抗菌肽LZ1和该抗菌肽在制备抗菌药物中的用途

摘要

抗菌肽LZ1为人工设计合成的活性多肽，包含15个氨基酸残基，分子量为2228.77Da，等电点为12.05，其全序列为：缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-缬氨酸-NH2。抗菌肽LZ1分子量小，杀菌作用强，抗菌谱广，且基本不具备溶血活性和真核细胞毒性，是一个极具应用价值的小分子抗菌肽，加之其人工合成方便，能作为制备抗菌药的用途。

说明书

技术领域：

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及抗菌肽LZ1和该抗菌肽在制备 抗菌药物中的用途。

背景技术：

自从青霉素等抗生素被发现以来，针对细菌感染性疾病的治疗有了根本的改善，抗生素 的使用拯救了无数病人的生命，延长了人类的平均寿命。但随着抗生素的大规模使用或滥用， 尤其是在发展中国家，导致了一些抗药性的细菌的产生和扩散，其中包括一些毒力很强的致 病菌，像葡萄球菌与肺炎链球菌等。因此，寻找安全有效且不易产生耐药性质的抗菌药物成 为全世界科学家竞争和努力的方向。

抗菌肽是当生物受到微生物侵入后机体迅速产生的高效、广谱的抗菌肽类分子，来参与 机体的免疫反应。一般由12到100个氨基酸组成，大小从几kDa到十几kDa不等。抗菌 肽作为机体有效的防御分子是广泛存在的，目前已从微生物、植物、昆虫、节肢动物、两栖 动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出上千种抗菌肽。抗菌肽在合成机制、氨基酸组成和作用机 制等方面不同于传统的微生物(包括细菌、真菌和链霉菌等)产生的抗生素。抗菌肽不仅具 有广谱的抗菌活性，其在抗病毒、抗真菌、抗寄生虫以及抗肿瘤等方面也表现出较高的生物 活性。抗菌肽抗菌机理复杂，但大多数理论都认为其机制涉及到抗菌肽的阳离子性和疏水性 与带负电荷的微生物胞膜的作用，抗菌肽和细菌的细胞膜接触后，引起膜通透性改变，或在 细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，最后导致细菌内容物外泄而死亡。因此，抗菌肽在杀灭细菌 的速度上要远远高于传统的抗生素，且不像抗生素在低浓度下抑制细菌的生长，抗菌肽对细 菌的作用几乎都是致死性的。

抗菌肽的发现和快速发展为开发新型抗菌肽类抗菌药物提供了巨大的资源库，也为解决 临床耐药菌株的问题提供了极大的可能性，在医药卫生、农业生产、食品工业等领域都有广 泛的应用前景。随着人们对抗菌肽抗菌机理的进一步认识和新的抗菌肽的发现，人们不仅可 以从生物体内直接分离纯化得到抗菌肽，也可以利用基因工程手段重组得到抗菌肽，又可以 直接利用化学合成手段在短时间内合成大量小分子抗菌肽。

天然来源的抗菌肽部分会因为分子量较大存在免疫原性，抗菌活性低，对宿主细胞有细 胞毒作用，或会引起溶血等方面限制了抗菌肽作为抗菌药物的推广应用，因此，寻找分子量 更小，抗菌活性更强，尤其是不能存在溶血或细胞毒作用的抗菌肽才是解决抗菌肽作为抗菌 药物推广的最关键的因素。近几年来，科学家们在寻找新型抗菌肽的同时也开始致力于对原 有的天然抗菌肽进行结构改造或重新设计，比方说更换某些氨基酸残基或根据需要直接设计 抗菌肽氨基酸的一级结构，以期获得活性更高、更有针对性同时对宿主细胞无毒害作用的抗 菌肽。

对抗菌肽的改造主要集中在Cecropins、Magainins、Defensins和cathelicidin家族, 尤以对Cecropin类抗菌肽的改造研究的最多,新型抗菌肽分子设计也大多以该类抗菌肽为基 础,该类抗菌肽的结构已很明确,其长度为33～39个氨基酸残基,分子量约为4kDa,肽链 N端富含亲水性氨基酸,特别是碱性氨基酸Lys、Arg等,C端富含疏水性氨基酸Leu、Ile、 Val等,C末端是酞胺化的。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的具有药用价值的抗菌肽LZ1。

本发明的另一目的在于提供上述抗菌肽在制备抗菌药物方面的用途。

抗菌肽LZ1，所述的抗菌肽LZ1为人工设计合成的活性多肽，包含15个氨基酸残基，分 子量为2228.77Da，等电点为12.05，其全序列为：缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-色氨酸-赖氨酸- 赖氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-缬氨酸-NH2。

优选地，所述的全序列的C-端酰胺化。

本发明中的抗菌肽在制备抗菌药中的用途。

本发明的有益效果在于:

本发明中的抗菌肽LZ1为人工合成，具有分子量小、人工合成方便，杀菌作用强、抗菌 谱广等优点，此外抗菌肽LZ1还具有极低溶血活性和真核细胞毒性的特点。

附图说明：

图1为二倍稀释法示意图。

图2抗菌肽LZ1的抗菌活性，其中LZ1 MIC：即抗菌肽LZ1的最小抑菌浓度，以上结果为三 次独立重复实验平均值。

图3抗菌肽LZ1溶血活性分析（人血），其中LZ1：抗菌肽LZ1；NC：生理盐水，其加样体 积与样品组相同；PC：Triton X-100，其加样体积与样品组相同，上述实验结果为三次独立实 验的平均值。

图4抗菌肽LZ1溶血活性分析（兔血），其中LZ1：抗菌肽LZ1；NC：生理盐水，其加样体 积与样品组相同；PC：Triton X-100，其加样体积与样品组相同。上述实验结果为三次独立实 验的平均值。

图5抗菌肽LZ1细胞毒性分析（胚胎肾细胞HEK），LZ1：抗菌肽LZ1；对照：生理盐水， 其加样体积与样品组相同；上述实验结果为三次独立实验的平均值。,

具体实施方式：

下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发 明。

实施例1：抗菌肽LZ1的制备

Ⅰ、抗菌肽LZ1的化学合成方法：根据发明内容中所述的氨基酸序列，用自动多肽合成仪 (433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。

Ⅲ、纯化的抗菌肽LZ1用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助 激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪 测定氨基酸序列结构。

抗菌肽LZ1一共包含15个氨基酸残基，分子量为2228.77Da，等电点为12.05。LZ1抗 菌肽的全序列如下：缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸- 赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-缬氨酸-NH2(C-端酰胺化)。

实施例二：抗菌肽LZ1的抗菌实验：

最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)：为检测不到细菌生长的最低样品浓 度。采用二倍稀释法，如图1，具体方法如下：

细菌接种于Luria-Bertani（LB）固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后， 用接种环挑取单菌落转接到LB液体培养基中，37℃培养箱震荡培养至对数生长期。在紫外 分光光度计上检测菌液OD600，根据1OD600=1×10⁹CFU/ml将菌液用液体LB培养基稀释 至2×10⁵CFU/ml。在无菌96孔板各孔中预先加入100μl LB液体培养基，然后在第一孔中 加入100μl稀释到一定浓度的经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的抗菌肽样品，混匀后取100μl 加入第2孔，依次倍比稀释，从第12孔吸出100μl弃去，至此二倍浓度梯度样品即制备好。

向各孔中加入已稀释好的菌液100μl，混匀后于37℃缓慢震荡培养16h，测定600nm处 的光吸收值。结果计算：取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔样品浓度之 和的平均值作为样品最小抑菌浓度。

此外，痤疮丙酸杆菌为厌氧菌，培养使用的培养基为脑心浸液培养基（brain heart infusion  BHI），其他条件类似。

结果如图2所示。

由图2可知，抗菌肽LZ1对所受试菌种有非常强的杀伤作用，如对葡萄球菌包括临床上 分离的耐药菌株的MIC值最低可达1.17μg/ml，最高也才4.7μg/ml的低浓度，说明抗菌肽LZ1 在极低浓度下就可抑制葡萄球菌的生长。同时，抗菌肽LZ1对几株包括临床上分离的白色念 球菌也有很好的杀菌效果，最低浓度可达到1.17μg/ml的浓度。另外，抗菌肽LZ1对两株痤 疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度甚至达到了0.6μg/ml，说明抗菌肽LZ1对革兰氏阳性的杆菌效果 尤其显著。

实施例三：抗菌肽LZ1的溶血活性实验：

兔心脏采血或人静脉采血，将所采集血液与阿氏液（Alsever Solution，8.0g柠檬酸钠， 0.55g柠檬酸，20.5g glucose，4.2g NaCl，加去离子水至1L，调pH至6.1，高压灭菌后4 ℃保存）按1:1比例混合置于离心管中，1000rpm离心5min，生理盐水洗涤至上清液不再呈 红色为止。将上述洗涤好的红细胞加生理盐水稀释成10⁷-10⁸浓度的悬浮液。上述稀释好的红 细胞悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品37℃保温30min，再于1000rpm离心5min， 上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100。溶血活性 与540nm吸收值成正比。

结果如图3、图4所示。

由图3、图4可知，抗菌肽LZ1即使在320μg/ml的高浓度下也不会引起人血和兔血发生 溶血现象。

实施例四：抗菌肽LZ1的细胞毒实验：

人正常细胞胚胎肾细胞HEK 293于含有10％胎牛血清及双抗（青霉素和链霉素各100 U/ml）的DMEM培养基培养至对数期，细胞用PBS（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO₄·H₂O 1.56g， KH₂PO₄ 0.20g，加去离子水至1000ml，调PH值至7.2）洗三遍后，用0.25％的胰蛋白酶消化 下来，用新鲜DMEM培养基悬浮细胞，调整细胞密度至1*10⁶个/ml，以每孔200μl的体积铺 96孔板，等细胞贴壁后，加不同浓度的样品，在37℃，5%的二氧化碳条件下共培养24小时， 培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液（用细胞培养PBS缓冲液配 制），继续培养4h，用移液枪吸出孔中液体，每孔加入100μl DMSO，室温下轻摇10分钟， 用酶标仪检测490nm波长的光吸收。

结果如图5所示。

由图5可知，即使在200μg/ml的浓度下抗菌肽LZ1对人正常细胞胚胎肾细胞HEK 293 存在很低的约10%的细胞毒作用。