一种布拉氏酵母菌表面展示系统及其构建方法

摘要

本发明涉及一种蛋白表面展示系统，具体提供了一种以布拉氏酵母菌为表面展示平台表达外源蛋白质的表面展示系统，本系统从布拉氏酵母菌，购自法国百科达制药厂，进口药品注册证号为s20040038，的DNA组中扩增得到AGA1基因以及AGA2基因，并以pPIC9AGA2质粒为模板扩增AGA2基因表达核,用布拉氏酵母菌的AGA2基因替换上述AGA2基因表达核中的AGA2基因。将获得的AGA1基因和替换后的AGA2基因表达核连接到基础质粒pSP上，分别在超表达启动子TEF1和PGK1控制之下，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表达质粒pSDSb。本发明能够持续表达和Aga2p融合的异源蛋白质并展示在布拉氏酵母菌地表面，从而超表达某些异源蛋白，将其作为病原活疫苗载体和研究蛋白与蛋白之间的相互作用具有其它微生物载体不可取代的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白表面展示系统，具体提供了一种能够表达展示异源蛋白质的布拉氏 酵母菌(Saccharomyces boulardii)表面展示系统及其构建方法。

背景技术

布拉氏酵母菌是法国科学家亨利(Henri Boulard)于1920从印尼荔枝等水果中分离的一 种非致病性酵母菌。自1982年Ducluzeau等首次发表布拉氏酵母菌作为益生菌的实验结果以 来,对布拉氏酵母菌的抗毒止泻、维持宿主胃肠道微生态平衡、提高机体非特异性免疫力的 临床试验和研究越来越多。布拉氏酵母菌现已被公认为最为有价值的益生菌之一，被世界许 多国家广泛应用于医学临床和畜牧业生产中。目前，布拉氏酵母菌作为微生态制剂在欧美等 广泛用于防治儿童和旅行者的各种腹泻如梭状芽孢杆菌、霍乱弧菌、轮状病毒等感染和抗生 素引起的肠炎所致的腹泻。其制剂应用于畜牧业，可有效降低病原菌和有关毒素的浓度，增 强非特异性免疫功能，提高生产性能。作为饲料添加剂的应用已得到包括中国、欧盟在内的 世界许多国家的认可。随着人们对健康和生态环境的高度重视及在畜禽养殖中的进一步研究， 布拉氏酵母菌在医学和畜牧业中必将有更广阔的应用前景。

然而，对于布拉氏酵母菌的研究，一直以来主要集中在临床应用方面，而针对布拉氏酵 母菌的作用机制，特别是在分子水平上的作用机制，以及对布拉氏酵母菌的遗传改造等却少 有研究和报导。究其原因，主要是因为目前尚没有一整套有效的适用于布拉氏酵母菌的分子 遗传学技术操作体系。虽然最近的一系列研究表明，布拉氏酵母菌是酿酒酵母的变异株或亚 种，然而布拉氏酵母菌也有作一些完全不同于酿酒酵母的生物学、生理学、代谢及遗传学特 性，如不能利用半乳糖作为碳源、第9染色体为3倍体、对低pH和温度有较高的耐受性、氮 缺乏时可在一定程度上转化成假丝等，特别是布拉氏酵母菌是野生的菌株、双倍体、无营养 缺陷型且不能孢子化。因此，适用于酿酒酵母的技术体系和方法无法直接应用于布拉氏酵母 菌。这直接限制了对布拉氏酵母菌进行分子生物学、遗传学等方面全面深入的研究，以至于 对布拉氏酵母菌从基因水平上进行遗传改的设想，由于缺乏有效的分子遗传学技术操作体系 而无法实现。

与噬菌体和细菌表面展示相比，酵母菌表面展示系统具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠 与高等真核动物类似，更利于高效表达具有生物活性的复杂蛋白。此技术已成功应用于筛选 特异配体、绘制抗原表位图谱，生产活菌体疫苗、全细胞催化剂，和蛋白的定向进化等。作 为益生菌，布拉氏酵母菌的表面展示系统在国内外尚未见任何的研究和报导。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种以布拉氏酵母菌为表面展示平台 表达外源蛋白质的表面展示系统，本系统从布拉氏酵母菌，购自法国百科达制药厂，进口药 品注册证号为s20040038，的DNA组中扩增得到AGA1基因以及AGA2基因，并以pPIC9AGA2 质粒为模板扩增AGA2基因表达核,用布拉氏酵母菌的AGA2基因替换AGA2基因表达核的AGA2 基因。将获得的AGA1基因和替换后的AGA2基因表达核连接到基础质粒pSP上，分别在超表 达启动子TEF1和PGK1控制之下，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表 达质粒pSDSb。本发明能够持续表达和该通用质粒pSDSb的Aga2p的C端融合的异源蛋白质 并展示在布拉氏酵母菌的表面，从而超表达某些异源蛋白，将其作为病原活疫苗载体和研究 蛋白与蛋白之间的相互作用具有其它微生物载体不可取代的作用。

本发明所提供的系统以pSP为基础质粒构建布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒，将 AGA1基因的，其基因序列如Seq ID No:8所示，AGA2基因表达核，其基因序列如Seq ID No:10 所示，克隆到基础质粒pSP上，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表达 质粒pSDSb。异源蛋白与该通用质粒的Aga2p的C端融合从而表面展示在布拉氏酵母菌细胞 壁上。

上述的表达质粒pSDSb转化布拉氏酵母菌后，质粒中的Aga1p（AGA1基因表达的蛋白） 通过GPI锚定在细胞壁上，Aga2p（替换后的AGA2基因表达核表达的蛋白）的N端通过两个 二硫键与Aga1p连接，异源蛋白通过与Aga2p的C端融合从而表达展示在布拉氏酵母菌细胞 壁上。

发明人的具体方法是：将根据引物扩增获得的布拉氏酵母菌AGA1基因，其基因序列如 Seq ID No:8所示，和AGA2基因,其基因序列如Seq ID No:9所示，并以该AGA2基因替换 AGA2基因表达核的AGA2基因。将获得的AGA1基因和替换后的AGA2基因表达核，其基因序 列如Seq ID No:10所示，克隆到基础质粒pSP上，分别在超表达启动子TEF1和PGK1控制之 下，由此得到布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒pSDSb，质粒中的Aga1p（AGA1基因表达 的蛋白）通过GPI锚定在细胞壁上，Aga2p（替换后的AGA2基因表达核表达的蛋白）的N端 通过两个二硫键与Aga1p连接。异源蛋白通过与Aga2p的C端融合从而表达展示在布拉氏酵 母菌细胞壁上。

本发明中将用来鉴定系统可用性的EGFP蛋白与Aga2p的C端融合，进行单克隆筛选鉴 定，获得阳性重组质粒，将阳性重组质粒转化到布拉氏酵母菌中，诱导表达蛋白质。

本发明使用的EGFP是绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,简称GFP)增强型变异 蛋白。GFP是一种在美国西北海岸所盛产的水母中发现的特殊蛋白质。GFP能在细胞中标定特 定融合蛋白的位置及存在，使用GFP进行此类研究，在试验之前不需要进行固定或破坏，能 在几乎不影响细胞的正常生理作用下进行即时的观察及分析。由于GFP荧光是生物细胞的自 主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用到分子生物学试验 的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。而本发明所应用的EGFP是 GFP的增强型变异蛋白，它的全称是Enhanced Green Fluorescent Protein，其荧光比野生 型强35倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点，更适用于细胞基因表达和蛋白 定位检测及细胞示踪标记。

本发明的具体操作方法是：

首先根据酿酒酵母中AGA1基因和AGA2基因的序列、AGA2基因表达核序列以及EGFP基 因的序列，分别设计合成了基因的一对特异引物，序列分别为：

AGA1-F：TTGCGGCCGCATGACATTATCTTTCGCTC，其基因序列如Seq ID No:1所示；

AGA1-R：GGAGATCTTTAACTGAAAATTACATTG，其基因序列如Seq ID No:2所示；

AGA2-F：TGGATCCATGCAGTTACTTCGCTGTT，其基因序列如Seq ID No:3所示；

AGA2-R：CCCAAGCTTAAAAACATACTGTGTG，其基因序列如Seq ID No:4所示；

AGA2-R′:TGTCGACTCAATGGTGATGGTGATGATG,其基因序列如Seq ID No:5所示

EGFP-F：CCCTCGAGCCATGTCTAAAGGTGAAG，其基因序列如Seq ID No:6所示；

EGFP-R：TTGGGCCCTTTGTACAATTCATCCATAC，其基因序列如Seq ID No:7所示；

之所以采用这种方法，主要是由于现有技术中没有布拉氏酵母菌AGA1基因和AGA2基因 的基因序列的相关研究，因此发明人借用了酿酒酵母中AGA1基因(Gene Bank中的编号为 NM_001183221)和AGA2基因(Gene Bank中的编号为NM_001180897)的序列以及EGFP基因的序 列，以其获得最佳的研究效果。

之后通过布拉氏酵母菌（购自法国百科达制药厂，进口药品注册证号为s20040038）在 YPD培养基上划线培养得到单菌落，随机选择一个单菌落挑出，在30℃、225rpm的生长条件 下，用YPD培养液过夜培养得到布拉氏酵母菌菌液，用酵母基因组提取试剂盒提取布拉氏酵 母菌的基因组DNA；

通过采用常规PCR方法以及上述获得的相应基因的上下游引物扩增目的基因，之后通过 核酸胶回收试剂盒回收上述的目的基因；

由于布拉氏酵母菌本身没有营养缺陷型的遗传标记可以利用，只能筛选可用的抗生素作 为筛选遗传标记。本发明的发明人通过一系列试验证实其对遗传霉素敏感，因此用遗传霉素 （G418)作为选择性遗传标记。具体实施方法如下：

分别将抗遗传霉素基因kanMX和基础质粒pSP进行NdeI/StuI双酶切（酶切方法参照现 有技术），将基础质粒pSP原有的营养缺陷型URA3基因切除，胶回收纯化kanMX基因片段和 基础质粒pSP酶切产物，于22℃连接2h。连接体系为：kanMX基因片段6μl，基础质粒pSP1μl T4DNA Ligase1μl，T4Liga se buffer1μl，PEG40001μl。将连接产物转化TOP10感受态细 胞，用G418抗性的培养基平板筛选。挑取培养板上生长良好的转化菌落，LB培养液扩大培 养后用质粒提取试剂盒提取质粒，并用NdeI/StuI酶双酶切进一步鉴定质粒的正确性，酶切 条带应该是1455bp和6828bp两条带，说明kanMX基因已经成功克隆到基础质粒pSP上，得 到重组质粒pSP-kanM,使得基础质粒pSP具有遗传霉素抗性，酶切结果可见说明书附图3。

此步是为了将基础质粒pSP的筛选标记换成遗传霉素（G418），由于布拉氏酵母菌对遗 传霉素敏感，将带有遗传霉素抗性的质粒转化布拉氏酵母菌后，有助于筛选阳性重组子。

根据分子克隆试验指南，分别将AGA1基因、替换后的AGA2基因表达核克隆到重组质粒 pSP-kanM上，由此得到布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒pSDSb。将EGFP基因克隆到通用 表达质粒pSDSb的AGA2基因表达核内的多克隆位点处，构建阳性重组质粒pSDSb-GFP。

将构建好的阳性重组质粒pSDSb-GFP以及空载体pSDSb转化到布拉氏酵母菌中，将转化 产物置于含G418抗性的YPD培养板上30℃培养48h。待培养板上长出单菌落后用酵母基因组 试剂盒提取DNA，通过常规PCR方法鉴定出阳性单克隆，将阳性单克隆用YPD培养液在30 ℃,220rpm的条件下诱导培养。通过荧光显微镜观察EGFP的发光情况。根据EGFP能够在布 拉氏酵母菌细胞表面发光而转化空载体的布拉氏酵母菌细胞表面无荧光即可证实本系统的正 确性。

经过上述的方法，本发明最终获得了以布拉氏酵母菌为表面展示平台表达异源蛋白质的 表面展示系统，通过该系统可以超表达某些异源蛋白，将其作为病原活疫苗载体和研究蛋白 与蛋白之间的相互作用具有其它微生物载体不可取代的作用。且作为益生菌，布拉氏酵母菌 的表面展示系统，除具备酿酒酵母的优点和作用外，还具有以下特殊意义：

1）用作病原活疫苗载体具有其它微生物活疫苗载体不可替代的作用：

布拉氏酵母菌为益生菌，不仅无致病性，还可提高机体非特异性免疫力，提高动物的饲 料利用率。因此，以布拉氏酵母菌的表面展示系统作为疫苗载体，在刺激宿主产生免疫力的 同时，又可提高动物的生产性能，为其他类型疫苗所不具备。另外，布拉氏酵母菌是真核生 物，能正确进行各种翻译后加工,包括肽链剪切和糖基化等，与高等真核生物类似，用作较高 等生物病原如寄生虫等的疫苗载体是其它微生物载体不可替代的，具有极高的研究价值和广 阔的应用前景。

2）利用表面表达系统，表达或超表达某些有益基因，改善其益生特性，如提高非特异 性免疫刺激能力，提高对宿主细胞的吸附能力，提高定植或延长滞留时间等。

附图说明

图1为本发明所述酵母表面展示系统示意图；

图2为AGA1基因、AGA2基因表达核以及EGFP基因PCR扩增产物电泳图；

图中1为AGA1基因,2为AGA2基因表达核，3为DNA分子量标准，4为EGFP基因，5为 DNA分子量标准；

图3为pSP+kanM用NdeI/StuI酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定示意图:

图中1为酶切产物，M为DNA分子量标准

图4为AGA1+pSP+kanM用NotI/BglII酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定示意图：，

图中1为酶切产物，M为DNA分子量标准；

图5为pSDSb-GFP用BamHI/SalI酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定示意图：

图中1为酶切产物，M为DNA分子量标准；

图6为EGFP在布拉氏酵母菌表面展示图：A图为EGFP在布拉氏酵母菌表面展示荧光灰 度图，B为相应的白光图；

图7为EtMIC2在布拉氏酵母菌表面展示图：A图为EtMIC2在布拉氏酵母菌表面展示荧 光灰度图，B为相应的白光图。

具体实施方式

下述实施例中采用的限制性核酸内切酶与DNA连接酶购自Fermentas。Easy Tag酶、质 粒提取试剂盒、DNA Marker均购自全式金。细菌培养酵母培养物、胰蛋白胨均购自OXOID。 蛋白胨为Bacto^TMPeptone。PrimeStar酶购自Takara。酵母基因组提取试剂盒购自BIOMIGA。 核酸胶回收试剂盒购自康为世纪。布拉氏酵母菌，购自法国百科达制药厂，进口药品注册证 号为s20040038；其他未提及的技术均采用现有技术。

实施例1设计引物：

参照酿酒酵母表示展示系统的技术，根据酿酒酵母中AGA1基因(Gene Bank中的编号为 NM_001183221)、AGA2基因(Gene Bank中的编号为NM_001180897)的序列、AGA2基因表达核 的序列以及EGFP基因的序列，分别设计合成了基因的一对特异引物，序列分别为：

AGA1-F：TTGCGGCCGCATGACATTATCTTTCGCTC，其基因序列如Seq ID No:1所示；

AGA1-R：GGAGATCTTTAACTGAAAATTACATTG，其基因序列如Seq ID No:2所示；

AGA2-F：TGGATCCATGCAGTTACTTCGCTGTT，其基因序列如Seq ID No:3所示；

AGA2-R：CCCAAGCTTAAAAACATACTGTGTG，其基因序列如Seq ID No:4所示；

AGA2-R′:TGTCGACTCAATGGTGATGGTGATGATG,其基因序列如Seq ID No:5所示；

EGFP-F：CCCTCGAGCCATGTCTAAAGGTGAAG，其基因序列如Seq ID No:6所示；

EGFP-R：TTGGGCCCTTTGTACAATTCATCCATAC，其基因序列如Seq ID No:7所示。

实施例2酵母菌DNA的提取：

通过布拉氏酵母菌在YPD培养基上划线培养得到单菌落，随机选择一个单菌落挑出，在 30℃、225rpm的生长条件下，用YPD培养液过夜培养得到布拉氏酵母菌菌液，按照酵母基因 组提取试剂盒（购自BIOMIGA）说明书步骤提取布拉氏酵母菌的基因组DNA。

实施例3重组质粒pSP+kanM的获得：

分别将抗遗传霉素基因kanMX和基础质粒pSP进行NdeI/StuI双酶切（酶切方法参照现 有技术），将基础质粒pSP原有的营养缺陷型URA3基因切除，胶回收纯化kanMX基因片段和 基础质粒pSP酶切产物，于22℃连接2h。连接体系为：kanMX基因片段6μl，基础质粒pSP1μl， T4DNA Ligase1μl，T4Ligase buffer1μl，PEG40001μl。将连接产物转化TOP10感受态细 胞，用G418抗性的培养基平板筛选。挑取培养板上生长良好的转化菌落，LB培养液扩大培 养后用质粒提取试剂盒提取质粒，并用NdeI/StuI酶双酶切进一步鉴定质粒的正确性，酶切 条带应该是1455bp和6828bp两条带，说明kanMX基因已经成功克隆到基础质粒pSP上，得 到重组质粒pSP-kanM,使得基础质粒pSP具有遗传霉素抗性，酶切结果可见说明书附图3。

实施例4

采用常规PCR方法扩增目的基因，具体操作如下：

AGA1基因的PCR反应体系：5×PrimeSTAR Buffer20μl，2.5mmol/μl dNTP8μl，上、下 游引物AGA1-F和AGA1-R（20μmol/μl）各1μl，PrimeSTAR DNA聚合酶（2.5U/μl）1μl，布拉 氏酵母菌DNA1μl，加入灭菌去离子水至100μl；将100μl反应液混匀后，于PCR仪上进行扩 增，循环参数为：98℃10s，56℃15s，72℃2min30s，33个循环后，72℃后延伸7min； 扩增完成后，于0.8％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

AGA2基因的PCR反应体系：5×PrimeSTAR Buffer20μl，2.5mmol/μl dNTP8μl，上、下 游引物AGA2-F和AGA2-R（20μmol/μl）各1μl，PrimeSTAR DNA聚合酶（2.5U/μl）1μl，布拉 氏酵母菌DNA1μl，加入灭菌去离子水至100μl；将100μl反应液混匀后，于PCR仪上进行扩 增，循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃2min30s，33个循环后，72℃后延伸7min； 扩增完成后，于0.8％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

AGA2基因表达核的PCR反应体系：5×Pr imeSTAR Buffer20μl，2.5mmol/μl dNTP8μl， 上、下游引物AGA2-F和AGA2-R'（20μmol/μl）各1μl，PrimeSTAR DNA聚合酶（2.5U/μl）1μl 布拉氏酵母菌DNA1μl，加入灭菌去离子水至100μl；将100μl反应液混匀后，于PCR仪上进 行扩增，循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃2min30s，33个循环后，72℃后延伸7min； 扩增完成后，于0.8％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

EGFP基因的PCR反应体系：5×PrimeSTAR Buffer20μl，2.5mmol/μl dNTP8μl，上、下 游引物EGFP-F和EGFP-R（20μmol/μl）各1μl，PrimeSTAR DNA聚合酶（2.5U/μl）1μl，布拉 氏酵母菌DNA1μl，加入灭菌去离子水至100μl；将100μl反应液混匀后，于PCR仪上进行扩 增，循环参数为：98℃10s，58℃15s，72℃2min30s，33个循环后，72℃后延伸7min； 扩增完成后，于0.8％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

将胶回收纯化后的AGA1基因（其基因序列如Seq ID No:8所示）、AGA2基因（其基因序 列如Seq ID No:9所示）送生工生物工程有限公司测序，利用DNA Star软件分析发现：布拉 氏酵母菌的AGA1基因在598处缺失21个碱基，分别是cca agc tct aca tct acc tca，对 应的氨基酸序列是PSSTSTS。核苷酸序列中碱基突变有51处，却只有19个氨基酸发生了改 变，说明大部分突变都是无义突变，并没有改变氨基酸的类型。对二者同源性分析发现，二 者核苷酸同源性为97.6％，推导的氨基酸同源性为97.5％。

而AGA2基因同源性为100％。

实施例5

I)将AGA1基因、重组质粒pSP+kanM进行Not I/Bgl II双酶切，胶回收纯化AGA1基因 和重组质粒pSP+kanM酶切产物，于22℃连接2h。连接体系为：AGA1基因片段6μl，重组质 粒pSP+kanM1μl，T4连接酶1μl，T4Ligase buffer1μl，PEG40001μl。将连接产物转化TOP10 感受态细胞，用G418抗性的培养基平板筛选。挑取生长良好的转化菌落，LB培养液扩大培 养后用质粒提取试剂盒提质粒，并用Not I/BglII酶双酶切鉴定，酶切条带应该是2161bp 和8241bp两条带，得到重组质粒pSP+kanM+AGA1。酶切结果可见说明书附图4。

II)钝化XhoI酶切位点：将重组质粒pSP+kanM+AGA1用XhoI酶单酶切过夜，胶回收纯化 酶切产物，得到35μl酶切产物，在此产物中加入PrimeSTAR Buffer10μl，dNTP4μl,Pr ime STAR聚合酶1μl混匀后放72℃反应30min，反应完成后胶回收纯化反应产物，取7μl产物进 行连接反应。

连接反应如下：回收产物7μl，T4连接酶1μl，T4Ligase buffer1μl，PEG40001μl，于 22℃反应2h。将连接产物转化TOP10感受态细胞，用G418抗性的培养基平板筛选。挑取生 长良好的转化菌落，LB培养液扩大培养后用质粒提取试剂盒提质粒，用XhoI酶单切鉴定。

III)将扩增的AGA2基因表达核与克隆载体pJET1.2连接，于22℃连接2h。连接体系为： AGA2基因表达核6μl，克隆载体pJET1.21μl，T4连接酶1μl，T4Ligase buffer1μl，PEG4000 1μl。将连接产物转化TOP10感受态细胞，用氨苄霉素抗性的培养基平板筛选。挑取生长良好 的转化菌落，LB培养液扩大培养后用质粒提取试剂盒提质粒，并用BamHI/SalI酶双酶切鉴 定，得到重组质粒AGA2L+pJET1.2。

将AGA2基因、重组质粒AGA2L+pJET1.2用BamHI/HindIII双酶切，胶回收纯化AGA2基 因和重组质粒AGA2L+pJET1.2酶切产物，于22℃连接2h。连接体系为：AGA2基因6μl，重 组质粒AGA2L+pJET1.21μl，T4连接酶1μl，T4Ligase buffer1μl，PEG40001μl。将连接 产物转化TOP10感受态细胞，用氨苄霉素抗性的培养基平板筛选。挑取生长良好的转化菌落， LB培养液扩大培养后用质粒提取试剂盒提质粒，并用BamHI/HindIII酶双酶切鉴定，构建新 的AGA2基因表达核，其基因序列如Seq ID No:10所示，此片段中的AGA2基因来源于布拉 氏酵母菌。

IV)将新的AGA2基因表达核、钝化XhoI位点的重组质粒pSP+kanM+AGA1进行BamHI/SalI 双酶切，胶回收纯化AGA2基因表达核和重组质粒pSP+kanM+AGA1酶切产物，于22℃连接2h。 连接体系为：AGA2基因表达核6μl，表达载体pSP+kanM+AGA11μl，T4连接酶1μl，T4Ligase buffer1μl，PEG40001μl。将连接产物转化TOP10感受态细胞，用G418抗性的培养基平板筛 选。挑取生长良好的转化菌落，LB培养液扩大培养后用质粒提取试剂盒提质粒，并用BamHI/ SalI酶双酶切鉴定，得到布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒pSDSb。

V)将通用表达质粒pSDSb和EGFP基因用XhoI／ApaI酶双酶切过夜，胶回收纯化表达质粒 pSDSb和EGFP基因酶切产物，于22℃连接2h。连接体系为：EGFP基因6μl，表达质粒pSDSb1 μl，T4连接酶1μl，T4Ligase buffer1μl，PEG40001μl。将连接产物转化TOP10感受态细 胞，用G418抗性的培养基平板筛选。挑取生长良好的转化菌落，LB培养液扩大培养后用质 粒提取试剂盒提质粒，并用BamHI/SalI酶双酶切鉴定，酶切条带应该是1234bp和10368bp 两条带，酶切结果可见说明书附图5。

将上述构建好的阳性重组质粒pSDSb-EGFP以及空载体pSDSb转化到布拉氏酵母菌，用 G418抗性的YPD培养基平板筛选。挑取生长良好的转化菌落，用YPD培养液培养24h，然后 用酵母基因组试剂盒(BIOMIGA)提取DNA，以AGA2-F／AGA2-R′引物扩增AGA2+EGFP片段，鉴 定出阳性重组子。将阳性重组子用YPD培养液在30℃,220rpm的条件下培养，使EGFP基因表 达。每24h取10μl的样品，利用荧光显微镜观察EGFP表达效果。通过观察发现此系统能够 很好在布拉氏酵母菌细胞壁表面展示异源蛋白。

实施例6

为了增强本发明试验结果的准确性，我们亦将鸡球虫的EtMic2基因与AGA2基因表达核 内的多克隆位点融合，构建pSDSb-MIC2重组质粒。将此重组质粒转化布拉氏酵母菌，利用以 AGA2-F／AGA2-R′引物扩增AGA2+MIC2片段，鉴定出阳性重组子。将阳性重组子用YPD培养 液在30℃,220rpm的条件下培养，使EtMIC2蛋白表达。利用间接免疫荧光试验（IFA）观察 EtMIC2的表达情况。通过IFA证实本发明可成功地将异源蛋白质表达展示在布拉氏酵母菌表 面。