循环肿瘤细胞(CTCs)荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了检测方法中所用的试剂在制备用于检测循环肿瘤细胞分子特异性标志物的试剂盒中的应用，其中所述检测方法包括：对样品进行处理；对处理产物进行核酸提取；和，对核酸提取物进行荧光PCR检测。另外，本发明还提供了上述应用中的试剂以及试剂盒等。

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及检测样品中循环肿瘤 细胞（CTCs）的应用。另外，本发明还涉及可以在上述应用中所用的试剂和试 剂盒等。

背景技术

据统计，约90％的癌症患者死于继发性肿瘤，而原发性肿瘤转移或释放循环 肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）通常是导致继发性肿瘤形成的原因。早 在1869年，科学家Ashworth首次提出CTCs的概念。目前CTCs定义为自发或 因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。进入循环未被清 除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为 转移灶。因此，在外周血中检测到CTCs预示着有可能发生肿瘤转移，检测外周 血中的CTCs具有重要的临床应用价值，对于临床早期筛查和诊断、疗效及预后 意义重大。美国食品与药品监督管理局(FDA)也已批准用于预测转移性乳腺癌、 结直肠癌或前列腺癌的无进展生存时间(progression-free survival，PFS)和总存 活时间(overall survival，OS)的CTCs检测系统。

对于数以亿万计的外周血细胞而言，CTCs在外周血中的数量稀少，大约每 10⁵～10⁷个单核细胞中才有一个CTCs。现有针对CTCs的检测技术主要有免疫 细胞化学法(immunocytochemistry，ICC)、流式细胞术（flow cytometry，FCM） 和逆转录聚合酶链反应(reversetranscription polymerase chain reaction， RT-PCR)。免疫细胞化学法缺点是敏感性低，分化差的肿瘤细胞不表达目标抗原、 淋巴细胞交叉反应等因素都将影响检测特异性；流式细胞术价格昂贵，耗时较长， 敏感度低；而RT-PCR方法步骤繁琐，费时较长，容易污染，给临床检测带来巨 大不便，且由于取样时上皮细胞污染、标志物非法转录、个体间表达差异等也可 能造成假阳性及假阴性。

尽管也有利用荧光PCR进行检测CTCs的先例（如参见：金翔凤,等.非小细胞 肺癌病人外周血CK19mRNA表达及意义.齐鲁医学杂志,第23卷第3期），但是仍旧 受到假阳性及假阴性（尤其是假阴性）结果的困扰，而且判读结果不直观，难以 进行半定量分析，由此灵敏度度很低，不得不以“以浓度≥每微升1拷贝数为阳性 结果，浓度<每微升1拷贝数为阴性”（即1000copy/ml）来划分判断，这对于许多 实际患者中每毫升样品只有1～100copy的情况而言，几乎没有推广使用的价值，造 成大量假阴性结果，使得医生都无所适从。

为此，本发明人经过艰苦而长期的努力，发现使用常规的RNA提取试剂盒对最 终检测结果效果不佳，因此从处理样品（如外周血）起就需要改进；还发现改进 部分引物和探针及其PCR扩增步骤能够使得判读结果直观，可以在更大范围内进 行半定量分析；更令人意外的是，本发明人抛弃了目前一味追求定量或半定量分 析的研究误区，设计了互不干扰的引物对和探针，在保留一定半定量分析的能力 的同时，大大增加了定性分析的灵敏度和可靠性。而且，本发明的方法易于自动 化和规模化，能够减小人为操作误差和污染，节省操作时间和成本，可广泛用于 对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌患者病情分级、预后评估，为治疗方 案的选择和治疗效果的监测提供依据。

发明内容

本发明目的旨在于提供新的检测方法中所用的试剂在制备用于检测循环肿瘤 细胞分子特异性标志物的试剂盒中的应用。另外，本发明还提供了可以在上述应 用中使用的试剂以及试剂盒等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了检测方法中所用的试剂在制备用于检 测循环肿瘤（如，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和/或胃癌，优选是乳腺癌） 细胞分子特异性标志物的试剂盒中的应用，其中所述检测方法包括：

（1）对样品（如，外周血）进行处理；

（2）对步骤（1）获得的处理产物进行核酸提取；和，

（3）对步骤（2）获得的核酸提取物进行荧光PCR检测。

尽管可以通过其他方法来检测循环肿瘤细胞分子特异性标志物，但是优选在 本发明第一方面的应用中，检测循环肿瘤细胞分子特异性标志物也是通过所述检 测方法实施的。

在本文中，在试剂盒中，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几 种长期保存而不发生化学反应的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、 盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容 器。由于部分试剂容易获取，因此可以不包括这些试剂，如试剂盒中可以只包括 一部分试剂。另外，检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明 第一方面中所述检测方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到 上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要， 试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。优 选的试剂盒是下文本发明第四方面的试剂盒。

在本文中，所检测的“样品”或“样本”可以互换使用，指的是潜在可能含 有靶核酸的离体样品，如血液、血液制品、尿液或唾液等。本发明的应用中的检 测方法可以作为本发明的一个独立方面。该检测方法是双重检测方法，分别针对 两个CTCs标志物，从而有助于消除定性结果的假阳性。由于检测出的少量或微 量CTCs是否能导致肿瘤的继发，还需要有经验的医生根据相应人的体质、病史、 临床症状等综合情况才能判断出，因此，本发明的应用中的检测方法优选是非诊 断方法，即不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况的方法。

优选在本发明第一方面的应用中，步骤（3）中的荧光PCR检测的方法包括： （3-1）在单个PCR反应管中混合核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA 聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基 团，而且两种探针标记的荧光基团检测波长不同，其中，

靶核酸引物对包括：

AACGAGCCAGCCTATCTTGAATC，

TTCTGACTTGATCTGTGACCGGAG，

CTGAATCCAATCTTTGCTCACC，和

ATGCTTGAAGGCCAATATGA，

靶核酸探针包括：

CCGACATCGCCGCTCCGTAACAT，和

CCTCTATTCAGATCCAGCGGATA

（3-2）进行反转录和PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，

（3-3）根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有标志物靶核酸存在于样品中。

在本文中，“单个PCR反应容器”指所述反转录及实时PCR方法在技术上 是在同一个容器中进行的，不必要更换容器。即在本发明第一方面的实时PCR方 法中，在同一个容器内就可以完成cDNA的合成，PCR的扩增和实时荧光检测 的步骤，整个过程无需更换容器，操作方便，节省时间，减小误差。操作者仅需 向容器中加入样本与反应试剂即可，整个过程由市售普通实时荧光PCR仪自动 完成。

通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。 优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售 的，如可以采用等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可 以委托公司合成标记有荧光标记的探针，纯度需达到HPLC标准，且不含杂带， 其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选 为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。在本发明的具 体实施方式中，其中采用的标记有不同检测波长的荧光标记的探针都是委托上海 生工生物工程技术服务有限公司合成的，优选荧光基团是FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5中的任意两种组合。因此，可以进一步优选在步骤（3）中的荧光 PCR检测的方法中，各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团选自FAM、 VIC、NED、Texas Red和CY5。

在本发明中，为了平衡不同引物对的扩增条件以及尽量扩大能够半定量的范 围，经过试验摸索，最优条件为：PCR反应的每个循环条件为94℃10秒、60℃ 30秒。在本发明的具体实施方式中，PCR反应前需进行反转录，即42℃30min， 并优选94℃变性10min，然后进行上述条件的45个循环。

核酸提取可采用常规煮沸法、酚-氯仿提取法、TRIzol法、柱法等，优选采用 本发明的优化磁珠提取法，即步骤（2）中的核酸提取的方法优选是磁珠法提取 RNA的方法。这样的方法与下文的样品处理的方法结合，能够有效改善现有技术 存在的处理/提取不力的影响。优选的核酸提取的方法包括：

向处理产物加入核酸萃取液（优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙 酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液（如，Tris-HCl），保温后加入磁珠 （如，磁珠），混合均匀后，磁分离，弃上清，然后洗涤（优 选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优 选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱（优选洗脱所用的洗脱液包含 pH缓冲液（如，Tris-HCl）。

尽管可以直接对样本进行核酸提取和/或荧光PCR检测，但是本发明人发现， 对在核酸提取前进行先期处理，能够有效改善最终的检测结果。权利要求1所述 的应用，其中步骤（1）中的处理的方法包括，

去除外周血的血浆后用细胞裂解液（如，氯化铵红细胞裂解液）裂解，加入 抗CD45免疫磁珠，混合均匀后保温，磁分离，弃上清，然后洗涤（优选用pH 缓冲液（如，PBS）洗涤）。

本发明还提供了本发明第一方面的应用中的试剂以及优选的试剂。例如，在 第二方面，本发明提供了本发明第一方面的应用中的试剂，其为所述应用中步骤 （3）所用的试剂，其特征在于，其包括靶核酸引物对和探针，其中所述探针标 记有荧光基团和淬灭基团，而且两种探针标记的荧光基团检测波长不同，其中，

靶核酸引物对包括：

AACGAGCCAGCCTATCTTGAATC，

TTCTGACTTGATCTGTGACCGGAG，

CTGAATCCAATCTTTGCTCACC，和

ATGCTTGAAGGCCAATATGA，

靶核酸探针包括：

CCGACATCGCCGCTCCGTAACAT，和

CCTCTATTCAGATCCAGCGGATA。

优选本发明第二方面的试剂还包括反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶 和dNTP（包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。这样，可以构成完整的荧光 PCR试剂盒。

也优选在本发明第二方面的试剂中，各种探针标记有不同的荧光基团，优选 荧光基团选自FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5。

又如，在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的应用中的试剂，其为所 述应用中步骤（1）和（2）所用的试剂，其特征在于，其包括细胞裂解液（如， 氯化铵红细胞裂解液）、抗CD45免疫磁珠和洗涤液（优选洗涤液是pH缓冲液（如， PBS））、以及核酸萃取液（优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、 吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液（如，Tris-HCl））、磁珠（如，D-Beads磁珠）、洗涤液（优选是两种洗涤液，更优选其中一种洗涤液包含高氯 酸钠和乙醇，也更优选其中另一种洗涤液包含乙醇)和洗脱液（优选洗脱液包含 pH缓冲液（如，Tris-HCl））。这样，可以构成外周血处理及核酸提取试剂盒。本 发明人发现，对外周血进行处理及核酸提取，是有益于荧光PCR检测结果的。

在第四方面，本发明提供了用于检测循环肿瘤（如，乳腺癌、结肠癌、前列 腺癌、肺癌和/或胃癌，优选是乳腺癌）细胞分子特异性标志物的试剂盒，其包括 本发明第二方面的试剂和/或本发明第三方面的试剂。优选其中不含有内对照核 酸。

优选本发明第四方面的试剂盒包括本发明第二方面的试剂。

也优选本发明第四方面的试剂盒包括本发明第三方面的试剂。

还优选本发明第四方面的试剂盒包括本发明第二方面的试剂和本发明第三方 面的试剂。

在第五方面，本发明提供了互不干扰荧光PCR的引物、探针混合物，其是引 物或探针的混合物，所述引物或探针选自

AACGAGCCAGCCTATCTTGAATC，

TTCTGACTTGATCTGTGACCGGAG，

CTGAATCCAATCTTTGCTCACC，

ATGCTTGAAGGCCAATATGA，

CCGACATCGCCGCTCCGTAACAT，和

CCTCTATTCAGATCCAGCGGATA。

该混合物可以用于本发明的第一方面的应用中，也可以用于构成本发明第二 方面的试剂和/或本发明第四方面的试剂盒。

本发明的有益效果在于：建立了一种快速、超敏的CTCs检测，可用于检测 乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌患者外周血是否存在CTCs，其中，准 确度高，大大降低假阳性和假阴性的可能性，尤其是几乎消除了假阴性结果，适 合实际推广使用；灵敏度高，最低检测限可在7.5mL血液中检测到1个copy的 肿瘤细胞，较现有技术提高了几个数量级；而且，操作方便、快速，容易自动化、 规模化，缩短检测时间，减小人为操作引入的误差，且无需添加内对照引物和探 针，节约检测成本。

附图说明

图1是采用本发明所述的试剂盒检测CK19基因阳性标准品（阳性标准品为 含有CK19基因检测位点的质粒DNA，可按照金翔凤的论文（非小细胞肺癌病人 外周血CK19mRNA表达及意义.齐鲁医学杂志,第23卷第3期）来构建）的荧光 定量PCR扩增曲线图（图片为不同copy数扩增检测的合并作图），图中，从左 到右，分别为10⁵copy/ml、10⁴copy/ml、10³copy/ml、10²copy/ml的CK19基因 标准品荧光定量PCR扩增曲线。

图2是临床病理诊断为乳腺癌的8例女性患者样本荧光定量PCR扩增检测 结果（图片为不同样本扩增检测的合并作图，相同颜色表明相同患者的两个探针 的扩增曲线）。

上述附图均为ABI7500荧光实时定量PCR扩增仪自带软件的原始扩增图， 图中横坐标为“PCR循环数”，纵坐标为“扩增反应的荧光值”。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领 域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》（第三版）（Cold Spring Harbor  laboratory Press）、《细胞实验指南》（科学出版社，北京，中国，2001年）、《RNA 实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出 版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来 实施。其中，所用的（带标记的）探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。

实施例1外周血样品的处理

本实施例的实验材料是收集某医院收治并经病理证实的乳腺癌患者外周血， 清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存 ≤4hr。

1.将抗凝管中的全血样本加入等体积PBS（pH7.0），于室温3000rpm离心5min， 去除上层血浆；

2.向保留液体中，加入等体积氯化铵红细胞裂解液（可购自碧云天），于室温 20rpm离心8min混匀后，以3000rpm室温离心5min，弃去上清；

3.加入1/10体积的抗CD45免疫磁珠（可购自宁波良瑞抗体生物技术公司）， 于转速110rpm的摇床上，室温混匀20min；

4.采用磁分离架进行磁珠分离（弃去上清）后，用PBS（pH7.0）洗涤磁珠，合 并洗液得到外周血样品处理液。

实施例2核酸的提取

核酸的提取采用常规磁珠提取法，步骤如下：以1∶100的体积比向实施例1 获得的外周血样品处理液中加入核酸萃取液（配方及终浓度为：异硫氰酸胍1.2M、 乙二胺四乙酸钠（pH8.0）10mM、吐温-202％（W/W）、高氯酸钠1M、乙醇40％ （V/V）、Tris-HCl（pH8.0）10mM），于42℃温浴10min，然后以10∶1的体积比 加入磁珠悬浮液（50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术 有限公司），振荡混合均匀后，磁分离后去上清，然后加入适量洗涤液A(配方及 终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇25％（V/V）)，洗涤后弃去洗涤液A，再加入适 量洗涤液B（配方及终浓度为：乙醇70％（V/V）），洗涤后弃去洗涤液B，最后 加入洗脱液（配方及终浓度为：Tris-HCl（pH8.0）10mM），于42℃温浴10min， 所得上清即为核酸提取液，并稀释供以下步骤检测。

实施例3荧光实时定量PCR扩增

1，引物及探针序列

委托合成如下引物对和探针，共6个核酸序列：

其中引物对为：

AACGAGCCAGCCTATCTTGAATC

TTCTGACTTGATCTGTGACCGGAG

CTGAATCCAATCTTTGCTCACC

ATGCTTGAAGGCCAATATGA

其中探针为

CCGACATCGCCGCTCCGTAACAT

CCTCTATTCAGATCCAGCGGATA

2，荧光标记

在上述探针的5’端分别标记荧光标记FAM和CY5，并在3’端标记相应的淬 灭基团。

3，PCR反应条件

反转录与PCR扩增在同一反应体系中进行，体系总体积为60uL，其中各组 分的终浓度分别为：实施例2获得的核酸提取液或不同稀释度的CK19基因阳性 标准品40uL，上述2对引物对中的每一种引物含量为15pmol/ml，上述2种探 针中的每一种含量为8pmol/ml，dNTP浓度各为0.2mmol/ml，10×PCR buffer （可购自TaKaRa公司，pH8.3，含Mg²⁺）为6uL，Taq DNA聚合酶为5U， M-MLV反转录酶20U，Rnasin5U，余量为去离子水。

反转录与PCR反应的步骤为：42℃30min，94℃10min，（94℃10s，60℃ 30s）45个循环，最后使用ABI7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM和CY5 检测波长。

4，结果判读标准

基线和阀值均为ABI7500荧光仪默认自动设定。如果各荧光（FAM和/或 CY5）Ct值≤45，则CTCs存在于样本中，判断为阳性；如果荧光检测结果计算 出的Ct值＞45，则CTCs不存在于样本中，判断为阴性。而且，只要有一个引 物对扩增被相应探针检测为阳性，则定性判断为阳性，而无论是否能进行半定量 分析。

5，结果

对不同稀释度的CK19基因阳性标准品（作为对照）的扩增结果如图1所示， 这表明不同copy数的标准样品经本发明的方法检测，不但能够反映准确结果， 而且其结果的可读性非常好，从10²到10⁵浓度范围内对数的线性关系较好，可 以对含量为100copy/ml及以上的样品进行半定量分析，该适宜进行半定量的范 围已经优于现有技术。

对实际患者的检测图谱如图2所示，不但全部能够表现出扩增的正确定性结 果，而且两个引物对和探针之间没有相互干扰，其中的高copy数的CK19可用 于与对照进行比较而得到半定量结果。

综上所述，本发明所述的试剂盒不仅快速、灵敏度高，而且其结果的判读非 常明确、直观，尤其对大量不同实际患者的样品重复检测，（定性）结果均准确， 表明本发明可靠性高，且无需内对照。

序列表

<110>苏州华益美生物科技有限公司

<120>循环肿瘤细胞（CTCs）荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用

<130>CN

<160>6

<170>PatentIn version3.5

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aacgagccag cctatcttga atc               23

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttctgacttg atctgtgacc ggag              24

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctgaatccaa tctttgctca cc          22

<210>4

<211>20

<212>DNA

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atgcttgaag gccaatatga             20

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<211>23

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cctctattca gatccagcgg ata                 23