一种具有天然活性的重组人胱抑素C蛋白及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有天然活性的重组人胱抑素C蛋白及其制备方法。本发明运用基因工程技术表达纯化大量稳定的重组人胱抑素C蛋白，并利用蛋白酶切割重组人胱抑素C蛋白使其具有天然活性。该重组人胱抑素C蛋白可用于免疫制备单克隆抗体和多抗血清，为制备稳定的胱抑素C检测试剂及其质控品提供了优良的原料。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种具有天然活性的重组人胱抑 素C蛋白及其制备方法。

背景技术

胱抑素C(Cystatin C，CysC)又称为半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，分子量 为13kD，含有120个氨基酸残基，是一种非糖基化的椭圆形小分子蛋白，其前 体分子含有26个氨基酸的信号肽。其广泛存在于各种体液中如血液、脑脊液、 唾液、精液、尿液等，以脑脊液中含量最高，尿液最低，并且所有的有核细胞 都能稳定地产生胱抑素C。在生理条件下，胱抑素C的重要功能是抑制内源性 的半胱氨酸蛋白酶的活性。对于细胞内蛋白质的转换，骨胶原的降解，蛋白质 前体的分离有重要作用。胱抑素C可参与肿瘤的侵袭和转移，参与炎症过程及 一些神经性疾病。在这些疾病中，半胱氨酸蛋白酶与其抑制物是否处于平衡状 态，一旦失衡，将造成一些病理损伤。

因胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由过滤，在近曲小管被 重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C浓 度主要由肾小球滤过率(GFR)决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映GFR 变化的内源性标志物。同时有研究报道应用兔抗胱抑素C抗体建立的酶联免疫 吸附(ELISA)技术检测了急性心肌梗塞病人急性期、恢复期及正常对照组血清 胱抑素C水平，发现急性期与恢复期的自身对照并无显著性差异，但有意义的 是这两者的胱抑素C水平均显著低于正常对照组。提示胱抑素C的血清浓度改 变，在一定程度上可以作为急性心肌梗塞诊断参考指标。

急性肾功能衰竭(ARF)传统的诊断方法主要是根据血肌酐(SCr)水平， 但SCr水平受多种因素的影响，不能精确反映GFR，特别是在轻中度肾功能损 伤时。Villa等对50例重症监护病房(ICU)患者进行研究，通过观察比较SCr、 血清CysC和GFR，结果发现Cys C与GFR相关性更好，在25例ARF患者中， 19例血清Cys C浓度升高，而SCr升高仅5例，提示在诊断ARF方面Cys C可 能比SCr更具价值。

血清胱抑素C浓度的测定具有重要的诊断意义，但目前我国还没有自主研 发的胱抑素C诊断试剂。究其原因制备胱抑素C诊断试剂盒需要特异性强和灵 敏度高的胱抑素C单克隆抗体或多抗血清，而要得到该单克隆抗体或多抗血清 就必须得到高纯度的胱抑素C蛋白，传统的从胎盘、尿液等组织中提取的胱抑 素C蛋白浓度低，纯度差，批间差大，无法用做免疫原制备单抗或多抗，即使 用做免疫原制备用于免疫比浊等方法的诊断产品，也存在较严重的交叉问题， 要提取高纯度的免疫原，纯化成本相当高。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有天然活性的重组胱抑素C蛋白及其制备方法。

为实现上述目的，本发明公开了一种得到具有天然活性的重组胱人抑素C 蛋白的制备方法，该方法包括将人胱抑素C核酸序列与表达载体重组后转化表 达宿主细胞，培养宿主细胞后收集纯化重组表达的人胱抑素C蛋白，再将该蛋 白进行蛋白酶酶切处理。

上述蛋白酶可选自胰蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、内肽酶Lys-C、Xa因子、 内肽酶Arg-C中的任一种。

所述蛋白酶包括天然提取及其基因工程重组蛋白酶。

所述蛋白酶酶切中重组人胱抑素C蛋白与蛋白酶质量比为50∶1～1000∶1。

所述酶切处理的条件为30～37℃切割5-30分钟，或3～5℃条件下作用20-28 小时。

本发明中优选蛋白酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶包括天然提取和基因工程 重组的胰蛋白酶，可优选用重组人胰蛋白酶。

本发明中优选的，所述重组人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO：2所示氨基 酸序列。

本发明中的一个实施例公开的所述重组人胱抑素C蛋白可由SEQ ID NO：1 所示核酸序列编码表达。

上述表达载体为原核表达载体，且该原核表达载体的融合蛋白标签可利用 金属螯合原理亲和纯化人胱抑素C蛋白，优选原核表达载体为PET-15b。

上述表达宿主细胞为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞，且具有可帮 助表达蛋白二硫键形成和增加可溶性的特征，优选表达宿主细胞为大肠杆菌 Origami B(DE3)。

本发明还公开了上述制备得到的重组人胱抑素C蛋白在制备单克隆抗体、 多抗血清或标准品方面的应用。

本发明公开了一种利用上述方法制备的重组人胱抑素C蛋白作为免疫原， 免疫动物制备多抗血清的方法。

所述制备羊多抗血清所用的动物优选为山羊或绵羊，更优选为黑山羊。

本发明还公开了利用上述方法得到的重组人胱抑素C蛋白制备诊断试剂用 标准品，将本发明制备的重组人胱抑素C蛋白用适当缓冲液稀释到合适浓度。

所述的合适浓度为5-15mg/L，优选为10mg/ml，以此标准品按梯度稀释， 在0.4mg/L～8.0mg/L范围内，线性偏差＜10％。

本发明的创新和有益效果是：本发明运用基因工程技术表达纯化得到的重 组人胱抑素C蛋白具有很极佳的可溶性，可以大量稳定生产，利用蛋白酶切割 后获得的重组人胱抑素C蛋白，具有与天然人胱抑素C蛋白一致的活性，可用 于免疫制备单克隆抗体和多抗血清，为制备稳定的人胱抑素C检测试剂及其质 控品提供了优良的原料，解决了我国人胱抑素C免疫检测试剂盒自主研发的关 键问题。

附图说明

图1是本发明实施例1中制备人胱抑素C蛋白的流程示意图；

图2是本发明实施例5中制备的人胱抑素C诊断标准品评价结果；

图3是本发明实施例6中重组蛋白免疫制备的羊多抗和天然蛋白免疫制备 的羊多抗测定标准品曲线对比图。

具体实施方式

采用传统的从胎盘、尿液等组织中提取天然胱抑素制备得到胱抑素C蛋白 的方法存在效率低、纯度低、纯化成本高等问题，具体来说，天然提取的人胱 抑素C蛋白一般来源于新鲜人血清中，血清来源受到限制，而且存在未知的潜 在风险，同时纯化步骤复杂，要得到高纯度蛋白难度很大，用这种天然蛋白免 疫制备的多抗血清，和人血清中其他组分的交叉也比较严重，这给产品性能优 化带来较大困难。而本发明不同于传统方法，采用了基因工程大肠杆菌重组表 达胱抑素C蛋白，并将该重组蛋白通过蛋白酶酶切处理，得到具有与天然胱抑 素C蛋白活性一致的重组胱抑素C蛋白。该方法表达的重组蛋白活性高、产量 高、易纯化，且生产周期短、成本低，可实现蛋白质的工业化生产。

本发明中制备人胱抑素C蛋白的具体步骤主要包括：合成人胱抑素C的 DNA序列，并将其与表达质粒重组，重组子经过DNA测序验证，质粒酶切验 证，确定重组表达质粒的序列和阅读框均正确。再将所获得的重组表达质粒转 化表达宿主细胞，培养宿主细胞并从细胞质中回收和纯化可溶性重组人胱抑素C 蛋白。接着用蛋白酶切割所获得的重组人胱抑素C蛋白，得到具有天然活性的 重组人胱抑素C蛋白。

本发明人经实验发现，采用原核表达方式表达得到的胱抑素C蛋白，在未 经酶切处理时，其酶活和免疫原性多比天然胱抑素C蛋白要差很多，无法满足 其作为免疫试剂原料的要求。而通过将表达后的胱抑素C蛋白通过蛋白酶酶切 处理，很好的解决了胱抑素C蛋白的酶活性和免疫原性不足的问题，使其具有 与天然胱抑素C蛋白相当的活性水平。

在本发明的一个实施例中，优选胰蛋白酶为切割胱抑素C蛋白的蛋白酶， 该胰蛋白酶可为任何物种的、包括天然提取和基因工程重组的胰蛋白酶，本发 明中优选重组人胰蛋白酶。该酶价格便宜，运用广泛，来源丰富，并且带有His 纯化标签的重组人胰蛋白酶可以在酶切完成后，通过镍柱(Ni柱)亲和纯化一 步去除，同时在酶切过程中，使用胰蛋白酶切割，目的蛋白最终的损失也是最 小的。

采用胰蛋白酶切割重组人胱抑素C的方法具体为：在纯化的蛋白样品中加 入胰蛋白酶，重组人胱抑素C蛋白：胰蛋白酶质量比为50∶1～1000∶1，30-37 度切割5-30min，亦或4度作用20-28h(优选24h)。产生具有天然活性重组人 胱抑素C蛋白。在该比例范围内，如果胰蛋白酶用量提高，则相应的切割速率 会提高，作用时间应缩短，否则有可能导致目的蛋白的大量降解。此外，胰蛋 白酶过高会导致酶切过程难以控制，重复性差，而过少则会导致酶切不彻底， 作用时间过长，蛋白活性受到损失。

使用本发明其他蛋白酶在用量和酶切条件上会有细微差别，但基本涵盖在 本发明使用重组人胰蛋白酶所列的条件范围之内。在本发明的另一个实施例中 采用的蛋白酶为凝血酶。

本发明中，优选人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，在 本发明的一个实施例中，所述人胱抑素C蛋白由SEQ ID NO：1所示核酸序列 编码表达。本领域技术人员应该知晓，本发明中所述重组的人胱抑素C蛋白不 仅局限于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，在其他报道中公开的、与本发明中 SEQ ID NO：2所示序列类似的人胱抑素C蛋白氨基酸序列也同样适用于本发 明。同理，适用于本发明的编码表达的人胱抑素C蛋白的核酸序列也不仅限于 SEQ ID NO：1，本领域技术人员也可以采用现有报道中或人工合成其他类似SEQ  ID NO：1的核酸序列。

本发明中采用的表达载体为能与人胱抑素C蛋白的基因序列重组并形成表 达质粒的表达载体，具体地，表达载体为原核表达载体，该原核表达载体的融 合蛋白标签可利用金属螯合原理亲和纯化人胱抑素C蛋白，在本发明的一个实 施例中，该原核表达载体优选PET-15b。

本发明中采用的表达宿主细胞为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞， 且具有可帮助表达蛋白二硫键形成和增加可溶性的特征，在本发明的一个实施 例中，优选用大肠杆菌Origami B(DE3)。所述培养宿主细胞所用的培养基采用 含抗生素基础培养基扩增培养宿主细胞，培养温度35-40度，培养时间4-16h， 诱导温度20-37度，诱导时间3-6h，诱导物异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)终浓度为0.2-1mM。筛选宿主细胞中高效表达的阳性表达菌株作为工 程菌，重组可溶性人胱抑素C蛋白通过工程菌诱导培养后、离心收集菌体，超 声破碎后离心分离上清，经过Ni柱亲和纯化得到重组人胱抑素C蛋白。

本发明还公开了上述制备得到的重组人胱抑素C蛋白在制备单克隆抗体、 多抗血清和标准品方面的应用。

在本发明的一个实施例中，公开了一种利用上述方法制备的重组胱抑素C 蛋白作为免疫原，免疫动物制备多抗血清的方法。所述制备羊多抗血清所用的 动物优选为山羊或绵羊，更优选为黑山羊。在本发明的另一个实施例中还公开 了制备的重组人胱抑素C蛋白制备诊断试剂用标准品的方法，即将本发明制备 的重组人胱抑素C蛋白用适当缓冲液稀释到合适浓度。所述的合适浓度为 5-15mg/L，优选为10mg/ml，以此标准品按梯度稀释，在0.4mg/L～8.0mg/L范围 内，线性偏差＜10％。

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例 仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例1制备重组人胱抑素C蛋白

(1)人工合成人胱抑素C基因并构建表达质粒

按照已报道的胱抑素C基因序列，设计重叠PCR引物人工合成人胱抑素C 基因，其序列如SEQ ID NO：1所述。将该基因和pMD18-T载体连接，转化大 肠杆菌，挑取单克隆，PCR鉴定正确的阳性质粒，提取质粒酶切鉴定。将PCR 鉴定和酶切鉴定都正确的质粒送invagen公司测序，结果和设计序列完全一致。 将测序正确的质粒用设计在其两端的酶切位点相应的酶进行酶切，切出的目的 序列连入PET-15b载体中，构建原核表达质粒PET-15bCysC，转化表达宿主菌 Origami B(DE3)。

(2)筛选高效表达重组人胱抑素C蛋白菌株

取适量转化后宿主菌涂布于带抗性的LB固体培养基中，37℃，培养过夜， 第二天挑取5株以上在抗性培养基中能生长的菌落，接种于2ml带抗性的LB 液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，同时取转化有空载体PET-15b的宿主 菌做对照。加入终浓度为1mM的IPTG，37℃，190rpm诱导培养6h。离心收集 菌体，用50μl 20mM PBS缓冲液重悬菌体，加入Buffer，沸水煮10分钟后， SDS-PAGE电泳。考马斯亮兰染色，转化进PET-15bCysC质粒的菌株在预测的 分子量位置有一条较浓的蛋白条带，而只转化进PET-15b质粒的菌株没有该条 带。进一步将诱导后菌体超声破碎后离心取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳显示， 目的蛋白主要以可溶形式存在于上清中。

(3)扩大培养及目的蛋白的纯化

将1％的转化宿主菌接种于10ml加有抗性的LB培养基中，37℃，200rpm 培养过夜，第二天按5％接菌量接种于500ml，带抗性的LB培养基中，37℃， 200rpm培养5-6小时至OD0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm 诱导5-6h。离心收集菌体，加入适量裂解缓冲液，超声破碎后离心取上清，用 50％硫酸铵沉淀蛋白，离心收集沉底，用20mM PBS复溶沉淀，用0.45μM膜 过滤备用。

镍琼脂糖凝胶FF柱亲和纯化目的蛋白，用10倍柱体积20mM PBS平衡柱 子，上述过滤上清直接上柱，4-10℃结合1h。用20mM PBS洗涤结合后柱子， 至OD280吸收值至基线，用Elusion Bufer(20mM PBS，200mM咪唑，pH7.4) 洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE分析纯度，结果显示纯度达95％以上，蛋白浓 度约2-2.5mg/ml。

(4)胰蛋白酶切割重组人胱抑素C蛋白

将上述纯化的重组人胱抑素C蛋白用酶切缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)透析过夜，按重组胱抑素C蛋白：胰蛋白酶质量比100∶1的比 例加入重组胰蛋白酶，37℃水浴酶切20min。酶切完样品用0.5M NaOH调pH 至9.5，4℃放置1小时，以使胰蛋白酶彻底灭活。酶切后蛋白用20mM PBS透 析过夜，上镍琼脂糖凝胶FF柱结合1h，反向亲和除去带有his标签的切除部分 和残留的重组胰蛋白酶，收集结合完后的流穿蛋白样品，即为最终纯化的重组 人胱抑素C蛋白，SDS-PAGE电泳分析，蛋白纯度达95％以上。

(5)免疫双扩散评价重组人胱抑素C蛋白活性

琼脂板的制备：将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂4ml，倾 注于载玻片上，使其自然流成水平面。待琼脂凝固后，用打孔器在中间打一孔， 周围对称打6空，孔径3mm，孔距距15mm。

加样：于中央孔加入羊抗人胱抑素C血清(Dako)，将未经酶切处理的重组 胱抑素C蛋白、酶切处理后的重组胱抑素C蛋白及天然胱抑素C蛋白分别以起 始浓度1.0mg/ml，由1∶2开始对倍稀释加入周围5孔中，6孔加入生理盐水作 对照。

扩散：将琼脂板放入湿盒内置37℃温箱中24小时后取出观察结果(表 一)。

表一：PET-15bCysC酶切前后活性比较

  免疫双扩散   酶切前   1∶4   酶切后   1∶32   天然CysC   1∶32

注：天然CysC为人新鲜血清中提取

表一结果显示，经胰蛋白酶酶切处理得到重组胱抑素C蛋白其抗原活性与 天然胱抑素C蛋白一致，即经1∶32的比例稀释后仍可见沉淀线；而未经酶切 处理的重组胱抑素C蛋白，其抗原活性明显低于天然胱抑素C蛋白及酶切处理 后的重组胱抑素C蛋白，其可见沉淀线的稀释倍数仅为1∶4。

实施例2胰蛋白酶质量比为50∶1酶切重组人胱抑素C蛋白

将实施例1中制备的未酶切重组人胱抑素C蛋白，按重组胱抑素C：胰蛋 白酶质量比50∶1的比例加入重组胰蛋白酶，37℃水浴酶切5min。酶切完样品 用0.5M NaOH调pH至9.5，4℃放置1小时，以使胰蛋白酶彻底灭活。酶切后 蛋白用20mM PBS透析过夜，上镍琼脂糖凝胶FF柱结合1h，反向亲和除去带 有his标签的切除部分和残留的重组胰蛋白酶，收集结合完后的流穿蛋白样品， 即为最终纯化的重组人胱抑素C蛋白，SDS-PAGE电泳分析，蛋白纯度达95％ 以上。按实施例1中第(5)步评价活性。

实施例3胰蛋白酶质量比为1000∶1酶切重组人胱抑素C蛋白

将实施例1中制备的未酶切重组人胱抑素C蛋白，按重组胱抑素C：胰蛋 白酶质量比1000∶1的比例加入重组胰蛋白酶，37℃水浴酶切30min。酶切完样 品用0.5M NaOH调pH至9.5，4℃放置1小时，以使胰蛋白酶彻底灭活。酶切 后蛋白用20mM PBS透析过夜，上镍琼脂糖凝胶FF柱结合1h，反向亲和除去 带有his标签的切除部分和残留的重组胰蛋白酶，收集结合完后的流穿蛋白样品， 即为最终纯化的重组人胱抑素C蛋白，SDS-PAGE电泳分析，蛋白纯度达95％ 以上。按实施例1中第(5)步评价活性。

表二：不同胰蛋白酶比例酶切活性比较

  PET-15bCysC不同酶切条件   免疫双扩散   50∶1   1∶32   100∶1   1∶32   1000∶1   1∶32   天然CysC   1∶32

表二结果显示，不同酶切条件下，经胰蛋白酶酶切处理得到重组胱抑素C 蛋白其抗原活性没有明显差别，均与天然胱抑素C蛋白一致，即经1∶32的比 例稀释后仍可见沉淀线。

实施例4凝血酶酶切重组人胱抑素C蛋白

将实施例1中制备的未酶切重组人胱抑素C蛋白，按重组胱抑素C：凝血 酶质量比100∶1的比例加入凝血酶，37℃水浴酶切20min。酶切完样品加入20mm PMSF，以使凝血酶彻底灭活。酶切后蛋白用20mM PBS透析过夜，上镍琼脂 糖凝胶FF柱结合1h，反向亲和层析和阳离子交换树脂层析，除去带有his标签 的切除部分和残留的纤溶酶，SDS-PAGE电泳分析，蛋白纯度达95％以上。按 实施例1中第(5)步评价活性(表三)。

表三：凝血酶酶切前后活性比较

  免疫双扩散   酶切前   1∶4   酶切后   1∶32   天然CysC   1∶32

表三结果显示，经凝血酶酶切处理得到重组胱抑素C蛋白其抗原活性与天 然胱抑素C蛋白一致，即经1∶32的比例稀释后仍可见沉淀线；而未经酶切处 理的重组胱抑素C蛋白，其抗原活性明显低于天然胱抑素C蛋白及酶切处理后 的重组胱抑素C蛋白，其可见沉淀线的稀释倍数仅为1∶4。

实施例5制备人胱抑素C诊断标准品

取制备好的重组人胱抑素C用缓冲液(20mm PB，150mM NaCl，5％BSA， pH7.4)稀释成10.0mg/L制成标准品。该标准品做不同稀释后，用Dako人胱抑 素C检测试剂盒评价结果。

从图2中可得，回归方程R²达到0.9955，说明测量值与理论值一致程度高， 活性非常接近天然蛋白。

实施例6抗人胱抑素C羊多抗血清制备

采用10只3-6月大、体重25公斤、健康的黑山羊为免疫动物；以实施例1 制备的重组人胱抑素C蛋白为免疫原，对照免疫原为人新鲜血清中提取的天然 人胱抑素C蛋白，各免疫5只。免疫剂量：基础免疫为3mg/kg，加强免疫剂量 为4mg/kg。免疫的具体步骤如下：用稀释液稀释适量免疫原，加入等体积弗氏 完全佐剂，充分乳化，在羊背部皮内多点注射进行首免；2周后，取抗原加弗氏 不完全佐剂乳化后进行背部皮下多点注射，每2周加强免疫一次。从加强免疫 第3次开始，在每次免疫后第七天采血检测效价，第6次免疫后，羊获得了高 效价的抗体，重组蛋白免疫的抗血清滴度为1∶128×10⁴，对照天然蛋白免疫的 抗血清滴度会略低一点达1∶64×10⁴。以此羊多抗配制的人胱抑素C检测试剂 比较结果见图3，从图中可以看出，用重组人胱抑素C制备的羊多抗配制的检测 试剂比用天然蛋白免疫制备的羊多抗具有更高的活性。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。