具有天然生物活性的重组人HFRS抗体在转基因小鼠乳腺中的表达

摘要

肾综合征出血热(HFRS)是由布尼亚病毒科汉坦病毒属汉坦病毒引起的一种急性病。血清学调查证实在五大洲都有汉坦病毒疫源地存在的证据。利用单克隆抗体治疗HFRS具有常规疗法无可比拟的优势。为获得乳腺高效表达人源重组抗体(rHMAbs)的小鼠模型，分别构建抗体基因轻链表达载体pBC1-hG2L和重链表达载体pBC1-hG2H，等比例混合利用显微注射方法共同注射受精卵雄原核制备转基因小鼠。本实验利用pBC1载体上的调控元件构建了分别含有肾综合征出血热轻、重链基因的转基因乳腺特异性表达载体并建立了能够遗传稳定的转基因鼠系。检测到rHMAbs在转基因小鼠乳中的高效表达(最高达到6.6mg/m1)。验证了转基因小鼠乳中rHMAbs具有完全的天然活性。为进一步制备转基因家畜奠定了基础，同时验证了rHMAbs通过哺乳可以对后代小鼠提供保护，并发现rHMAbs受到了小鼠自身的修饰而发生了分子量的变化，但仍然保持了天然活性，我们也由此推测是否内源的抗体通过乳鼠消化道后也会受到类似的修饰，如果此推论得到证实，那么这种生理机制的生物学意义将很值得进一步深入研究与探讨。

目录

文摘

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独创性声明及关于论文使用授权的说明

缩略表

技术路线图

第一章文献综述

引言

1.1汉坦病毒及其相关疾病研究进展

1.1.1汉坦病毒(HV)的基因组及编码产物

1.1.2汉坦病毒感染后诱导的免疫应答

1.1.3汉坦病毒(HV)的分型

1.1.4汉坦病毒(HV)的传播途径

1.1.5汉坦病毒(HV)在全球的流行近况

1.1.6 HFRS和HPS临床表现

1.1.7我国对HFRS防治策略

1.1.8对HFRS的常规治疗原则和经验

1.1.9汉坦病毒单克隆抗体的研制和应用

1.2转基因动物研究进展

1.2.1转基因动物的制作方法

1.2.2转基因动物作为生物反应器独具优势

1.2.3转基因动物研究的应用

1.3转基因动物生产抗体

第二章材料与方法

引言

2.1实验材料

2.2实验方法

1、感受态细胞的制备、效价的测定及质料DNA的转化

2、质粒DNA的制备

3、外源片段的回收方法

4、连接反应体系的确定

5、重组质粒的快速鉴定Craking法

6、测序反应程序

7、转基因小鼠的制备

8、鼠尾组织DNA的提取

9、Southern blotting

10、小鼠奶校的采集和处理

11、转基因小鼠后代乳鼠血清的采集

12、SDS-PAGE电泳和Western blotting

13、免疫荧光(IFA)

14、酶联免疫吸附实验(ELISA)

15、荧光减少法中和实验

16、检测N-Linkde糖基化

第三章实验结果

引言

3.1表达载体的构建

3.1.1 HFRS糖蛋白G2抗体基因轻链和重链乳腺表达载体构建策略

3.1.2表达载体的获得及鉴定

3.1.3轻链表达载体加新霉素标记基因

3.2转基因小鼠模型建立及相关检测

3.2.1双基因共显微注射法生产转基因小鼠

3.2.2转基因小鼠PCR检测

3.2.3转基因小鼠传代

3.2.4转基因小鼠的Southern blotting检测

3.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳检测转基因小鼠的乳中rHMAbs的表达

3.2.6 Western blot检测转基因小鼠的乳中rHMAbs的表达

3.2.7ELISA确定rHMAbs的表达量

3.3人重组抗体(rHMAbs)的活性检测

3.3.1免疫荧光(IFA)法验证rHMAbs的结合特异性

3.3.2微量荧光减少法体外中和实验检测rHMAbs中和病毒的能力

3.4人重组抗体(rHMAbs)通过哺乳对后代小鼠保护的研究

3.4.1检测rHMAbs在转基因小鼠后代乳鼠血清中的存在

3.4.2分析rHMAbs在转基因小鼠后代乳鼠血清中的分子量变化

3.4.3分析rHMAbs在转基因小鼠后代乳鼠血清中的活性

第四章分析与讨论

引言

4.1关于表达载体

4.1.1转基因表达载体的调控元件分析

4.1.2转基因表达载体的构建过程中的经验总结

4.2关于转基因小鼠

4.2.1双基因共注射获得转基因小鼠

4.2.2外源基因在转基因小鼠基因组中的整合效率

4.2.3转基因小鼠传代

4.2.4 rHMAbs在转基因小鼠乳中表达

4.3转基因鼠乳中人重组抗体(rHMAbs)的活性

4.3.1 rHMAbs的结合特异性

4.3.2 rHMAbs的中和活性

4.3.3 rHMAbs对后代乳鼠的保护

4.4重组抗体分子量变化的分析

第五章结论

参考文献

致 谢

附录：载体构建过程中的重要测序结果

个人简历