用于点状物体的三维定位的显微镜设备和显微镜方法

摘要

本发明涉及一种用于点状物体的三维定位的显微镜设备和显微镜方法。描述了用于点状物体的三维定位的显微镜设备。设备包括两个成像光学部件，两个成像光学部件均以聚焦光分布的形式将位于物体空间中的同一个点状物体成像到两个单独的像空间；两个检测器单元，两个检测器单元中的每个被分配给两个成像光学部件中的一个，并捕获在各自的像空间中设置的检测面的检测点中可分析的光斑；以及评估单元，评估单元建立两个检测面的检测点之间的相互成对的对应性，并通过分析两个光斑来确定点状物体的横向x-y位置和轴向z位置。

说明书

技术领域

本发明涉及用于点状物体的三维定位的显微镜设备和显微镜方法。

背景技术

光学显微成像方法最近已被发展，该光学显微成像方法使得成像比通过采用单独标记 (特别是荧光分子)的连续的、随机的定位的常规光学显微镜的衍射诱导的分辨率极限更小 的样本结构成为可能。例如在WO 2006/127692 A2，DE 10 2006 021 317 B3，WO 2007/128434 A1，U.S.2009/0134342 A1，DE 10 2008 024 568 A1，WO 2008/091296 A2，“Sub-diffraction-limit  imaging by stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)，”Nature Methods 3，793-796 (2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy  using fast single molecule photo-switching，”Geisler C.等，Appl.Phys.A，88，223-226(2007)中描 述了这样的方法。显微术的这个新的分支也被称为定位显微术。应用的方法在文献中例如通 过以下名称是已知的：(F)PALM((荧光)光活化定位显微术((fluorescence)photoactivation  localization microscopy))，PALMIRA(具有独立地运行采集的PALM(PALM with  independently running acquisition))，GSD(IM)(基态损耗(单独分子返回)显微术(ground  state depletion(individual molecule return microscopy)))或(F)STORM((荧光)随机的光 学重建显微术((fluorescence)stochastic optical reconstruction microscopy))。

这些新方法的共同之处是：待成像的样本结构的准备包括使用点状物体，点状物体通常 被称为标记，点状物体具有两个可分辨的状态，即“明亮”状态和“黑暗”状态。例如，如果荧 光染料被用做标记，则该明亮状态为能够发荧光的状态，且该黑暗状态为不能发荧光的状态。

在优选的特定实施例中，例如，在WO 2008/091296 A2和WO 2006/127692 A2中，使 用了可光切换的(photoswitchable)或可光激活的(photoactivatable)荧光分子。可选地，如， 例如，在德国审查的接受的说明书DE 10 2006 021 317 B3中的，利用标准荧光分子的固有 黑暗状态。

为了以比成像光学部件的常规分辨率极限更高的分辨率使样本结构成像，标记中的小子 集被重复地转换到明亮状态。这需要选择形成这个激活的子集的标记的密度，该密度将确保 在明亮状态(因此在该状态下可通过光学显微术成像)中相邻的标记之间的平均距离大于成 像光学部件的分辨率极限。形成激活的子集的标记被成像到空间分辨的光检测器(例如，CCD 照相机)上，以便从每个点状标记记录以光斑为形式的光分布，通过光学部件的分辨率极限 确定光斑的尺寸。

因此，在其他激活子集被成像中的每一个中，多数单独的原始数据图像被捕获。在每个 单独的原始数据图像中，然后可在图像分析步骤中确定光分布的质心位置，该光分布表示在 明亮状态中的点状标记。然后将从单独的原始数据图像中确定的光分布的质心位置以组合的 图像数据记录的形式的全部表现而集合。由这个全部表现产生的高度分辨的组合图像反映标 记的分布。

典型地复制待成像的样本结构需要足够数量的标记信号被检测。然而，由于在特定激活 子集中标记的数量受在明亮状态中的两个标记之间的所需的最小平均相互距离限制，因此必 须记录大量的单独的原始数据图像以能够完全地成像该样本结构。单独的原始数据图像的数 量范围典型地为10000至100000。

在以上描述的定位显微术方法中，在光检测器上生成的单独的光斑的质心位置典型地仅 在二维上确定，以便从所有质心位置重建的样本结构的高分辨图像同样地也仅是二维图像。 然而，在三维上重建该样本结构是优选的。

使在样本中进行单独点状物体的三维位置确定可能的相关领域中的方法是已知的。就这 点而言，示例性地参考WO 2009/085218 A1和U.S.7,772,569 B2，以及“Three-dimensional  tracking of fluorescence nanoparticles with subnanometer precision by use of off-focus imaging，” Optics Letters，2003，第28卷(第2期)，Michael Speidel等；和“Three-dimensional Particle  Tracking via Bifocal Imaging，”Nano Letters，2007，第7卷(第7期)，2043-2045页，Erdal  Toprak，等。在U.S.7,772,569 B2中描述的方法是基于在不同图像平面中的至少两个图像传 感器上散焦的图像图形分析的。在根据WO 2009/085218 A1的方法中，使用专用的光学部件 分析光图形的椭圆性。

相关领域中的方法需要用于质心确定和图形识别的复杂的图像分析，或需要限制根据这 些方法运行的显微镜设备的一般有效性的专用的光学部件。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种设备和方法，该设备和方法在承担最小的技术花费的同 时将使得点状物体的简单三维定位成为可能。

本发明通过根据权利要求1的显微镜设备实现这个目的，因为：两个成像光学部件的每 个包括光学装置，该光学装置将各自的聚焦光分布倾斜朝向检测轴，该检测轴设在所述各自 的成像光学部件中且垂直于各自的检测器单元的检测面；通过光学装置生成所述两个聚焦光 分布的倾斜度是相互相反的，使得考虑检测点对应性，两个光斑响应点状物体在各自的检测 面中的所述z位置的变化在相反的方向上移动；以及评估单元基于两个光斑的相对位置确定 点状物体的轴向z位置。

根据本发明，考虑成像光学部件的有限的分辨能力，聚焦光分布可被理解为通过成像(理 想化的)点状物体获得的三维光分布。在本技术领域中，这样的聚焦光分布经常以通常称为 点扩散函数(简称为PSF)的形式被描述。

因此，本发明提供：三维聚焦光分布，该三维聚焦光分布由成像光学部件所产生，并通 过成像光学部件使点状物体(例如荧光分子)被成像到两个检测器单元上，三维聚焦光分布 相对于各自检测器单元的检测轴被倾斜地转变角度，以便获得(可以说是)对聚焦分布的对 称性的打破，该打破可非常简单地和容易地用于定位该点状物体。因此，由于各自聚焦光分 布的倾斜度，聚焦光分布沿着各自检测器单元的检测轴的偏移导致光斑横向移动，该光斑由 聚焦光分布在对应的检测器单元上产生。由于两个聚焦光分布的倾斜度是相互相反的，因此 对应的光斑的上述横向移动在两个检测器单元上是相反指向的。因此(除横向x-y位置之外)， 可由光斑的这种相反指向的横向移动确定点状物体在物体空间中的轴向z位置。由此，使物 体的简单三维定位成为可能。

为了能从在检测器单元上两个光斑的以上描述的相反指向的移动推断点状物体的三维 位置，提供了一个检测面的检测点与其他检测面的检测点之间的成对空间关联。这种关联提 供了两个检测面的检测点的唯一对应性，该唯一对应性使得相互比较两个光斑的位置以确定 点状物体的三维位置成为可能。因此，根据本发明的检测点对应性也可被理解为像重叠，该 像重叠使得定位成为可能。

根据本发明的设备在不需要复杂图像分析或图形识别的情况下使得简单地评估检测器 单元上产生的光斑成为可能。根据本发明的设备在不需要技术复杂或高额成本的专用光学部 件的情况下允许快速的、理想地能够实时的、三维物体定位。

该设备可被用于上述说明的高分辨率定位显微镜中，直到目前在该高分辨率定位显微镜 中，仅二维定位已是通常可能的。然而，该设备不限于这样的用途。因此，该设备也可被用 于，例如，被称为“粒子追踪”的方法中，被称为“粒子追踪”的方法例如用于根据时间追踪移 动的扩散粒子。在目标是提供限定的点状物体的三维位置确定中，可想到任何用途。在此也 示例性地提到单分子显微镜。在本文中，点状物体应被理解为其空间范围小于成像光学部件 的常规的(衍射限制的)分辨率的所有物体。

评估单元优选地获得各自光斑的质心位置，并基于获得的两个光斑的质心位置确定的横 向x-y位置和轴向z位置。该质心位置可以从定位显微镜通常已知的方式获得。确定质心位 置的精度基本上依赖于检测器单元捕获光斑时采用的信噪比，因此，例如，依赖于形成点状 物体的荧光分子的检测到的光子的数量。可通过使用合适的用于区分和/或消除背景或噪声 信号的图像处理而提高定位精度。无论如何，确定各自质心位置的方法是基于特定光斑由一 个单个点状物体产生的知识的。这使得以远比成像光学部件的分辨率极限更好的空间精度确 定物体的位置成为可能。

在一个优选的实施例中，评估单元基于两个光斑的质心位置的平均值确定点状物体的横 向x-y位置。这使得以非常好的精度确定物体在物体空间中的横向位置成为可能。

该评估单元优选地基于两个光斑的质心位置之间的距离确定该点状物体的轴向z位置。 如果两个检测器单元的检测面是光学地相互地共轭的，即，成像相同的物体平面，则(考虑 以上进一步描述的检测点对应性)假定该物体平面上的准确聚焦，两个光分布的质心位置之 间的距离基本上等于零。如果检测点对应性被理解为像的重叠，则在该情况下质心位置重合。 另一方面，随着增加的散焦，由于两个聚焦光分布的相反倾斜度，该距离就绝对值来说增加； 分布的相反倾斜度也使清楚地识别这种散焦发生的方向(即两个检测面位于与包含待定位的 物体的物体平面光学共轭的、在像空间中设置的平面之前或之后)成为可能。这允许物体的 轴向z位置的唯一和精确的确定。

两个检测器单元的检测面优选地与物体空间中的相同物体平面光学共轭。这使得两个光 斑的特别简单的评估成为可能，两个光斑在各自检测面中的位置为检测面相对于包含待定位 的物体的物体平面的聚焦状态的函数。

在一个优选的特定实施例中，根据本发明的设备的特征在于记录透镜，该记录透镜由两 个成像光学部件共用且将从所述点状物体出现的光转换为优选平行的光线束，且根据本发明 的设备的特征在于分束器，该分束器将由记录透镜生成的光线束分离为两个部分光线束，两 个部分光线束中的每个在各自的检测单元上产生两个光斑中的一个。例如，该分束器可被配 置以将点状物体发出的光的一半指向一个检测器单元，将点状物体发出的光的另一半指向另 一个检测器单元。在这个特定实施例中，被共用的记录透镜可被作为一个成像光学部件的一 部分，以及作为另一个成像光学部件的一部分。如果该记录透镜将从物体出现的光转换为平 行的光线束，则该记录透镜下游的成像光学部件可在被分配给其的光束路径上很自由地定 位。

优选地，每个成像光学部件的特征在于筒内透镜，该筒内透镜将各自的部分光线束聚焦 到各自的检测器单元上。在这种情况下，该筒内透镜可被用于各自的成像光学部件中，以根 据本发明的方法倾斜地使光分布转变角度。例如，这可实现，例如，因为筒内透镜与成像光 学部件的光轴横向偏移，使得产生聚焦光分布的部分光线束偏离中心地撞击筒内透镜。在这 样的偏离中心入射的情况下，筒内透镜产生希望的聚焦光分布的倾斜度。如果筒内透镜相对 于成像光束路径的光轴的横向偏移是可可变地设置的，则聚焦光分布的倾斜度可如希望的变 化。在这种情况下有利的是，对应的检测器单元也是空间可调整的，以使根据聚焦光分布的 位置的变化能够对对应的检测器单元进行控制。

例如，用于倾斜地使各自的聚焦光分布转变角度的所述光学装置提供在各自的成像光学 部件中设有的光学元件的偏离中心的照明，优选地是偏离中心的欠照明。因此，以上说明的 关于筒内透镜的偏离中心的照明也可被提供用于各自成像光学部件的任何其他希望的光学 元件，以实现聚焦光分布的希望的倾斜度。在此欠照明被理解为光学元件的入射光孔不是完 全地被光横过而是仅部分地被光横过的光入射。能够通过这样的欠照明增加聚焦光分布的尺 寸。因为可变的欠照明允许在宽范围内调整聚集光分布的大小，因此可变的欠照明是特别优 选的。

聚焦光分布的希望的相反倾斜度也可以任何其他希望的方式实现。除与各自光束路径的 光轴横向偏移的透镜或透镜组之外，例如也可使用具有非球面透镜表面的透镜，该具有非球 面透镜表面的透镜产生希望的聚焦光分布的倾斜度。根据本发明的光学装置也可为空间光调 制器，该空间光调制器影响入射光的波阵面，以便获得希望的聚焦光分布的倾斜度。

两个检测器单元不一定是单独执行的元件。两个检测器单元也可被共同地配置在一个组 件上，例如以CCD照相机组件的两个子区域的形式。这消除了调整两个检测器单元以以希 望的方式使两个检测器单元相互定位的需要。

本发明的另一方面提供了根据权利要求12用于点状物体的三维定位的显微镜方法。

根据本发明的该方法可被很有利地用于上述描述的定位显微镜中。在这种情况下，多个 点状物体同时被成像到用于三维定位的各自的检测器单元上；在物体空间中，将点状物体间 隔开横向距离，该横向距离足够大以允许使点状物体在各自检测面中成像的光斑被相互空间 分开地捕获。因此，多个点状标记可通过记录一个单个原始数据图像而被三维定位。通过随 后将对于在组合的图像中的一系列单独图像的确定的质心位置进行集合，也可简单和快速地 重建复杂的三维定位结构。

附图说明

以下参考附图对本发明进行详细说明，其中：

图1为用于示出到检测器单元上点状物体的常规成像的光学显微镜的示意图；

图2为用于示出到检测器单元上点状物体的根据本发明的成像的相应于图1的光学显微 镜的示意图；

图3为根据图2的光学显微镜的检测器侧光束路径的示意图，这个示意图示出了倾斜地 使聚焦光分布转变角度的产生；

图4为示出用于不同聚焦状态的两个检测器单元的根据本发明的用途的示意图；以及

图5为示出在用于不同聚焦状态的两个检测器单元上的两个聚焦光分布和由这两个聚 焦光分布产生的光斑的示意图。

附图标记列表

10光学显微镜

12记录透镜

14、16点状物体

18样本

20、22光线束

26、26’筒内透镜

27、27’检测面

28、28’检测器单元

30、32图像帧的区域

34像空间

36检测轴

40、40’、42、42’聚焦光分布

44入射光孔

50分束器

52、52’部分的光线束

54、54’光斑

O1光轴

具体实施方式

在图2至图4中示出了能够根据本发明进行点状物体的三维定位的宽视场显微镜10。 在图2至图4的每个中仅示出了这些对于待阐明的相关主题的理解是必要的显微镜部件。

为了阐明根据本发明的定位原则，应首先将图2中所示的光学显微镜10与图1中所示 的显微镜进行比较，图1中所示的显微镜在很大程度上与根据图2的光学显微镜在设计上是 相同的，但是不根据本发明的方法运行。在图1和图2中，相同或相互对应的显微镜部件以 相同的附图标记表示。

根据图1的常规地操作的宽视场光学显微镜10包括记录透镜12，记录透镜12接收从 两个点状物体14和16发出的光。点状物体14和16为荧光分子，例如，在样本18中存在 的荧光分子。

以下将说明如何在样本18中对点状物体14和16进行定位。参考在图1中通过轴x，y， z所示的坐标系进行这种定位。特别地，打算在存在于由样本18所形成的物体空间且平行 于参考图1中所示的坐标系统的x-y平面设置的物体平面中确定点状物体14和16的横向x-y 位置。此外，将在垂直于上述物体平面的光轴O1的方向上确定各个点状物体14，16的轴 向z位置。

点状物体14发出的光被记录透镜12转化为光线束20。因此，记录透镜12从点状物体 16发出的光中形成平行光线束22。在图1中所示的示例中，假设点状物体14位于光轴O1 上，使得与物体14相关联的光线束20平行于光轴O1传播。另一方面，假设点状物体16 横向偏离于光轴O1，使得与物体16相关联的光线束22相对于光轴O1倾斜传播。

通过镜子24将两个光线束20和22反射到筒内透镜26上。筒内透镜26允许光线束20 和22均会聚到检测器单元28的检测面27上。以这种方式通过由透镜12和筒内透镜26所 组成的成像光学部件使两个点状物体14和16成像到检测器单元28的检测面27上。

再次在图1中以放大视图显示出了检测面27，以及会聚在检测面27的方向上的光线束 20和22，以清楚地显示根据样本18中点状物体14和16的空间位置将点状物体14和16成 像至三维像空间34的不同区域30和32。因此，在检测器单元28的检测面27中，形成点 状物体14和16的像，根据点状物体14和16在z方向上的空间位置，点状物体14和16的 像在较小程度或较大程度上被轴向地聚焦到检测面27上。为了简化说明，在此也在下文， 也在检测器侧，参考与样本18相关联的包括轴x，y，z的坐标系统。

由于在检测面27中光线束20和22的非锐聚焦，可能会推断点状物体14和16位于物 体平面之内或之外，检测面27与该物体平面光学地共轭。因为，在图1中所示的光学成像 的情况下，光线束20和22仍然垂直地撞击至检测面27上，即在垂直于检测面27设置的检 测轴36的方向上，所以不可能推断出点状物体14和16在z方向上位于与物体共轭的平面 之前或之后。如从根据图1的示意图可理解的，光线束20和22的散焦，即相对于检测面 27之前或之后的偏移对称地表现。

从以上说明，这导致在图1所示的成像的情况下，实际上在平行于x-y平面的物体平面 上横向的位置确定是可能的，然而，由于由光线束20和22产生的聚焦光分布在z方向上是 对称的，因此在z方向上的位置确定是不可能的。对于包括z方向上的确定的三维位置确定， 需要聚焦光分布的对称性被打破，可以说是，在下面参考根据图2的示例性实施例中进行阐 明。

根据图2的本发明的光学显微镜10基本上以与图1所示的显微镜相同的部件为特征。 然而需要指出的是，光学显微镜10不仅包括图2所示的检测器单元28，还包括在设计上基 本相同的其他检测器单元，例如如从以下进一步阐明的图4中获得的。因此，将根据图2的 示意图简化，以对比与根据图1的常规配置的差异。

图2中所示的方法的重要特征在于从点状物体14和16发出的光线束20和22在像空间 34中分别生成聚焦光分布40和42，聚焦光分布40和42相对于检测器单元28的检测轴36 倾斜地转变角度。如从根据图2的示意图可推论的，聚焦光分布40和42显示了相对于检测 轴36的路径，该路径的特征也在于斜线。在根据图2的示例性实施例中获得聚焦光分布40 和42的这种斜线形状，因为筒内透镜26从光轴O1横向偏移，通过镜子24使光轴O1朝向 筒内透镜26偏斜。由于筒内透镜26这种横向偏移，光线束40和42偏离中心地横过筒内透 镜26。

与图1中所显示的示图相比，通过光线束20可进行最好的识别，该光线束20从位于光 轴O1上的物体14发出，且平行于光轴O1传播。在图1所示的常规配置中，光线束20与 筒内透镜26的光轴轴向对称地被设置。在根据图2的方法中，光束20相对于筒内透镜26 的轴向对称性被打破了。这个实际情况再次在根据图3的示意图中示出。图3a)显示了如 何将光线束20通过筒内透镜26聚焦至检测面27上，而图3b)显示了在x-y平面中光线束 20发出的聚焦光分布40，且，图3c)显示了在x-y平面中筒内透镜26的入射光孔44的偏 离中心的欠照明。

如从图3c)可推论的，筒内透镜26的入射光孔44没有被光束20完全照明。而是，欠 照明被设置，使得光线束20仅通过入射光孔44的部分区域，入射光孔44的部分区域在x 方向上与入射光孔44的中部偏移。其结果是，聚焦光分布40的形状在像空间34中的x-z 平面中斜线地延伸，如图3b)所示。

如以上进一步说明的，在记录透镜12和筒内透镜26之间传播的两个光线束20和22形 成平行光束。然而，在这个成像光束路径的区域中，光线束20、22并不一定是平行的光束。 例如，同样地能想到的是，配置光学成像使得筒内透镜26的光孔平面是记录透镜12的光孔 平面的共轭面。

因此，在图2所示的配置中，筒内透镜26被以以上所描述的方式非对称地欠照明。为 此，筒内透镜26与光轴O1横向偏移。然而，为了实现筒内透镜26的非对称欠照明，光束 20和22自身的引导可同样地是偏移的。为此，专用的束引导部件，如倾斜镜子，例如可插 入到光束路径中。

在图2和图3中示出的筒内透镜26的非对称欠照明也仅作为示例来理解。然而，产生 图2和图3中所示的聚焦光分布40和42的斜线形状的其他措施也是可以想到的。示例性地 参考同样地能够生成希望的聚焦光分布的非球面透镜的使用和空间光调制器的使用。

如以上已经提及的，根据本发明的光学显微镜10不仅特征在于图2中所示的检测器单 元28，而且特征在于图4中用28’表示的另一检测器单元。因此，设置另一筒内透镜26’， 筒内透镜26’被分配给检测器单元28’。因此，筒内透镜26与记录透镜12一起形成第一成像 光学部件。因此，由记录透镜12和筒内透镜26’设置第二成像光学部件。

图4示例性地示出光线束20，光线束20被分束器50分离为第一部分光线束52和第二 部分光线束52’。第一部分光线束52通过筒内透镜26并接着产生聚焦光分布40。相应地， 第二部分光线束52’通过筒内透镜26并产生聚焦光分布40’。

图4a)和图4b)中示出两个不同的聚焦状态。因此，在图4a)中，人们可以看出聚焦光 分布40和40’在极大程度上分别被配置在各自检测面27和27’的下游。另一方面，在图4b) 所示的聚焦状态中，聚焦光分布40和40’在极大程度上分别被配置在各自检测面27和27’ 的上游。

图5a)示出在本示例性实施例中两个聚焦光分布40和40’在平行于x-z平面的剖视图中 被倾斜地定位。示出三个不同的聚焦状态，三个不同的聚焦状态在图5中由I、II、III表示， 且在每种情况下通过检测面27和27’相对于对应聚焦光分布40和40’的预定的空间位置而区 别。图5b)示出了光斑54和54’，光斑54和54’生成用于图5a)中所示的三个聚焦状态I、 II、III的聚焦光分布40和40’，在每种情况下分别在对应检测面27和27’中。光斑54和54’ 中的每个形成二维光分布，该二维光分布代表平行于x-y平面的通过各自的聚焦三维光分布 54和54’的平面横截面。

为了基于在检测面27和27’中产生的光斑54和54’确定点状物体14的横向x-y位置、 以及轴向z位置，将两个检测面27和27’的检测点(例如，CCD图像传感器的单独的图像 元件)建立相互成对的对应性，在两个检测面27和27’中光斑54和54’被记录。因此，检测 面27’的检测点唯一地被分配给检测面27的每个检测点。这样的检测点对应性基本上对应检 测面27和27’上产生的物体像的重叠。

图5a)中所示的三个聚焦状态I、II、III反映了点状物体14在样本12中的三个不同z 位置的特征。在图5所示的示例中，在聚焦状态I中的聚焦光分布40和40’在极大程度上位 于对应的检测面27和27’的后方。因此，光斑54和54’在对应检测面27和27’中在x方向 上被向下或向上移动。另一方面，在聚焦状态II中，聚焦光分布40和40’与它们各自的质 心一起直接位于对应的检测面27和27’中。因此，光斑54和54’位于对应检测面27和27’ 的中心。最后，在聚焦状态III中的聚焦光分布40和40’在很大程度上位于检测面27和27’ 的前部。因此，光斑54在检测面27中向上移动，且光斑54’在检测面27’中向下移动。

在本示例中，聚焦光分布40和40’的相反关系引起光斑54和54’在被分配给聚焦光分布 40和40’的检测面27和27’上沿x轴的相反指向的移动。例如，如果光斑54在检测面27沿 着x轴在负方向上(图5中向下)移动，如聚焦状态I中的情况，接着光斑54’在检测面27’ 沿着x轴在正方向上(图5中向上)移动。准确地，该相反在聚焦状态III中是真实的，然 而在聚焦状态II中，相反是为了说明在成像光学部件的分辨率极限的情况下在检测面27和 27’上点状物体14的最优的清晰成像，两个光斑54和54’位于各自检测面27和27’的中部。

为了在三维中定位点状物体14，首先确定两个光斑54和54’的质心位置。为了确定物 体14的横向x-y位置，接着确定光斑54和54’的质心位置的平均值。如从根据图5的示例 可推断的，两个光斑54和54’的质心位置的平均值对于所有三个聚焦状态I、II、III是相同 的。因此，这个平均值准确地对应检测面27和27’的中部(在最优的聚焦状态II中，该中 部已与两个光斑54和54’的质心位置重合)。因此，不仅在最优的聚焦状态II中准确地确定 横向x-y位置是可能的，而且在两个聚焦状态I和III中准确地确定横向x-y位置是可能的， 在两个聚焦状态I和III中检测面27和27’不准确地与物体平面光学共轭，待定位的物体位 于物体平面中。

接着基于两个光斑54和54’与其前面确定的共用的中心点的距离确定轴向z位置，该z 位置分享其中的中心点。这是指待定位的物体的z位置基于两个光斑54和54’的相对位置， 特别是相对的相互距离而被确定。如从根据图5的示意图可推断的，这个相对的相互距离对 于三个所示的聚焦状态I、II、III导致反映在三个聚焦状态下待定位的物体的不同的z位置 的不同的值。对于图5中所示的示例，在光学聚焦状态II中两个光斑54和54’之间的相对 距离理想地产生值0，而对于两个其他聚焦状态I和III，两个光斑54和54’之间的相对距离 产生的值可能就绝对值来说或多或少是相同的，但是就其运算符号来说可能是相互不同的。 无论如何，物体的z位置的唯一确定是可能的。

还需要指出的是，图2中所示的光学显微镜10特征在于用于评估以上所阐明的光斑54 和54’的评估单元60。这个评估单元60执行用于点状物体定位而提供的所有操作。因此， 例如，评估单元60进行以上描述的用于产生检测点对应性的像重叠，质心位置的确定，和 最后横向x-y位置以及轴向z位置的计算。

不言而喻的，以以上描述的方式对不仅一个单个物体定位，而且对多个物体同时定位。 在这方面仅需要指出的是，在检测面27和27’上产生的光斑是空间上相互分离的，光斑中的 每个由一个单个点状物体所引起。