结果显示羊水MSCs和骨髓hMSCs表面表达分子是一致的，表达阳性的分子分别为CD29、CD44、HLA—ABC(MHC classⅠ)，对CD106分子表达弱阳性，但是对CD19、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA—DR(MHC classⅡ)分子阴性表达。实时荧光定量RT—PCR分析显示：与比骨髓MSCs，羊水MSCs表达较高水平的Oct—4 mRNA(Oct—4 transcription factor—4)(第10代0.887±0.277与0.567±0.165，P<0.01)；在诱导分化的不同时间点，羊水MSCs表达的肝细胞特异基因mRNA水平高于骨髓MSCs，特异基因包括甲胎蛋白(alpha—fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)、CK18基因水平高于BM—hMSCs(在14天分别P<0.01，P<0.01和P<0.01)，肝细胞核因子1a(hepatocyte—nuclearfactor，HNF1a)和转录因子CCAAT增强子结合蛋白a(CCAAT—enhancer binding proteinC/EBP)(在21天分别P<0.01，P<0.01)，细胞色素P450酶1A1(cytochrome P450，CYP1A1)(在28天P<0.05)。免役荧光检测显示分化的羊水MSCs在表达肝细胞表面特异蛋白也是优于骨髓MSCs的；肝细胞功能性分析也显示在诱导21和28天，羊水MSCs组分泌的尿素(Urea)水平是明显高于骨髓MSCs组的(分别为1.274±0.054与1.027±0.107和1.377±0.155与1.11±0.078，P<0.01和P<0.05)；但是PAS(Periodic—acid—Schiff)染色显示经诱导的羊水MSCs在糖原储备能力上与骨髓MSCs是相同的；染色体核型分析显示，未分化的和分化28天后染色体核型未见重组和畸形，说明了AF—hMSCs与骨髓MSC在遗传稳定性是相同的。 3.结论： 我们的研究结果显示，与骨髓MSCs比较，羊水MSCs在体外较易于分离培养及较强的倍增能力，同时具有较好的肝细胞方向的分化潜能，这些说明羊水MSCs将来可能为各种肝脏疾病提供一个更好肝细胞来源。第二章：转IL-1Ra基因羊水间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠动物模型的治疗研究 1、方法： 在本研究中，从孕SD鼠13±1d分离出约0.8ml羊水标本，分离培养出鼠源性羊水MSCs，采用慢病毒载体转染外源的IL-1Ra基因进入羊水MSCs，并用D—氨基半乳糖诱导SD大鼠FHF模型；实验动物分为4组每组分别为9，10，13，11只：Ⅰ、生理盐水(PS)组(注射PS)，Ⅱ、GFP/MSCs组(注射GFP/MSCs)，Ⅲ、MSCs/IL-1Ra组(注射MSCs/IL-1Ra)，Ⅳ、目的病毒组(LV—IL—Ra)(注射LV—IL—Ra)：将转IL-1Ra基因羊水MSCs从门静脉移植入肝衰竭动物模型肝脏内。动物实验中检测观察肝内IL-1Ra蛋白的表达(免疫荧光、Westen—Blot)、肝脏损伤程度(肝脏酶学、病理组织切片)、肝细胞再生(Brdu标记免疫组织化学)、IL-1Ra/白介—6(IL—6)水平(ELISA)、移植入肝内的干细胞分化成肝细胞白蛋白的表达(GFP标记+免疫荧光)以及动物生存率(Kaplan—Meier plot生存曲线分析)。 2、结果： 慢病毒IL-1Ra基因载体转染羊水MSCs后，通过流式细胞仪分析可以达到96.53％的转染率；过表达IL-1Ra基因的羊水MSCs能够显著地降低FHF的死亡率，PS组、GFP/MSCs组、Lv—IL-1Ra组和IL-1Ra/MSCs组14天生存率分别为22.2％，30.0％，63.6％和69.2％.结果表明：IL-1Ra/MSCs组(实验组)和Lv—IL-1Ra组(阳性对照组)明显高于MSC/GFP组(阴性对照)和PS组(空白组)(P<0.05)。GFP标记示踪显示IL-1Ra/MSCs可以肝内定居并分泌白蛋白；而且IL-1Ra/MSCs可以通过抑制肝脏细胞调亡和促进肝细胞再生来改善肝脏功能；同时IL-1Ra/MSCs可以通过表达hIL-1Ra来下调IL-1激发的过激的炎症反应减轻肝脏炎症损伤，从而改善肝脏功能，提高生存率。 3、结论： 转IL-1Ra基因羊水MSCs通过门静脉移植进入肝脏内可以成为SD大鼠FHF治疗的有效方法之一；转IL-1Ra基因羊水MSCs有望成为急性肝衰竭治疗的新途径之一。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章：体外人源性羊水与骨髓间充质干细胞生物特性及肝细胞方向诱导分化能力比较研究

1.1材料与方法

1.2统计学分析

1.3结果

1.4讨论

1.5参考文献

第二章 转IL-1Ra基因羊水间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠动物模型的治疗研究

2.1材科与方法

2.2统计学分析

2.3结果

2.4讨论

参考文献

结束语

附录-1 主要英文缩略词表

附录-2 攻读学位期间发表的论文

附录-3 综合

致谢