与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的SSR及InDel分子标记引物及应用

摘要

本发明公开了与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物及应用。该标记引物的获得是以橙色大白菜和普通白色大白菜及其F2S4分离群体的基因组DNA为模板，通过480对SSR及InDel引物对F2S4中橙色叶球和白色叶球单株DNA混合池进行多态性引物筛选，然后通过对F2S4群体的单株进行分析，筛选与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记，成功获得了与Br-or基因连锁的15个Br-SSR及3个Br-InDel标记引物，在第9连锁群上（A09）构建了大白菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传图谱。连锁分析发现Br-or基因两侧连锁最紧密两标记的遗传距离分别为0.11cM和0.79cM，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。为大白菜橙色叶球性状的分子辅助选择育种提供依据，加快育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与大白菜橙色叶球基 因Br-or连锁的SSR及InDel分子标记引物的开发及应用。

背景技术

大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)属十字花科芸薹属芸薹 种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，与人们的日常生活密切相 关，近年来，随着人们生活水平的提高，人们对大白菜品质的要求日益高涨。 因此，大白菜品质育种受到越来越多国内外学者，育种家的重视。

申请人从1993年开始进行橙色大白菜育种，其配置的大白菜一代杂种 “金冠1号”和“金冠2号”橙色大白菜，于2004通过陕西省审定，受到 国内外的广泛关注，同时也获得了大白菜生产者和消费者的青睐。但是，橙 色大白菜的颜色直到其结球末期才能表现出，而且得采用田间逐个剖球观 察，操作起来费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快橙色大白菜 的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。

随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应 运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），又称为微卫星DNA（microsatellite，DNA），是一 类由1-6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如（CA）n，（ATG）n，（TAGG） n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数 的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和 EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰 富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、 基因定位和分子标记辅助育种等研究领域（Tautz and1994； Powell et al.，1996）。

插入/缺失多态性（Insertion/Deletion，InDel）标记是由于同一位点处的 DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧 的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标 记。InDel标记是根据同源序列之间的插入缺失差异来开发的，这对于基因 组序列未知的作物而言开发具有一定的难度。InDel标记为一共显性标记， 具有较好的稳定性及多态性丰富等优点，已被广泛应用于品种的多态性分析 （Katherine et al.，2008）、基因的精细定位及图位克隆（Pan et al.，2008） 等。

因此，基于以上SSR及InDel标记的优点，申请人利用大白菜的测序结 果，开发并成功筛选出与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的分子标记， 并构建了Br-or基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行 橙色大白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的 SSR及InDel分子标记引物，应用该SSR及InDel分子标记引物，在苗期即 可鉴定区分橙色叶球和白色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选 择的效率。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物， 其特征在于，包括以下15个Br-SSR引物对和3个Br-InDel引物对中的至 少一对，即可将橙色与白色大白菜区分开；同时使用这多个标记能提高选择 的准确性。其中：

引物对Br-InDel（1）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TGAAATGACCCGTCTGTTGA－3＇

下游引物（R）：5＇－TTGTCTTGCGAAGAGGATGT－3＇

引物对Br-InDel（2）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TCAGATGAAGAGCGTAGGAG－3＇

下游引物（R）：5＇－AAAAGAGGGAGACAAGATGC－3＇

引物对Br-InDel（3）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TTCTTCTTCCTCACGCACTC－3＇

下游引物（R）：5＇－GCTCGCCTTCTAAACTGAAT－3＇

引物对Br-SSR（1）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－CCATCAACAAACTCAACCCTG－3＇

下游引物（R）：5＇－CTCTGTTCATAAATACGCCTC－3＇

引物对Br-SSR（2）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－GGTCCGCACAACATATCCTT－3＇

下游引物（R）：5＇－TTGTAGCGGTGTCTAAGCAG－3＇

引物对Br-SSR（3）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－ACGCTCACCGTGCTTCCTTG－3＇

下游引物（R）：5＇－TTCACTTTGCCTTTGTTTCT－3＇

其中所述引物对Br-SSR4的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－CCACTCCCTGTATTCCTTATC－3＇

下游引物（R）：5＇－ATCACGTCTACTGGTGCTATG－3＇

引物对Br-SSR（5）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－GTTTGGTCTGTTTCGGCACT－3＇

下游引物（R）：5＇－GCCAAAACAAATCTGCTTGA－3＇

所述引物对Br-SSR（6）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇-GTGGGATTTCTGGAGCTTTCA-3＇

下游引物（R）：5＇－AATCTAAACCTGGACCGCAAC－3＇

引物对Br-SSR（7）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－AAGACACCGTGAGTATCTTCT－3＇

下游引物（R）：5＇－TTTCGTCTATTCTTGCTGGAT－3＇

引物对Br-SSR（8）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TGTGAATGTGCGAATTTTGA－3＇

下游引物（R）：5＇－TCCTCCTACGCTCTTCATCT－3＇

引物对Br-SSR（9）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TTACGCTCAAGTTCCTGAAT－3＇

下游引物（R）：5＇－GCGATGTACGCTAACGAGAT－3＇

引物对Br-SSR（10）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TTGGTTTCACTGATGTTTCT－3＇

下游引物（R）：5＇－CCATATTTGGTTGATTGTTC－3＇

引物对Br-SSR（11）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－AGCTCCTGTATGGAACTCAA－3＇

下游引物（R）：5＇－TTCCTTTCTTCTGACAAATC－3＇

引物对Br-SSR（12）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－AATCAACGAAAACGAGGAAT－3＇

下游引物（R）：5＇－GCTCAGATAGAGAAAGGGGG－3＇

引物对Br-SSR（13）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－TGTAACTTAAAGAAAACCAAAA－3＇

下游引物（R）：5＇－CATCACArACTAATCAACCAGA－3＇

引物对Br-SSR（14）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－GTAATGGAGAGTGATGATGA－3＇

下游引物（R）：5＇-TTTGGAACTAAATTGTTTGT-3＇

引物对Br-SSR（15）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：

上游引物（F）：5＇－ATTTGGATCGTTGATTGAAT－3＇

下游引物（R）：5＇－ACTTTTTGCTTGTTTGTTTT－3＇

采用上述与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标 记引物，在苗期即可鉴定区分橙色叶球和白色叶球大白菜，从而淘汰非目标 植株，大大提高选择的效率。同时大白菜橙色叶球基因Br-or分子遗传图谱 的构建可加快克隆该基因。

所述的大白菜橙色球叶基因克隆的方法是：PCR扩增大白菜基因组DNA 的多态性片段大小约为150bp、208bp、182bp、122bp、189bp、203bp、193bp、 114bp、261bp、168bp、123bp、200bp、175bp、234bp、212bp，分别为与大 白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记Br-SSR（1－15）的PCR扩增产物； 扩增大白菜基因组DNA的多态性片段大小约为280bp、152bp、120bp，即 为与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记Br-InDel（1－3）的PCR扩 增产物。其中11个标记（Br-SSR（8－15）及Br-InDel（1－3））位于Br-or 的一侧，与Br-or的遗传距离分别为0.38cM、0.38cM、0.44cM、0.43cM、 1.43cM、1.98cM、2.33cM、2.96cM、0.11cM、0.38cM、1.05cM；7个标记 （Br-SSR（1－7））位于Br-or的另一侧，与Br-or的遗传距离分别为5.01cM、 3.11cM、2.57cM、1.17cM、1.17cM、0.79cM、0.79cM，离Br-or最近的两 侧标记分别为Br-InDel（1）和Br-SSR（6）。

本发明首次获得了与大白菜橙色叶球基因Br-or最为紧密连锁的分子标 记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益 效果表现在：

（1）获得了在第9连锁群（A09）上构建了大白菜橙色叶球基因Br-or 的分子遗传图谱，且在国际上首次获得与Br-or基因最紧密连锁的分子标记 Br-InDel（1）和Br-SSR（6），可在橙色叶球大白菜分子标记辅助育种及Br-or 基因克隆中发挥重要的作用。

（2）获得了与Br-or紧密连锁的分子标记，并构建了其高密度遗传图 谱。其中Br-InDel1与Br-or连锁最为紧密，其遗传距离为0.11cM，能够帮 助该基因向推广品种中转移以及与其他抗病、抗逆基因的聚合。

（3）鉴定方便。这18个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方 便、快速等优点。用这18个分子标记检测Br-or基因，可以确定Br-or的 存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有Br-or基因的植株，并用于高类 胡萝卜素大白菜品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境 对品种的影响，提高选择的准确性。

（4）提高橙色叶球大白菜的选择效率。在传统的橙色大白菜鉴定过程 中，必须等到大白菜结球末期进行剖球才能对橙色性状进行观察统计，因此 橙色大白菜的选育不仅费时，而且难度大，成本高。用本发明的分子标记引 物，通过检查与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的分子标记，可将表型 鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分橙色和白色叶球大白菜，从而淘汰非 目标植株，因此，利用本发明的与Br-or基因紧密连锁的分子标记，不仅节 约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。

（4）可用于克隆大白菜橙色叶球基因的研究。图位克隆大白菜橙色叶 球基因Br-or的前提在于获得与Br-or紧密连锁的分子标记。Br-InDel（1） 和Br-SSR（6）在所有已知的分子标记中与Br-or连锁最为紧密，为克隆 该基因提供基础。

附图说明

图1是大白菜橙色叶球基因Br-or的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的 标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。

图2是Br-InDel（1）在橙色和白色混合池及F₂S₄代单株中的扩增结果。 泳道信息：（从左到右）M，50bp DNA ladder；BO是纯合橙色单株池； BW是纯合白色单株池，8个纯合白色单株；8个纯合橙色单株；8个杂合 白色单株。

图3是Br-SSR（6）在橙色和白色混合池及F2S4代单株中的扩增结果。 泳道信息：（从左到右）8个纯合白色单株；8个纯合橙色单株；8个杂合白 色单株；BO是纯合橙色单株池；BW是纯合白色单株池；M，50bp DNA ladder。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生 化试剂。

本发明的与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标 记引物是通过以下步骤获得的：

（1）群体材料准备

以橙色叶球大白菜“11S39-2”为母本（原名01S1024，为金冠2号大 白菜的亲本，公开于《西北农业学报》2007，01期、205页，张鲁刚，惠麦 侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠2号”的选育[J]：204-206），白菜叶球 大白菜“11J15”为父本（原名92S24，公开于《中国蔬菜》，2010，14期、 35页第16行，牛娜，郑晨光，张鲁刚，胥宇建，张立志，付文婷.大白菜 裂球性状的遗传与RAPD标记[J].44-48）杂交产生的F₁群体，然后通过单 粒传获得其F₂S₄群体。

（2）大白菜单株基因组总DNA的提取

A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液 氮中速冻，用质量分数为75%的酒精清洗过的干净塑料研棒迅速研磨至粉 末；

B、向离心管中加700μl经65℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％， Tris-HCl（pH=8.0）：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L）， 再加入8μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C、随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5min分钟摇一次，水 浴30min；

D、取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿： 异戊醇=25：24:1），摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；

E、将上层液相（约700μl）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿 和异戊醇混合溶液（氯仿：异戊醇＝24：1），轻轻摇匀10min，常温下 12000r/min离心10min；

F、取上清（约500μl），加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使 DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下12000r/min离心10min；

G、弃上清，加入500μl质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉 淀物室温晾干；

H、加入500μl的TE缓冲液溶解DNA，加入0.3μl的RNaseA（10μg/μl）， 混匀后稍离心，37℃保温30min；

I、加入3mol/L的NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻 轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；

J、在4℃条件下，12000r/min离心10min，弃上清，加入质量百分数为 75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl～500μl的灭 菌ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20℃保存备用；

（3）DNA池的构建

从“11S39-2”与“11J15”的F₂S₄分离群体中，根据叶球颜色调查结果， 随机取典型的10个纯合橙色叶球单株和10个纯合白色球色单株株的DNA 样品，等量混合组成橙色单株DNA池（BO）和白色单株DNA池（BW）。

（4）SSR及InDel序列的获得

从白菜基因组网站（http://brassicadb.org/brad/）下载白菜A09连锁群从 349189811到37123981的DNA序列。利用SSRHunter软件对该序列内的 SSR位点进行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR 基序（motif）的最小重复数分别为5，4，3，3和3次。将检索得到的含SSR 位点的序列在芸薹属基因组网站（http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/）进行同源 性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85%以上，同时有3条以上的同 源序列与该序列存在SSR位点差异。在Blast过程中发现，虽然有些序列与 该SSR引物序列不存在SSR差异，但是在其侧翼序列存在InDel差异，将 该InDel差异在同源序列中出现3次以上的序列作为目标InDel引物序列。

（5）SSR及InDel分子标记引物设计

根据SSR、InDel差异位点两端的序列，采用Primer5软件对符合条件 的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃~60℃，最佳温 度为55℃；引物长度18bp~24bp；产物大小为100bp~300bp；引物（G+C） 含量为40%~60%，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工 生物工程（上海）股份有限公司合成。

（6）多态性引物筛选和SSR及InDel分子标记分析

用橙色大白菜单株DNA池（BO）和白色大白菜单株DNA池（BW） 作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析。

所述的PCR扩增包括：20μl PCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq 酶1U，10μmol的上、下游引物各0.8μl，10mM dNTPs0.32μl，10×PCR buffer2.0μl，25mM MgCl₂1.2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl； PCR反应程序为：先94℃，变性5min；然后94℃，变性30s，56℃，复 性1min，72℃，延伸1min，共30个循环；最后72℃，延伸10min，4℃保 存。

选用所设计的480对引物，将橙色单株池与白色单株池间表现出相同多 态性的引物重复分析3次，然后在建池的30株极端个体间进行多态性验证， 如果扩增结果与在两池间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于 F₂S₄代单株的SSR及InDel分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型 资料与田间对球色调查统计的结果，利用JoinMap3.0软件构建了大白菜橙 色叶球基因Br-or的分子遗传连锁图，获得了与Br-or紧密连锁的15个SSR 标记；3个InDel标记。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例1：Br-InDel（1）引物的应用

（一）采用CTAB法提取白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：

A.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5ml的离心管中，放入液氮 中速冻，用质量分数75%的酒精清洗过的干净塑料研棒迅速研磨至粉末；

B.向离心管中加700μl经65℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％， Tris-HCl（pH8.0）：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L），再 加入8μl的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C.随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5min分钟摇一次，水 浴30min；

D.取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿： 异戊醇=25：24：1），摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；

E.将上层液相（约700μl）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和 异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10min，常温下12000r/min 离心10min；

F.取上清（约500μl），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA 抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下12000r/min离心10min；

G.弃上清，加入500μl质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀 物室温晾干；

H.加入500μl的TE缓冲液溶解DNA，加入0.3μl的RNaseA（10μg/μL）， 混匀后离心，37℃保温30min；

I.加入3mol/L NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混 匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；

J.在4℃条件下，12000r/min离心10min，弃上清，加入质量分数为75 ％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl-500μl灭菌的 ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；

（二）PCR扩增

用橙色单株DNA池（BO）和白色单株DNA池（BW）作模板，按照 下述PCR扩增条件和程序进行分析，

①PCR扩增条件：20μl的PCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq 酶1U，10umol的上、下游引物各0.8μl，10mM dNTPs0.32μl，10×PCR buffer2.0μl，25mM MgCl₂1.2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl。

②PCR反应程序为：先94℃，5min；然后94℃，30s，56℃，1min， 72℃，1min，共30个循环；最后72℃，10min，4℃保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。

（三）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）6%变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：

①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空 置晾干，洗板时应将长板和短板分开，避免相互污染。

②涂板：Repel（剥离硅烷）溶液（3ml氯仿+300μl Repel）均匀地涂 在短板上，Binding（亲和硅烷）溶液（3ml无水乙醇+10μl冰醋酸+10μl Binding）均匀地涂在长板上，室温放置20min。在涂板过程中，注意避免两 种溶液相互污染。Repel、Binding溶液的作用：便于丙烯酰胺凝胶固定在长 板上，卸胶板时易于与短板分离。

③灌胶：装上长板和短板，调至水平，预检查梳子插入的最佳位置。 取50ml，6％的变性PAGE凝胶溶液，加300μl浓度为10％的过硫酸氨（APS） 和40μl的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调 至水平，用夹子夹紧（以防点样时漏样），室温下胶板凝固1h。

（2）电泳：

①预电泳：从胶板中将梳子小心拔出，将插梳子的胶板上端清洗干净， 用纸擦干玻璃板（以防电泳时短路）。将胶板装到电泳槽中，加入适量1× TBE电泳缓冲液，再将梳子轻轻插入，其深度为刚进入胶面1mm处。接通 电源，恒功率70W预电泳30min，用移液器将点样孔中的气泡逐个赶出。

②电泳检测：冲洗加样孔析出的尿素，取变性后的PCR扩增产物3μl， 恒功率70W电泳至溴酚兰距胶板底部5cm-10cm时停止电泳（约45min）。

（3）银染步骤：

①固定：将玻璃板从电泳槽取出，拔出梳子，轻轻将长板取下，放入2 L浓度为10％的醋酸溶液中，轻轻摇动20min。

②漂洗：取出长板，用蒸馏水漂洗2次，每次3min。

③染色：在2L蒸馏水中加入2g硝酸银，避光染色约10min。

④显影：在蒸馏水中迅速漂洗后，转入预冷的1L含甲醛的氢氧化钠溶 液中（15g氢氧化钠固体溶于1L蒸馏水+4ml甲醛），显影至条带清晰为止。

⑤终止：将板取出放入醋酸溶液中，终止2min。

⑥漂洗：将板放入蒸馏水中漂洗10min，自然风干，照相。

（四）多态性引物筛选及InDel标记分析

选用所设计的480对引物，将橙色单株池与白色单株池间表现出相同多 态性的引物重复分析3次，然后在建池的30株极端个体间进行多态性验证， 如果扩增结果与在两池间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于 F₄代单株的InDel分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型资料与田 间对球色调查统计的结果，利用JoinMap3.0软件构建大白菜橙色叶球基因 Br-or的分子遗传图谱，获得了与Br-or最为紧密连锁的InDel标记，即 Br-InDel（1）。

实施例2：Br-SSR6引物的应用

（一）采用CTAB法提取白菜基因组DNA,提取步骤如下所示：

A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液 氮中速冻，用75%酒精清洗过的干净塑料研棒迅速研磨至粉末；

B、向离心管中加700μL经65℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％， Tris-HCl（PH8.0）：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L），再 加入8μLβ-巯基乙醇，迅速混匀；

C、随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5min分钟摇一次，水 浴30min；

D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物， 摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；

E、将上层液相（约700μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿： 异戊醇（24:1），轻轻摇匀10min，常温下12000r/min离心10min；

F、取上清（约500μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使 DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下12000r/min离心10min；

G、弃上清，加入500μl75%乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；

H、加入500μL TE缓冲液溶解DNA，加入0.3μL RNaseA(10μg/μL)， 混匀后稍离心，37℃保温30min；

I、加入3mol/L NaAc溶液50μL和2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混 匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；

J、在4℃条件下，12000r/min离心10min，弃上清，加入质量分数为 75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl-500μl灭菌的 ddH₂O溶解使用，或加入质量分数为75％的乙醇-20℃保存备用；

（二）PCR扩增

用橙色单株DNA池(BO)和白色单株DNA池(BW)作模板，按照下 述PCR扩增条件和程序进行分析，

①PCR扩增条件：20μlPCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq酶 1U，10μmol的上、下游引物各0.8μl，10mM dNTPs0.32μl，10×PCR buffer 2.0μl，25mM MgCl₂1.2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至2μl。

②PCR反应程序为：先94℃，变性5min；然后94℃，变性30s，56℃， 复性1min，72℃，延伸1min，共30个循环；最后72℃，延伸10min，4℃ 保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。

（三）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）6%变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：

①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置 晾干，洗板时应将长板和短板分开，避免相互污染。

②涂板：Repel（剥离硅烷）溶液（3ml的氯仿+300μl的Repel）均匀地 涂在短板上，Binding（亲和硅烷）溶液（3ml无水乙醇+10μl冰醋酸+10μl Binding）均匀地涂在长板上，室温放置20min。在涂板过程中，注意避免 两种溶液相互污染。Repel、Binding溶液的作用：便于丙烯酰胺凝胶固定在 长板上，卸胶板时易于与短板分离。

③灌胶：装上长板和短板，调至水平，预检查梳子插入的最佳位置。 取50ml，6％的变性PAGE凝胶溶液，加300μl浓度为10％的过硫酸氨 （APS）和40μl的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置， 再将板调至水平，用夹子夹紧（以防点样时漏样），室温下胶板凝固1h。

（2）电泳：

①预电泳：从胶板中将梳子小心拔出，并将插梳子的胶板上端清洗干 净，用纸擦干玻璃板（以防电泳时短路）。将胶板装到电泳槽中，加入适量1 ×TBE电泳缓冲液，再将梳子轻轻插入，其深度为刚进入胶面1mm处。 接通电源，恒功率70W预电泳30min，用移液器将点样孔中的气泡逐个赶 出。

②电泳检测：冲洗加样孔析出的尿素，取变性后的PCR扩增产物3μl， 恒功率70W电泳至溴酚兰距胶板底部5cm-10cm时停止电泳（约45min）。

（3）银染步骤：

①固定：将玻璃板从电泳槽取出，拔出梳子，轻轻将长板取下，放入2 L浓度为10％的醋酸溶液中，轻轻摇动20min。

②漂洗：取出长板，用蒸馏水漂洗2次，每次3min。

③染色：在2L蒸馏水中加入2g硝酸银，避光染色约10min。

④显影：在蒸馏水中迅速漂洗后，转入预冷的1L含甲醛的氢氧化钠 溶液（15g氢氧化钠固体溶于1L蒸馏水+4ml甲醛）中，显影至条带清晰为 止。

⑤终止：将板取出放入醋酸溶液中，终止2min。

⑥漂洗：将板放入蒸馏水中漂洗10min，自然风干，照相。

（四）多态性引物筛选及SSR标记分析

选用所设计的480对引物，将橙色单株DNA池与白色单株DNA池间 表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后在建池的30株极端个体间进 行多态性验证，如果扩增结果与在两池间扩增结果一致，则将确实存在多态 性的引物用于F₂S₄代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株 基因型资料与田间对球色调查统计的结果，利用JoinMap3.0软件构建大白 菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传连锁图，获得了与Br-or较为紧密连锁的 SSR标记，即Br-SSR（6）。