HCV感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎和B细胞恶性肿瘤的预测标志物

摘要

本发提供了通过采用检测一种特异抗体上的交叉独特型表位(cross-idiotypic epitope)来检测在产生疾病的临床症状之前产生该抗体的细胞的用于与一种特异性抗体相关的疾病的早期诊断和治疗的方法和组合物。

说明书

相关申请

本申请要求于2010年3月1日提交的美国临时申请号61/309,161的优先权 的权益，通过引用以其全部内容结合在此。

技术领域

本发明总体上涉及用于与丙型肝炎病毒感染相关的疾病的早期诊断和治疗 的方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)感染的一种不常见的表现是与II型冷球蛋白血症(冷 球蛋白血症性血管炎)有关的系统性血管炎，一种增殖性B细胞紊乱，其中 5％-10％的患者转化为B细胞恶性肿瘤。产生冷球蛋白血症性血管炎所需要的 HCV感染的持续时间尚不明确，但似乎为10年或更长的时间。由于大多数感 染者在冷球蛋白血症性血管炎症状发作之前的这段延长的时间期间不表现出任 何症状，很少做出冷球蛋白血症性血管炎或相关的B细胞恶性肿瘤的早期诊断。 由于丙型肝炎患者在其有症状前不太可能进行治疗，本领域中对于发现有助于 HCV感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎和相关的B细胞恶性肿瘤的早期诊 断的预后标志物存在着需要。

发明内容

本发明包括通过采用检测一种特异抗体上的交叉独特型表位 (cross-idiotypic epitope)来检测在产生疾病的临床症状之前产生该抗体的细胞 的用于与一种特异性抗体相关的疾病的早期诊断和治疗的方法。具体而言，本 发明提供了一种在这样的患者产生该感染的这些并发症之前利用丙型肝炎病毒 (HCV)感染患者的B细胞克隆扩增(BCE)分析的用于与II型冷球蛋白血症 相关的冷球蛋白血症性血管炎或B细胞恶性肿瘤的早期诊断的方法。在此还描 述的是采用针对检测到的交叉独特型抗原的抗体进行治疗的方法。本发明是基 于以下令人惊奇的发现：即，在无症状HCV感染患者中检测到的WAB细胞是 产生冷球蛋白血症性血管炎和相关的B细胞恶性肿瘤的一个标志物。

在此描述的是用于鉴定具有产生与HCV相关的冷球蛋白血症性血管炎和 B细胞恶性肿瘤的风险的受试者的方法。首先，提供了一种来自感染有HCV的 受试者的样品。适合的样品是一种包括全血的生物流体。如果在样品中检测到 WA交叉独特型阳性(Xid+)B细胞，则该受试者被鉴定为具有产生与HCV相 关的冷球蛋白血症性血管炎和B细胞恶性肿瘤的风险的人。一方面，该受试者 是被早期鉴定的。优选地，该早期鉴定的受试者是在初次HCV感染之后、但 在表现与冷球蛋白血症性血管炎或B细胞恶性肿瘤相关的症状之前被鉴定的。

一方面，这些WA Xid+B细胞是通过鉴定来自一个克隆扩增的B细胞群 的一种免疫球蛋白核酸序列而检测的，其中该免疫球蛋白核酸序列与WA Xid 相关。该与WA Xid相关的免疫球蛋白核酸序列包含IgH V1-69、或IgHV V3-7 或相关的种系基因、VK325或VK328、JH4或JH3、Jk1、以及一个D区共有 序列，D区共有序列包括SEQ ID NO：1(共有序列1)或SEQ ID NO：2(共有 序列2)。

可替代地，这些WA Xid+B细胞是用一种分离的抗WA Xid的抗体检测的。 任选地，该分离的抗WA Xid的抗体附着到一种标记上。一方面，该标记是一 种异硫氰酸荧光素(FITC)标记或一种藻红蛋白(PE)标记。这些WA Xid+B 细胞是通过免疫染色或流式细胞分析进行检测的。一方面，该方法进一步包括 用一种抗CD11c抗体来检测该样品中的CD11C⁺的细胞。

还提供了用于鉴定具有产生与HCV感染相关的冷球蛋白血症性血管炎或 B细胞恶性肿瘤的风险的受试者的方法。首先，提供了来自一位HCV感染患者 的克隆扩增的B细胞的一种核酸样品来检测与WA Xid相关的免疫球蛋白核酸 序列，其中所述免疫球蛋白核酸序列包括IgH V1-69或IgHV3-7或有关的种系 基因、VK325或VK328、JH4或JH3、以及Jk1。随后，检测该样品中的包含 SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的一个序列。如果SEQ ID NO：1或SEQ ID NO： 2存在于含有与WA Xid相关的IgH和VK序列的源于HCV感染患者的核酸中， 则预测HCV感染相关性冷球蛋白血症性血管炎或B细胞恶性肿瘤的产生。一 方面，该患者缺乏冷球蛋白血症性血管炎或B细胞恶性肿瘤的临床症状。

本发明还提供了早期治疗在受试者中的与HCV相关的冷球蛋白血症性血 管炎和B细胞恶性肿瘤的方法。首先，获得一种来自感染有HCV的受试者的 样品。适合的样品是一种包括全血的生物流体。如果该样品含有WA Xid+B细 胞，则将一种抗WA的抗体给予该受试者，从而治疗受试者中的与HCV相关 的冷球蛋白血症性血管炎和B细胞恶性肿瘤。优选地，该早期治疗是在初次 HCV感染之后、但在表现出与冷球蛋白血症性血管炎或B细胞恶性肿瘤相关的 症状之前进行的。

本发明还提供了一种用于早期检测和治疗具有产生B细胞恶性肿瘤(由 WA B细胞引起的那些除外)风险的一位受试者的方法。首先，提供了一种来 自感染有HCV的受试者的样品。任选地，该特异性非WAXid+B细胞是用一 种分离的抗非WA Xid抗体检测的。一方面，该受试者是早期被鉴定的。优选 地，该早期被鉴定的受试者是在初次HCV感染之后、但在表现出与冷球蛋白 血症性血管炎或B细胞恶性肿瘤相关的症状之前被鉴定的。

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含一套第一引物和第二引物，以 及用于基于与WA Xid相关的免疫球蛋白核酸序列的检测来预测与HCV感染相 关的冷球蛋白血症血管炎和B细胞恶性肿瘤的说明书，这些免疫球蛋白核酸序 列包括IgH V1-69或VIgH V3-7或相关的种系基因、VK325或VK328、JH4 或JH3、Jk1、以及SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。该套第一和第二引物包括 位于互补决定区3(CDR3)序列的两侧的一种第一引物和一种第二引物、位于 VH-D-JH序列的两侧的一种第一引物和一种第二引物、以及位于Ig编码转录本 中的VK-JK序列的两侧的一种第一引物和一种第二引物。

根据本发明的以下优选实施方案的描述并且根据权利要求书，本发明的其 他特征和优点将是明显的。除非另有规定，在此使用的所有科技术语具有与本 发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与在此描述的那 些相似或等同的方法和材料可以被用于本发明的实践或试验中，以下描述了适 合的方法和材料。将所有出版物、专利申请、专利、Genbank/NCBI登录号、以 及其他在此提及的参考文献以其全部内容通过引用进行结合。在发生冲突的情 况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅仅是说明 性的而不旨在进行限制。

根据以下详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是明显的。

附图说明

图1是一个B细胞克隆扩增分析凝胶的化学发光图(chemilumigraph)。患 者的核糖核酸(RNA)被扩增。患者27、45、71、72、80、84和88被考虑为 阳性(白色箭头表示BCE)并且患者17、50、83、85、86和87被考虑为阴性。 通过凝胶图像的光密度扫描证实了这些分类。

图2显示了患者127的另外研究结果。图2A是外周血瑞氏染色的显微照 片，显示了绒毛淋巴细胞。图2B是一个流式细胞术直方图，显示了一个CD 11c+、WA+B细胞群。图2C和2D是描绘了用异硫氰酸荧光素(FITC)标记 的抗WA Xid(C)和藻红蛋白(PE)标记的抗CD11c(D)的CD11C分离的细 胞的双重染色的显微照片。

具体实施方式

在美国，感染有丙型肝炎病毒(HCV)的患者大约有四百万，全世界的感 染患者超过1.7亿。丙型肝炎病毒是黄病毒科中的一种小的(大小为50-65nm)、 具包膜的正义单链核糖核酸(RNA)病毒。丙型肝炎病毒颗粒由遗传物质核心 (RNA)组成，其被一个二十面体的保护性蛋白质外壳包围，并且进一步包装 在细胞来源的脂质(脂肪)包膜中。两种病毒包膜糖蛋白，E1和E2，镶嵌在 脂质包膜中。丙型肝炎病毒的主要基因型有6个，用数字表示，例如，基因型 1，基因型2，等等。

HCV通过血液到血液接触的方式传播，例如，注射药物使用(共用针头)、 受感染的血液产品和性传播，并且在人体中表现为丙型肝炎，一种影响肝脏的 感染性疾病。大多数人在初次感染之后具有很少的症状(如果有的话)，然而病 毒在大约85％的那些感染者的肝脏中持续存在。慢性感染一旦建立，可能进展 成肝脏瘢痕形成(纤维化)和晚期瘢痕形成(肝硬化)，后者通常在许多年之后 才明显。在一些情况下，肝硬化患者发展成肝衰竭或其他的肝硬化并发症，包 括肝癌。发展成肝硬化或肝癌的患者可能需要肝移植；然而，丙型肝炎病毒在 移植之后一般会再出现。

急性丙型肝炎是指在HCV感染之后的第一个6个月。60％到70％的HCV 感染者在急性期期间是无症状的。少数人经历急性期症状，症状通常是轻微的 和非特异性的，并且很少导致丙型肝炎的特异性诊断。急性丙型肝炎感染的症 状包括食欲减退、疲劳、腹痛、黄疸、瘙痒和流感样症状。

在感染之后的1至3周之内，通过聚合酶链式反应(PCR)在血液中通常 可检测到丙型肝炎病毒，并且在感染之后的3至15周之内，通常可以检测到针 对该病毒的抗体。自发病毒清除率是高度可变的，并且10％-60％(Caruntu FA 和Benea L，2006J Gastrointestin Liver Dis，15(3)：249-256)的感染有HCV的个 体在急性期期间从其体内清除该病毒，这表现为肝脏酶的正常化(丙氨酸转氨 酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST))、以及血浆HCV-RNA清除(被称为自 发病毒清除)。然而，持续感染是常见的，并且大多数患者发展为慢性丙型肝炎， 即，持续6个月以上的感染(Villano等人，1999Hepatology(肝脏病学)，29(3)： 908-914)。

慢性丙型肝炎经常是无症状的(没有症状)并且大多被偶然发现。慢性丙 型肝炎的自然病程从一个个体到另一个个体的变化相当大。虽然在肝脏活组织 检查时几乎所有HCV感染者具有炎症迹象，肝脏瘢痕形成(纤维化)的进展 速度在个体之间变化显著。已经报告的影响HCV疾病进展速度的因素包括年 龄(与疾病进展速度的增加相关)、性别(男性比女性具有更快的疾病进展)、 饮酒(与疾病进展速度的增加相关)、HIV共感染(与疾病进展速度的显著增加 相关)、以及脂肪肝(肝细胞中的脂肪的存在与疾病进展速度的增加相关)。

特异性地暗示肝脏疾病的症状典型地是缺乏的，直至已经出现大量的肝脏 瘢痕形成为止。然而，丙型肝炎是一种全身性疾病，并且患者可能经历宽范围 的临床表现：范围从缺乏症状到晚期肝病产生之前的更多的症状性疾病。与慢 性丙型肝炎相关的全身体征和症状包括疲劳、流感样症状、关节痛、瘙痒、睡 眠障碍、食欲改变、恶心和抑郁。

一旦慢性丙型肝炎进展到肝硬化，可能出现通常由肝功能减弱或肝循环压 力增加(一种被称为门静脉高压的病症)引起的体征和症状。肝硬化的可能体 征和症状包括腹水(在腹部中的液体累积)、青肿和出血倾向、静脉曲张(尤其 是在胃和食管中的扩大的静脉)、黄疸以及被称为肝性脑病的认知损害综合征， 肝性脑病是由于通常经由健康肝脏清除的氨和其他物质的积累所致。

持续HCV感染可用药物进行治疗，例如聚乙二醇干扰素和利巴制林。由 于大多数感染者在该疾病的急性期期间没有经历任何症状，因此很少在急性期 期间做出“丙型肝炎”的诊断。确实经历了急性期症状的那些感染者很少病到寻 求医疗救助的程度。慢性期丙型肝炎的诊断同样是挑战性的，这是由于直到产 生晚期肝病时为止缺乏症状特异性，症状特异性可能在初次感染之后几十年后 才会出现。虽然目前HCV疫苗在开发中，尚不存在针对HCV的疫苗。

丙型肝炎的诊断始于用来检测针对HCV的抗体的血清学血液试验。在暴 露之后15个星期之内，在大约80％的患者体内能检测到抗HCV抗体；在暴露 之后5个月之内，在＞90％的患者体内能检测到抗HCV抗体；在暴露之后6个 月之内，在＞97％的患者体内能检测到HCV抗体。总的来说，对于暴露于丙型 肝炎病毒感染而言，HCV抗体试验具有强的阳性预期值，但是可能遗漏那些尚 未产生抗体的患者(血清转化)，或具有不足以进行可靠检测的抗体水平的患者。

HCV感染的一种不常见的表现是：与II型冷球蛋白血症相关的系统性血管 炎(冷球蛋白血症性血管炎)。冷球蛋白血症是一种由血中的被称为冷球蛋白的 异常蛋白引起的血液病症，该蛋白在血液变冷时沉淀或凝集成块，在复温时溶 解。这些蛋白质可能沉积在小的和中等大小的血管中，可能导致流向关节、肌 肉和器官血液受限。冷球蛋白血症的病因不完全清楚，但被认为是一种自身免 疫疾病(由产生抗体的机体的免疫系统引起，这些抗体形成沉积在器官中并且 引起炎症的复合物)。大多数冷球蛋白血症，先前因为病因不清楚而被命名为原 发性混合型冷球蛋白血症，目前已知是由HCV感染引起的。

有三种类型的由免疫球蛋白组成的冷球蛋白血症(I型、II型和III型)。I 型由单克隆免疫球蛋白组成。II型和III型被称为“混合性冷球蛋白”，因为它们 由多克隆免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)组成。在II型中，该 IgM是单克隆的，而在III型中，该IgM是多克隆的。在这两种类型中，该IgM 通常有类风湿因子(RF)活性。类风湿因子是一种在罹患类风湿性关节炎(一 种慢性自身免疫疾病，其特征为关节的炎症)的人的血液中发现的抗体。最常 见的与冷球蛋白血症相关的症状和紊乱包括：血管炎、肾的(肾脏)疾病、关 节痛和关节炎、瘙痒、疲劳、疼痛、淋巴结肿大、周围神经病变、胃痛和/或出 血障碍。

治疗取决于冷球蛋白的类型、基础疾病以及症状的严重性。与自身免疫疾 病或原发性冷球蛋白血症相关的更广泛的血管炎可能对泼尼松、环磷酰胺或两 者有反应。虽然与丙型肝炎相关的冷球蛋白血症的最有效的治疗尚未确定，短 暂使用泼尼松继之使用干扰素α6个月已经产生了临床及肝功能试验改善，但 是当结束干扰素α治疗时，经常出现肝病和血管炎的复发。

II型冷球蛋白血症由多克隆免疫球蛋白G(IgG)和单克隆IgM类风湿因 子(mRF)组成，它们结合到一种抗体的Fc部分上，从而形成促成该疾病进展 的免疫复合物。与II型冷球蛋白血症相关的系统性血管炎(冷球蛋白血症性血 管炎)是一种在5％-10％的患者中转化成B细胞恶性肿瘤的增殖性B细胞疾病。 80％的mRF(Casato M等人，1997Blood(血液)，90：3865-3873)是独特的， 因为它们是由种系基因编码的(Kunkel HG等人，1973J Exp Med，37：331-42)， 并且具有一个称之为“WA”的、限制于HCV感染患者的抗体结合位点交叉独特 型(Xid)(Agnello V和Barnes JL，1986J Exp Med，164：1809-14)。免疫球蛋白 可变区含有被称作“独特型”的、能被血清学技术识别的抗原决定簇。 (Mackworth-Young等人，1987J Clin Invest，79：572-581)该WA交叉独特型 (Xid)——在人单克隆类风湿因子(mRF)中的主要交叉独特型，是一种构象 抗原决定簇，包括位于在抗原结合位点中的H链和L链(Kunkel HG等人，1973 J Exp Med，137：331；Agnello V和JL Barnes，1986J Exp Med，164：1809)。

带有WA交叉独特型(Xid)的单克隆类风湿因子是造成大多数在HCV感 染患者中的冷球蛋白血症性血管炎的原因。HCV浓集在II型冷球蛋白中 (Agnello V等人，1992N Engl J Med，327：1490-1495)，并且由该病毒驱动WA mRF的产生，正如抗病毒疗法诱导冷球蛋白血症和产生WA mRF的WA B细胞 的衰退，连同病毒血症的衰退。(Mazzaro C等人，1996Cancer(癌症)，77：2604-13； Casato M等人，2002Blood(血液)，99：2259-61；Hermine等人，2002N Engl J Med，347：89-94)

在欧洲南部和美国，冷球蛋白血症性血管炎的流行率估计为2％-5％并且分 别小于HCV感染患者的1％(Casato M和Agnello V，2002Mixed cryoglobulinemia syndrome secondary to hepatitis C virus infection(混合性冷球蛋 白血症次于丙型肝炎病毒感染).In：NORD Guide to Rare Disorders(罕见疾病 NORD指南)，第3版。National Organization for Rare Disorders(美国罕见疾病 组织)，编者；Lippincott Williams&Wilkins(利平科特威廉斯和威尔金斯)： Philadelphia(费城)，PA：5)。II型冷球蛋白血症患者比总HCV感染群体有大 得多的产生B细胞恶性肿瘤的风险。百分之五至百分之十的具有冷球蛋白血症 性血管炎的患者产生B细胞恶性肿瘤(Invernizzi F等人，1983Acta haematol (血液病学学报)，70：73-82)，而仅百分之0.2至百分之0.8的总HCV感染群 体(Ohsawa M等人，1999J Cancer，80：237-239；Giordano TP等人，2007JAMA， 297：2011-17)产生B细胞恶性肿瘤。而且，大约50％的B细胞非霍奇金淋巴 瘤似乎起源于WA B细胞(Knight G和Agnello V，2001Blood，97：3319-21； Knight GB.Gao L，Grangnani L，Elfahal M，De rosa FG， Gordon FD，Agnello V. Detectection of WA B cells in HCV infection：A potential prognostic marker for cryoglobulinemic vasculitits and B cell malignancies(在HCV感染中的WA B细 胞的检测：一种针对冷球蛋白血症性血管炎和B细胞恶性肿瘤的潜在的预测标 志物).Arth Rheum(关节炎风湿病学)2010；62：2152)。

百分之八十的HCV感染患者不会产生有症状的疾病。因此，这些患者中 仅有一小部分用抗病毒疗法进行了治疗。产生冷球蛋白血症性血管炎所需要的 HCV感染的持续时间尚不明确，但似乎为至少10年(Monti G等人，1995QJM， 88：115-16)。因此，除非发现预测标志物，这些患者在变得有症状之前是不太 可能被治疗的。如下面详细描述的，WAB细胞是II型冷球蛋白血症和/或B细 胞淋巴瘤的一种标志物，并且允许用于早期诊断。除了预防冷球蛋白血症性血 管炎和B细胞恶性肿瘤的发病率和死亡率的增加之外，在症状发作之前对这些 患者进行早期检测和治疗可能是有益的，因为一旦血管炎发作患者会对治疗产 生更强的抵抗(Agnello V，2000J Rheumatol(风湿病学杂志)，27：2065-7)。

如下面详细描述的，无症状HCV感染患者中的WA B细胞是通过B细胞 克隆扩增(BCE)的分子分析进行检测的。B细胞增殖的早期检测是通过逆转 录多聚酶链反应(RT-PCR)来检测血液中组成正常B细胞库的Ig基因重排而 确定的。以这种方式，检测了扩增的B细胞克隆，例如，II型冷球蛋白血症或 B细胞恶性肿瘤中的过度表达的B细胞克隆。WA B细胞克隆扩增(BCE)是 利用已经建立的编码WA mRF的Ig基因的广泛标准通过BCE的序列分析而被 鉴定的(Knight GB等人，1993J Exp Med，178：1903-11)。

实例1.在无症状HCV感染患者中的WA B细胞是产生冷球蛋白血症性血管炎和相关的B细胞恶性肿瘤的标志物。

简要地说，对无症状HCV感染患者、HCV阴性患者以及具有WA mRF阴 性和阳性的冷球蛋白血症性血管炎的对照患者进行了检查。分离BCE，进行测 序，并且鉴定WA BCE。如下面详细描述的，在具有冷球蛋白血症性血管炎的 所有阳性对照患者中检测到BCE；然而，仅仅HCV感染患者具有WA BCE。 33例对照HCV阴性患者都没有BCE。在55位具有无症状HCV感染的患者中 的4位(7.4％)体内检测到WA BCE；14位具有III型冷球蛋白血症以及37位 具有血清RF的HCV感染患者分别是均没有WABCE、5位有WABCE。1位 具有WA BCE的患者患有无症状脾淋巴瘤(具有绒毛淋巴细胞)，这些淋巴细 胞是WA B细胞。

对无症状HCV感染者、HCV阴性患者以及具有对WA mRF阴性和阳性的 冷球蛋白血症性血管炎的对照患者进行了检查。在经过6个月的时期，从Lahey Clinic(伯灵顿，MA)的Gastroenterology Clinic(胃肠病学诊所)的已同意该研 究的、具有和不具有HCV感染的连续的无症状患者获得用于B细胞克隆分析 的血标本。HCV感染患者未曾接受任何抗病毒治疗或化疗。从Lahey Clinic 的不同部门募集患有冷球蛋白血症性血管炎或III型冷球蛋白血症的患者。在一 个两年的随访研究中，从在Veterans Affairs Medical Center(退伍军人服务部医 疗中心)的Hepatitis Clinic(肝炎诊所)(VAMC；贝德福德，MA)获得具有 RF阳性的、但是没有冷球蛋白血症的无症状HCV感染患者的血样。回顾医疗 记录以决定患者的人口学特征、冷球蛋白血症性血管炎或其他肝外病疾病表现 的存在、以及肝硬化的存在。

为了诊断冷球蛋白血症性血管炎，需要存在以下各项之一：可触知的紫癜、 周围神经病变、肾脏病、或活组织检查证实的中等大小血管的血管炎。肾脏病 标准包括存在以下各项之一：蛋白尿＞500mg/die、肾病综合征、肾小球肾炎、 急性或慢性肾衰竭、血清肌酸酐＞1.5mg/dl。排除其他疾病(例如，糖尿病或 系统性红斑狼疮)引起的肾脏病。周围神经病变由神经病学家进行诊断，具有 或不具有经过电生理参数的证实。排除继发于其他疾病(如糖尿病或酒精中毒) 的周围神经病变。如前所述，进行了HCV抗体、HCV RNA检测和定量、以及 冷球蛋白分离、定量和分型(De Rosa FG和Agnello V，2009J Rheumatol(风湿 病学杂志)，36：1953)。反复研究病因不明的具有HCV阴性冷球蛋白血症性血 管炎的患者的血清和冷球蛋白HCV抗体以及HCV RNA检测，以证实没有HCV 感染。在临床实验室中进行谷丙转氨酶(ALT，正常范围7-40IU/ml)和类风湿 因子(RF，正常范围＜20IU/ml)研究。通过常规的Ficoll密度梯度离心从肝素 化血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。

对来自127号患者的样品进行另外的分析。在临床实验室中进行血液学试 验和淋巴细胞的免疫分型。CD11c⁺的淋巴细胞(绒毛淋巴细胞的表型标志物(Liu X等人，2003J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，23：236-8)按如下方法进 行分离：用小鼠抗CD11c抗体(Beckman Coulter；富勒顿，CA)在4℃孵育 PBMC持续30分钟，洗涤，用免疫磁珠(Dynabeads)山羊抗小鼠Ig磁珠 (Invitrogen公司；卡尔斯巴德，CA)在4℃孵育30分钟。通过磁铁捕获CD11c+ 的细胞，洗涤，在37℃孵育过夜以分离附着的磁珠。在孵育之后，用磁铁将磁 铁将磁珠从细胞上移去。分离的细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗WA mRF和藻红蛋白(PE)标记的抗CD11c进行染色，并且通过荧光显微镜和流 式细胞仪进行检查。

BCE的检测和分析

在B细胞发育过程中，免疫球蛋白重链基因座重排，使组成重链可变部分 的第三互补决定区(CDR3)的V_H、D和J区并置。在重排过程中，在V_H-D(N) 和D-J(P)结点发生核苷酸添加和缺失。使用位于这个区域两侧的引物进行 RT-PCR，评定mRNA中的CDR3区重链基因的多样性。将得到的产物解析在 测序胶上，其在正常库中代表片段长度的正常分布(大约CDR3的平均长度以 3个核苷酸、或1个密码子不同)。在特定B细胞克隆的单克隆扩增的情况下， 正如出现在II型冷球蛋白血症中一样，在测序胶上的一个条带可能过度表达。 从测序胶上切下观察到的克隆扩增的条带并且经受直接循环测序。序列与 GenBank中已知的Ig序列进行比较。

虽然可以使用V_H3(IGHV3-7)基因，WA mRF主要是IGKV3-20(Kv325) 轻链基因和包括IGHV1-69的V_H1基因以及相关的种系基因的产物(Knight GB 等人，1993J Exp Med，178：1903-11)。D区具有两种类型的序列特征。共有序 列1(SEQ ID NO：1)，以谷氨酸开始、以脯氨酸结尾的、与IGHV1-69基因和 通常地J_H4相关的9-11个氨基酸的区域，似乎来自IGHD4-17基因1(Knight GB 等人，1993J Exp Med，178：1903-11)。共有序列2(AEQ ID NO：2)最初发现于 含有WA RF、M7(Pinheiro G等人，1993年基因库登录号UO3400和UO3401) 的VH3-7中，并且后来发现与结合有J_H3和IGKV3-15(kv328)的其他V_H3-7RF 相关(Borretzen M等人，1995J Immunol(免疫学杂志)，155：3630-7)。

用(Life Technologies)或Rneasy RNA抽提试剂盒(QIAGEN) 从外周血单核细胞(PBMC)分离总细胞RNA。如前所述进行RT-PCR(Knight GB等人，1993J Exp Med，178：1903-1911)。使用来自在FW3中的保守区和μ 恒定区的引物进行初次指纹筛查以检查CDR3多样性。用恒定区引物，使用来 自VH前导序列和FW1区域的上游寡核苷酸获得VH-D-JH PCR产物。使用来 自VK前导序列的上游寡核苷酸和来自K恒定区的下游引物扩增VK-JK片段。 在各自PCR中的一个引物用生物素标记，用于分离扩增子，或者用6-FAM标 记，以便使用ABI377自动DNA测序仪和软件快速筛选寡克隆带。 在6％测序胶上电泳分离PCR产物，通过毛细管转移将其转移到Tropilon-plus 膜(Tropix)上，通过化学发光进行检测。从测序胶上切除并纯化在化学发光 图上所观察到的克隆扩增的条带。使用具有Big Dye终止子的ABI 377自动 DNA测序仪或生物素化学发光仪(Phototope-star，新英格兰生物实验所)使单 克隆扩增的Ig基因经受直接循环测序。使用在NCBI的BLAST服务器，将获 得的Ig基因的推导氨基酸序列与GenBank数据库中的Ig序列的比较进行分析。 统计分析

总结各组的人口学和临床特征并且表示为频率(性别)和平均值以及标准 偏差(连续变量)。将具有BCE和WA BCE的患者的数目列表，使用Fisher′s 精确检验，将各扩增类型的流行率在感兴趣的关键组之间进行比较。以≤0.05 的P值用作阈值，推断组之间的显著不同的流行率。

人口学和实验室数据总结在以下表1中。采用来自十位具有冷球蛋白血症 性血管炎的患者的阳性和阴性对照样本来检验BCE方法。阳性和阴性对照组分 别由6个HCV感染患者(HCV+，II型)和4个HCV阴性患者(HCV-，II型) 组成(表2)。正如对于具有冷球蛋白血症性血管炎的患者所预期的，在两个组 中的所有患者体内发现了BCE。通过对检测到的BCE的序列分析，鉴定了WA BCE(图1，表3)。6位HCV+、II型组中的患者中的4位具有WA BCE；这一 发现与先前报道的具有冷球蛋白血症性血管炎的HCV感染患者中的WA mRF 的流行率一致(Casato M等人，1997Blood，90：3865-3873)。HCV-、II型组均 无WA BCE，这证实WA mRF限于HCV感染患者。

表1

关于患者的临床和实验室数据

表2

在HCV感染患者和对照中的BCE的检测

表3

通过核酸测序分析鉴定WABCE

为了确定WA BCE是否能在无症状HCV感染患者中检测到，对一组55位 无症状HCV感染患者(HCV+)和一组33位HCV阴性患者(HCV-)进行了 检查。在HCV+组中的9位患者体内(14％)检测到BCE。在这个组中的4位 患者(7.4％)具有WA BCE。这些患者的血清中既没检测到冷球蛋白，也没检 测到RF。对医疗记录的评论证实这些患者均不具有冷球蛋白血症性血管炎或其 他的肝外症状。在具有非WA BCE的5位患者中：一位患者既不具有冷球蛋白 也不具有RF；一位患者具有RF阴性的、与冷球蛋白血症性血管炎不相关的II 型冷球蛋白血症(De Rosa FG和Agnello V，2009J Rheumatol(风湿病学杂志)， 36：1953)；三位患者具有弱阳性血清RF(21.7，23.7，40.9IU/ml)。在HCV阴性 组中的患者均不具有BCE。

具有WA BCE的患者均无症状，但是在一位患者中(127号患者，表3)， 在外周血中存在绒毛淋巴细胞，并且B淋巴细胞表型与脾淋巴瘤一致，虽然该 患者没有淋巴瘤的体征或症状。免疫分型显示为IgM+、K+、IgD-、CD19+、 CD5-、CD10-、CD23-、CD11c+、WA+的一个单克隆B细胞群。绒毛淋巴细胞 包括5％的外周淋巴细胞。由于绒毛淋巴细胞与CD11c相关，从患者(127号 患者)的外周血淋巴细胞中分离了CD11c淋巴细胞。流式细胞和荧光显微镜研 究证明了一个单克隆的WA+、CD11c+B细胞群，这些B细胞似乎是绒毛淋巴 细胞(图2)。这一发现提示一些绒毛淋巴细胞可能为WA B细胞。

对27个BCE中的22个进行了核酸序列分析(表3)。五个BCE由于序列 污染，不能进行分析。22个BCE中的十三个具有WA序列。十个具有共有序 列1D区，并且3个具有共有序列2。后者中的2个与IGHV1-69而不是IGHV3-7 进行重组。一个BCE具有一个IGKV3-15轻链序列；其余的具有在WA mRF中 发现的最常见的轻链序列，IGKV3-20。存在着除了WA之外的7个序列；除了 D区基因之外，所有7个序列具有与WA相似的Ig基因。与已知的RF或与抗 HCV E2包膜蛋白E2(在HCV感染中鉴定的唯一的另一种单克隆蛋白)没有 同源性(Quinn ER等人，2001Blood，98：3745-49)。4个展示出与GenBank中 任何已知的Ig序列没有显著的D区同源性，一个显示出与记忆B细胞中发现 的Ig具有微弱的同源性(Stein K等人，1999Blood，94：2800-8)，并且两个显 示出与胎Ig具有显著的同源性(Zemlin M等人，2001Blood，97：1511-13)。

假定随着HCV感染持续时间的增加，mRF从多克隆RF到III型冷球蛋白 (多克隆IgG和多克隆IgM RF)到II型冷球蛋白转换(Lunel F等人，1994 Gastroenterology(胃肠病学)，106：1291-300；Schifferli JA等人，1995Adv Nephrol Necker Hosp，24：107-29)而来。相比于既没有RF、也没有冷球蛋白血症的患者， 这种“转换”假设预测在具有RF的患者中以及在具有III型冷球蛋白血症患者中 的WABCE流行率增加。

为了确定在具有RF的HCV感染患者中的WA BCE的流行率是否增加，对 在血中具有RF、但是没有冷球蛋白血症的一组37位无症状HCV感染患者 (HCV+，RF)进行了检查(表2)。这个组中的7位患者(18.9％)具有BCE， 并且5位(13.5％)具有WA BCE。相比于在HCV+组中，在HCV+、RF组中 的BCE和WA BCE的流行率没有显著增加(对于BCE和WA B，分别为p＝0.78 和p＝0.48)。

为了确定BCE和WA BCE的流行率的增加是否存在于在具有III型冷球蛋 白血症的HCV感染患者中(HCV+，III型)，对具有III型冷球蛋白的14位患 者进行了检查(表2)。仅一位具有BCE；一种非WABCE。相比于HCV+组， 在HCV+、III型组中的BCE和WA BCE的流行率没有显著增加(对于BCE和 WA B细胞，分别为p＝0.67和p＝0.58)。

无症状HCV感染患者中WA BCE的检测显示WA B细胞是冷球蛋白血症 性血管炎和B细胞恶性肿瘤发展的一种标记物。如上所述，为了支持这个观点， 具有与绒毛淋巴细胞脾淋巴瘤一致的单克隆B细胞群的127患者检测到WA B 细胞标记物。假定这位患者进展到临床脾淋巴瘤，偶然找到这样一位患者的机 率大约为1千万分之一，如果以下流行率是独立的话：在美国的HCV感染(大 约1％)、HCV感染者中的WA BCE的流行率(7.5％)、非霍奇金淋巴瘤(NHL) 的流行率(0.1％)、以及脾淋巴瘤的流行率(小于NHL的15％)。由于在血中 的绒毛淋巴细胞是WA B细胞，这位患者也是信息性的。假定具有绒毛淋巴细 胞的脾淋巴瘤与II型冷球蛋白血症和HCV感染是相关的(Saadoun D等人，2005 Blood，105：74-6)。以上呈现的结果表明在HCV感染患者体内的一些脾淋巴瘤 中的绒毛淋巴细胞是WAB细胞。

WA BCE解释为在HCV感染患者中大约一半检测到BCE。没有鉴定非 WA BCE序列。它们与RF无关，因为它们与任何已知的RF没有显著的D区 同源性。同样，它们与HCV感染者中鉴定的除了WA mRF之外的唯一的单克 隆蛋白(抗HCV包膜蛋白E2)无关(Quinn ER等人，2001Blood，98：3745-49)。 虽然没有D区同源性，在非WA BCE中的所有其他Ig基因与WA基因相似。 编码WA mRF的Ig基因用于先天宿主防御免疫球蛋白应答。这些基因还发现于 胎和B细胞记忆Ig库中(Klein U等人，1997Blood，89：1288-98)，这可以解释 与在三个非WA BCE中发现的这些免疫球蛋白的同源性。在HCV感染者中的 BCE的最可能的病因学的解释是，在这次感染中产生了多种多样的天生免疫球 蛋白，这些免疫球蛋白被刺激并且随着延长的感染持续时间而被扩增，这是该 疾病的特征。

在一个先前的研究中，RF存在于所有具有BCE的HCV感染患者的血清中， 这使得作者推断出产生RF的克隆(Franzin F等人，1995Br J Haematol，90： 548-52)。在这个研究中，在没有RF的患者的血清中BCE的检测以及在具有 RF的患者中与RF没有显著同源性的BCE的检测证明该推断不成立。另外， 在相同的研究中，在具有III型冷球蛋白的HCV感染患者中没有被检测到BCE。 后面的研究结果，与这个研究的结果一起考虑，提供了反对人们广泛认为的II 型冷球蛋白起源于III型冷球蛋白的证据。

当前，大约2％的HCV感染患者用抗病毒疗法进行了治疗(Volk ML等人， 2009Hepatol，50：1750-55)。一位将产生冷球蛋白血症性血管炎或B细胞恶性肿 瘤的患者接受抗病毒疗法的机率分别小于五百分之一和五千分之一。自动高通 量测序仪使得在此描述的方法的临床应用变得可行。例如，HCV的常规基因分 型是通过有成本效益的、高通量的序列分析来进行的。而且，使用一种抗WA Xid 抗体检测WA Xid的方法(如上对于患者127所描述的)可以提供一种更简单 的、临床适用的方法学。

在这个研究中，在HCV感染患者中检测到的BCE的56％是WA BCE，这 可能是WA B细胞恶性肿瘤在HCV感染患者中的流行率的一个合理估计。当前， 仅仅在B细胞恶性肿瘤中鉴定了WA Xid；25％的与HCV感染相关的NHL是 WA B细胞。可能的是，大多数的(如果不是所有的)Wallenstrom巨球蛋白血 症以及与HCV感染相关的脾淋巴瘤来源于WA B细胞(Agnello V等人，1992N Engl J Med，327：1490-5；Casato M等人，2002Blood，99：2259-61)。当进行更大 人群的结果研究时，上述Xid的分析方法可以鉴定进展到B细胞恶性肿瘤的其 他BCE。

在此描述的这些方法允许具有BCE的无症状HCV患者的鉴定和治疗。在 此描述的方法还允许WA B细胞和其他B细胞增殖的早期检测，这在预防和治 疗在HCV感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎和B细胞恶性肿瘤中是有用的。 在这些患者体内的B细胞恶性肿瘤中的Xid的鉴定也提供了一种可替代的治疗 方式。例如，单克隆mAb抗Xid抗体用作一种治疗剂，例如抗WA mAb用来 治疗对抗病毒疗法无反应的WA B细胞恶性肿瘤。

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