一种利用基因重组酵母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法

摘要

本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体公开了一种利用基因重组酵母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法。该方法是利用基因工程技术构建能分别分泌表达内切葡聚糖酶EG、外切葡聚糖酶CBH和β-葡萄糖苷酶BGL的三种基因重组酿酒酵母菌株，然后将上述三种基因重组酵母菌株混合培养，并以纤维素原料为唯一碳源发酵，可较高效地将纤维素直接转化为乙醇。本发明方法将产酶、纤维素水解和乙醇发酵在一个体系中完成，不需额外添加纤维素酶，可在发酵过程中直接分解纤维素并转化为乙醇，省略了糖化步骤，简化了操作，节省了成本，是一套绿色环保低碳的纤维素乙醇生产工艺。

说明书

 

技术领域

    本发明涉及基因工程及发酵工程领域，更具体地，涉及一种利用基因重组酵

母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法。

背景技术

木质纤维素是自然界中含量最丰富的可再生资源，是植物组织构成的主要成分，占植物干重的20-45%。自然界中的木质纤维素由植物通过光合作用产生，而其中近90%尚未被人类有效利用，大部分被作为废料处理，不仅要耗费大量的人力物力，而且造成了环境污染和极大的浪费。木质纤维素原料主要由纤维素、半纤维素以及木质素构成。如果能充分利用其中的纤维素和半纤维素生产生物燃料乙醇，既可以保护环境，又能解决国际性的能源危机问题，同时能产生巨大的经济效益。

纤维素是一种由葡萄糖组成的高分子多糖结构，其酶解需要多个纤维素酶的协同作用完成，主要包括三类纤维素酶：内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）、外切葡聚糖酶，又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL）。EG能随机地切断纤维素长链内部的β-1,4-糖苷键，形成纤维寡糖；CBH则与EG分工，能作用于纤维素分子的结晶区，水解纤维素链末端的β-1,4-糖苷键，依次切下纤维二糖分子；而BGL则能将EG和CBH水解形成的纤维寡糖和纤维二糖继续水解为葡萄糖。最终获得的葡萄糖可被微生物发酵利用，如用酿酒酵母等可以将纤维素水解产生的葡萄糖发酵成为乙醇。

目前纤维素乙醇的生产工艺主要有以下几种：⑴分步糖化发酵（separate hydrolysis and fermentation，SHF）。SHF使水解和发酵分步进行。优点是酶解和发酵可在各自的最优条件下进行而不互相影响，缺点是酶解过程中积累的葡萄糖和纤维二糖会对纤维素酶产生末端产物抑制，从而影响酶的活力，同时操作复杂。⑵同步糖化发酵（simultaneous sacchari?cation and fermentation，SSF）和同步糖化共发酵（simultaneous sacchari?cation and co-fermentation，SSCF）。SSF是纤维素的酶解和乙醇发酵同步进行，酶解产生的葡萄糖同时被微生物转化成乙醇；SSCF是在SSF的基础上，使其发酵所用的微生物菌种（单菌种或混合菌种）能同时利用己糖和戊糖，故称为共发酵。SSF和SSCF解除了纤维素酶的末端产物抑制，提高了酶解效率，同时简化了生产工艺、缩短了生产周期，且已经被证明其效果优于SHF。但是SSF和SSCF工艺中糖化和发酵的条件采用折中的方法，糖化和发酵都不在最优条件下进行，并且SSF和SSCF的糖化步骤通常采用商业酶，纤维素酶的成本和酶解效率是其大范围工业化应用的阻碍因素。⑶统合生物工艺（consolidated bioprocessing，CBP）。Lynd等于2005年提出了CBP的概念，即在不额外添加商业酶的情况下，由一种或几种微生物在一个反应器来完成纤维素的糖化和乙醇的发酵的工艺过程。对于需要添加商业酶的SHF、SSF和SSCF而言，CBP显著地降低了生产成本。有报道表明，以硬木的粉末为原料，采用CBP的乙醇转化效率比SSF高四倍，且生产成本更低。虽然酶分离纯化技术的日益进步，SSF中使用的商业酶价格较前几年已经明显下降，但是CBP这一新的工艺因其一体化的优点，仍然具有无可比拟的优势。

发明内容

    本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种利

用基因重组酵母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种利用基因重组酵母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法， 包括如下步

骤：

S1.种子液的制备：首选分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）的菌株AS2.489-PS-BGL；然后活化培养各菌株至对数生长期，并使各菌株的酵母细胞数达到0.8~1亿/mL，即为成熟种子液；

S2.配制发酵培养基并灭菌，所述培养基含有如下重量份的组分：100~200份蔗渣，20~40份玉米浆（液态，购自华润赛力事达玉米工业有限公司），10~30份葡萄糖，5~15份硫酸铵，1~10份磷酸二氢钾；

S3.接种：将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的8~15%；

S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为28~32°C，搅拌速度为150~250转/分钟，搅拌培养3~5小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为28~32°C，停止通气并保持50~100转/分钟的缓慢搅拌，发酵2~4天；整个发酵过程中控制pH为3.5~4.5。

作为一种优选方案，S3所述的接种是将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按1~5：1~5：1~5的体积比混合。

作为一种进一步优选方案，S3所述的接种是将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的三级种子液按1~3：1~3：1~3的体积比混合。

作为一种最优选方案，S3所述的接种是将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的三级种子液按1：3：2的体积比混合。

作为一种优选方案，S3所述的接种量为培养基体积的12%。

作为一种优选方案，培养基含有如下重量份的组分：120~180份蔗渣，25~30

份玉米浆，15~20份葡萄糖，5~10份硫酸铵，2~6份磷酸二氢钾。

作为一种最优选方案，培养基含有如下重量份的组分：150份蔗渣，28份玉

米浆，18份葡萄糖，7份硫酸铵，4份磷酸二氢钾。

作为一种优选方案，上述培养基中的蔗渣（甘蔗渣）经机械粉碎至150~250目。

作为一种优选方案，S4中前酵期控制温度30°C，搅拌速度为200转/分钟，

搅拌培养4小时；主酵期保持温度为30°C，发酵3天。

作为一种优选方案，S4整个发酵过程中控制pH为4.0。

本发明所述的AS2.489-PS-EG的构建方法参见文献：刘泽寰, 台艳, 唐根云, 全艳彩, 王峻梅, 肖文娟, 龚映雪. 绿色木霉EGⅢ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达. 中山大学学报(自然科学版), 2009, 48(6): 83-88. ，即本发明所述的AS2.489-PS-EG是通过所述文献中的制备方法制备得到的菌种。

本发明所述的AS2.489-PS-CBH的构建方法参见文献：刘泽寰, 全艳彩, 唐根云, 龚映雪, 肖文娟, 王峻梅. 绿色木霉CBHⅡ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达. 华南理工大学学报(自然科学版), 2009, 37(6): 91-95. ，即本发明所述的AS2.489-PS-CBH是通过所述文献中的制备方法制备得到的菌种。

本发明所述的AS2.489-PS-BGL的构建方法参见文献：刘泽寰, 唐根云, 全艳彩, 龚映雪, 肖文娟, 王峻梅. 绿色木霉BGLI基因在酿酒酵母中的克隆、表达及其纤维素乙醇发酵. 兰州大学学报(自然科学版), 2009, 45(3): 61-66. 即本发明所述的AS2.489-PS-BGL是通过所述文献中的制备方法制备得到的菌种。

 本发明具有如下有益效果：（1）本方法将产酶、纤维素水解和乙醇发酵在一个体系中完成，不需额外添加纤维素酶，可在发酵过程中直接分解纤维素并转化为乙醇，省略了糖化步骤，简化了操作，节省了成本，是一套绿色环保低碳的纤维素乙醇生产工艺；（2）本发明可通过调整菌株的接种比例对纤维素酶的协同作用效果进行灵活调控，克服了传统工艺无法改变纤维素酶之间协同作用效果的缺点；同时本发明所用菌株能自身产纤维素酶。

附图说明

图1为本发明统合生物工艺流程图。

图2为本发明实施例1发酵过程中的乙醇、还原糖时间浓度曲线。

图3为本发明实施例2发酵过程中的乙醇、还原糖时间浓度曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限定。

实施例1  三种重组菌株按1:1:1的混合比例发酵纤维素产乙醇情况

S1.种子液的制备：

S11. 分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）的菌株AS2.489-PS-BGL；

S12.将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的甘油保藏菌株分别划线于YPD（含重量百分比成分为：2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖）平板，置于30°C恒温培养箱中培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于2mL YPD液体培养基中，于30°C，200rpm震荡培养24h，即为一级种子液；将一级种子液转接至20mL YPD中，30°C，200rpm震荡培养12h，即为二级种子液；将二级种子液转接至200 mL YPD液体培养基中，30°C，200rpm震荡培养约6h，使酵母细胞数达到1亿，即为成熟种子液；

S2.配制发酵培养基并灭菌：

S21.发酵培养基的组成：所使用的发酵培养基成分均以成本低廉的试剂配制;以玉米浆为有机氮源，配以(NH₄)₂SO₄为无机氮源，同时以KH₂PO₄提供培养基的pH缓冲，而纤维素则为发酵过程的唯一碳源;发酵培养基的具体组成为：每升发酵培养基中含有150克经机械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米浆，18克葡萄糖，7克硫酸铵，4克磷酸二氢钾;

S22.根据上述发酵培养基组分，配制发酵培养基，于发酵罐中121 °C实罐

灭菌（实消）20 min;

S3.接种：将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按体积比1：1：1混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的12%；

S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为30°C，搅拌速度为200转/分钟，搅拌培养4小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为30°C，停止通气并保持50转/分钟的缓慢搅拌，发酵3天；整个发酵过程中控制pH为4。  

发酵过程中每隔12小时取样，用高效液相色谱法测定发酵液中的乙醇产量和还原糖剩余量。结果见附图2。乙醇浓度在主酵期60小时逐渐增大并达到最高浓度17.11g/L（占理论值的50.2%），在72小时后开始下降。本实施例重复实验3次。附图2是3次实验的统计结果。

实施例2  三种重组菌株按1:3:2的混合比例发酵纤维素产乙醇情况

S1.种子液的制备：

S11. 分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）的菌株AS2.489-PS-BGL；

S12.将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的甘油保藏菌株分别划线于YPD（含重量百分比成分为：2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖）平板，置于30°C恒温培养箱中培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于2mL YPD液体培养基中，于30°C，200rpm震荡培养24h，即为一级种子液；将一级种子液转接至20mL YPD中，30°C，200rpm震荡培养12h，即为二级种子液；将二级种子液转接至200 mL YPD液体培养基中，30°C，200rpm震荡培养约6h，使酵母细胞数达到1亿，即为成熟种子液；

S2.配制发酵培养基并灭菌：

S21.发酵培养基的组成：本发明所使用的发酵培养基成分均以成本低廉的试剂配制。以玉米浆为有机氮源，配以(NH₄)₂SO₄为无机氮源，同时以KH₂PO₄提供培养基的pH缓冲，而纤维素则为发酵过程的唯一碳源;发酵培养基的具体组成为：每升发酵培养基中含有150克经机械粉碎至150目的蔗渣，28克玉米浆，18克葡萄糖，7克硫酸铵，4克磷酸二氢钾;

S22.根据上述发酵培养基组分，配制发酵培养基，于发酵罐中121 °C实罐

灭菌（实消）20 min;

S3.接种：将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按体积比1：3：2混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的12%；

S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为30°C，搅拌速度为200转/分钟，搅拌培养4小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为30°C，停止通气并保持50转/分钟的缓慢搅拌，发酵3天；整个发酵过程中控制pH为4。  

发酵过程中每隔12小时取样，用高效液相色谱法测定发酵液中的乙醇产量和还原糖剩余量。结果见附图3。乙醇浓度在主酵期60小时逐渐增大并达到最高浓度20.76g/L（占理论值的60.9%），纤维素乙醇产量显著高于按1:1:1比例混合培养的结果。本实施例重复实验3次。附图3是3次实验的统计结果。

实施例3  三种重组菌株按2:3:4的混合比例发酵纤维素产乙醇情况

S1.种子液的制备：

S11. 分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）的菌株AS2.489-PS-BGL；

S12.将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的甘油保藏菌株分别划线于YPD（含重量百分比成分为：2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖）平板，置于30°C恒温培养箱中培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于2mL YPD液体培养基中，于30°C，200rpm震荡培养24h，即为一级种子液；将一级种子液转接至20mL YPD中，30°C，200rpm震荡培养12h，即为二级种子液；将二级种子液转接至200 mL YPD液体培养基中，30°C，200rpm震荡培养约6h，使酵母细胞数达到1亿，即为成熟种子液；

S2.配制发酵培养基并灭菌：

S21.发酵培养基的组成：所使用的发酵培养基成分均以成本低廉的试剂配制;以玉米浆为有机氮源，配以(NH₄)₂SO₄为无机氮源，同时以KH₂PO₄提供培养基的pH缓冲，而纤维素则为发酵过程的唯一碳源;发酵培养基的具体组成为：每升发酵培养基中含有150克经机械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米浆，18克葡萄糖，7克硫酸铵，4克磷酸二氢钾;

S22.根据上述发酵培养基组分，配制发酵培养基，于发酵罐中121 °C实罐

灭菌（实消）20 min;

S3.接种：将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按体积比2：3：4混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的12%；

S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为30°C，搅拌速度为200转/分钟，搅拌培养4小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为30°C，停止通气并保持50转/分钟的缓慢搅拌，发酵3天；整个发酵过程中控制pH为4。  

发酵过程中每隔12小时取样，用高效液相色谱法测定发酵液中的乙醇产量和还原糖剩余量。结果见附图2。乙醇浓度在主酵期60小时逐渐增大并达到最高浓度15.39g/L（占理论值的45.2%）。本实施例重复实验3次。

实施例4  三种重组菌株按3:5:2的混合比例发酵纤维素产乙醇情况

S1.种子液的制备：

S11. 分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）的菌株AS2.489-PS-BGL；

S12.将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的甘油保藏菌株分别划线于YPD（含重量百分比成分为：2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖）平板，置于30°C恒温培养箱中培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于2mL YPD液体培养基中，于30°C，200rpm震荡培养24h，即为一级种子液；将一级种子液转接至20mL YPD中，30°C，200rpm震荡培养12h，即为二级种子液；将二级种子液转接至200 mL YPD液体培养基中，30°C，200rpm震荡培养约6h，使酵母细胞数达到1亿，即为成熟种子液；

S2.配制发酵培养基并灭菌：

S21.发酵培养基的组成：所使用的发酵培养基成分均以成本低廉的试剂配制;以玉米浆为有机氮源，配以(NH₄)₂SO₄为无机氮源，同时以KH₂PO₄提供培养基的pH缓冲，而纤维素则为发酵过程的唯一碳源;发酵培养基的具体组成为：每升发酵培养基中含有150克经机械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米浆，18克葡萄糖，7克硫酸铵，4克磷酸二氢钾;

S22.根据上述发酵培养基组分，配制发酵培养基，于发酵罐中121 °C实罐

灭菌（实消）20 min;

S3.接种：将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按体积比3：5：2混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的12%；

S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为30°C，搅拌速度为200转/分钟，搅拌培养4小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为30°C，停止通气并保持50转/分钟的缓慢搅拌，发酵3天；整个发酵过程中控制pH为4。  

发酵过程中每隔12小时取样，用高效液相色谱法测定发酵液中的乙醇产量和还原糖剩余量。结果见附图2。乙醇浓度在主酵期60小时逐渐增大并达到最高浓度13.57g/L（占理论值的39.8%）。本实施例重复实验3次。

实施例5  三种重组菌株按4:2:5的混合比例发酵纤维素产乙醇情况

S1.种子液的制备：

S11. 分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）的菌株AS2.489-PS-BGL；

S12.将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的甘油保藏菌株分别划线于YPD（含重量百分比成分为：2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖）平板，置于30°C恒温培养箱中培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于2mL YPD液体培养基中，于30°C，200rpm震荡培养24h，即为一级种子液；将一级种子液转接至20mL YPD中，30°C，200rpm震荡培养12h，即为二级种子液；将二级种子液转接至200 mL YPD液体培养基中，30°C，200rpm震荡培养约6h，使酵母细胞数达到1亿，即为成熟种子液；

S2.配制发酵培养基并灭菌：

S21.发酵培养基的组成：所使用的发酵培养基成分均以成本低廉的试剂配制;以玉米浆为有机氮源，配以(NH₄)₂SO₄为无机氮源，同时以KH₂PO₄提供培养基的pH缓冲，而纤维素则为发酵过程的唯一碳源;发酵培养基的具体组成为：每升发酵培养基中含有150克经机械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米浆，18克葡萄糖，7克硫酸铵，4克磷酸二氢钾;

S22.根据上述发酵培养基组分，配制发酵培养基，于发酵罐中121 °C实罐

灭菌（实消）20 min;

S3.接种：将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按体积比4：2：5混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的12%；

S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为30°C，搅拌速度为200转/分钟，搅拌培养4小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为30°C，停止通气并保持50转/分钟的缓慢搅拌，发酵3天；整个发酵过程中控制pH为4。  

发酵过程中每隔12小时取样，用高效液相色谱法测定发酵液中的乙醇产量和还原糖剩余量。结果见附图2。乙醇浓度在主酵期60小时逐渐增大并达到最高浓度16.21g/L（占理论值的47.6%）。本实施例重复实验3次。

实施例6  三种重组菌株按5:4:3的混合比例发酵纤维素产乙醇情况

S1.种子液的制备：

S11. 分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β-葡萄糖苷酶（BGL）的菌株AS2.489-PS-BGL；

S12.将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的甘油保藏菌株分别划线于YPD（含重量百分比成分为：2%蛋白胨、1%酵母浸出物、2%葡萄糖）平板，置于30°C恒温培养箱中培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于2mL YPD液体培养基中，于30°C，200rpm震荡培养24h，即为一级种子液；将一级种子液转接至20mL YPD中，30°C，200rpm震荡培养12h，即为二级种子液；将二级种子液转接至200 mL YPD液体培养基中，30°C，200rpm震荡培养约6h，使酵母细胞数达到1亿，即为成熟种子液；

S2.配制发酵培养基并灭菌：

S21.发酵培养基的组成：所使用的发酵培养基成分均以成本低廉的试剂配制;以玉米浆为有机氮源，配以(NH₄)₂SO₄为无机氮源，同时以KH₂PO₄提供培养基的pH缓冲，而纤维素则为发酵过程的唯一碳源;发酵培养基的具体组成为：每升发酵培养基中含有150克经机械粉碎至200目左右的蔗渣，28克玉米浆，18克葡萄糖，7克硫酸铵，4克磷酸二氢钾;

S22.根据上述发酵培养基组分，配制发酵培养基，于发酵罐中121 °C实罐

灭菌（实消）20 min;

S3.接种：将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按体积比5：4：3混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的12%；

S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为30°C，搅拌速度为200转/分钟，搅拌培养4小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为30°C，停止通气并保持50转/分钟的缓慢搅拌，发酵3天；整个发酵过程中控制pH为4。  

发酵过程中每隔12小时取样，用高效液相色谱法测定发酵液中的乙醇产量和还原糖剩余量。结果见附图2。乙醇浓度在主酵期60小时逐渐增大并达到最高浓度14.38g/L（占理论值的42.2%）。本实施例重复实验3次。