烟用卷烟烟丝中四种色素含量的测定方法

摘要

一种卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）含量的测定方法，包括样品溶液的制备，液相色谱分析及测定结果的计算等步骤。经优化之后的检测方法具有检测时间短、操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好等优点，本发明方法的色谱条件使柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.02~0.03μg/g之间，平均回收率分别为102.47％、92.48％、89.94%和96.66％，样品测试结果的平均相对标准偏差分别为3.18%、2.63％、2.74%和3.02％，说明本法的回收率较高，重复性较好。本发明为卷烟的质量监督提供了科学的依据。

说明书

技术领域

本发明属于烟用辅料的理化检验技术领域,具体涉及烟用卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）含量的测定方法。

背景技术

苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄等人工合成色素是以苯、甲苯、萘等化工产品为原料经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列较复杂的工艺过程合成的，故具有一定的毒性，但因其成本低，色泽鲜艳，着色力强，被广泛使用。但是大量的研究报告指出，几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质，某些合成色素甚至会危害人体健康，导致生育力下降、畸胎等等，有些合成色素在人体内可能转换成致癌物质。合成色素的危害包括一般毒性、致泻性、致突性（基因突变）与致癌作用。研究结果表明，小儿经常服用人工添加剂的食品容易引起一些危害。

世界各国尤其是西方发达国家不仅在色素对人体健康影响方面做了大量调查和研究，而且在食用色素的管理、合成色素的使用方面均有严格的规定，多种合成色素已被禁止或严格限量使用。 

大部分国家严格地限制某些色素，特别是偶氮类色素在食品中的使用。经过多年的努力，现在可以合法使用的食用合成色素品种已经大为减少。在世界各国使用合成色素最多时，品种多达100余种，日本曾批准使用的合成色素有27种，现已禁止使用其中的16种。美国1960年允许使用的合成色素有35种，现仅剩下7种。瑞典、芬兰、挪威、印度、丹麦、法国等早已禁止使用偶氮类色素，其中挪威等一些国家还完全禁止使用任何化学合成色素。此外还有一些国家已禁止在肉类、鱼类及其加工品、水果及其制品、调味品、婴儿食品、糕点等食品中添加合成色素。 

我国对在食品中添加合成色素也有严格的限制：凡是肉类及其加工品、鱼类及其加工品、醋、酱油、腐乳等调味品、水果及其制品、乳类及乳制品、婴儿食品、饼干、糕点都不能使用人工合成色素。只有汽水、冷饮食品、糖果、配制酒和果汁露可以少量使用，一般不得超过1／10000。 

人工合成色素的测定方法很多，如高效液相色谱法、毛细管电泳法、示波极谱法、分光光度法、薄层色谱法等，其中高效液相色谱法是最常用的测定方法，应用HPLC法测定合成混合色素准确度高，方法灵敏，重现性好，可以同时测定几种混合色素。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况、旨在克服现有技术缺陷，提供一种卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）含量的测定方法，本发明考察研究了卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）的萃取条件，优化了色谱分离的条件，为简便、快速有效的测定卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）残留的含量提供了技术支持，为卷烟的质量监督提供科学的依据。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

卷烟烟丝中四种色素柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）标准溶液的配制：分别配制具有浓度梯度的柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄的混合标准工作溶液（即四种物质混在一起配制成系列浓度的标准溶液）；

所述标准溶液的配制方法如下：称取四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）各25mg（精确至0.1mg）,用高纯水溶解转移至50mL容量瓶中，定容至刻度并摇匀，作为一级母液；取一级母液1mL至50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，作为二级母液；分别准确移取10μL,50μL,100μL,200μL,500μL,1000μL的二级母液至10mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到系列标准工作溶液。

（2）内标溶液配制：称取亮蓝标准品，用高纯水溶解，得到浓度为10μg/mL的亮蓝标准溶液，作为内标物质；

内标溶液的具体配制方法是：称取10mg的亮蓝标准品，精确至0.1mg,于1000mL的容量瓶中，用高纯水溶解并定容，得到浓度为10μg/mL的亮蓝标准溶液，作为内标物质。

（3）样品溶液的制备：使用纯水作为萃取剂，然后过C-18固相萃取柱净化样品溶液；

所述样品溶液的制备方法是：称取2支卷烟的烟丝于50mL具塞锥形瓶中，准确加入超纯水30mL，内标液100μL，在振荡器上于150r/min振荡萃取30min；过滤掉烟丝，取5mL滤液过C-18固相萃取柱，收集滤液和洗脱液，作为色谱分析的样品溶液。

（4）液相色谱分析：利用液相色谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；

所述的色谱分析条件为色谱柱采用Agela Venusil MP C18 液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min；二级管阵列检测器检测波长：柠檬黄为430 nm, 苋菜红为520 nm，胭脂红为510 nm，日落黄482 nm；流动相：A是0.02mol/L乙酸铵，B是乙腈，采用梯度洗脱程序，即初始A是90％，B为10％，10min时A是30％，B是70％，13min时A是90％，B是10％，15min时A是50％，B是50％，总洗脱时间为15min。

（5）卷烟烟丝中四种色素柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄含量的计算。

具体计算方法如下：首先将标准物质配制成一定浓度的标准溶液，并加入50μL的内标液（10μg/mL的亮蓝标准溶液）混合后进样分析，以内标物的峰面积与目标物的峰面积的比值对其相应标准溶液浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；然后将样品溶液检出的目标物与检测出的内标物峰面积比值，代入标准工作曲线；即得到样品中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）的含量。

本发明的检测方法对样品的处理方法和色谱条件进行了优化，达到了以下效果：

（1）检测时间短：采用本发明测定卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）含量周期仅需要15分钟；

（2）本发明具有操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好的优点：本发明方法的色谱条件使卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.02～0.03μg/g之间，平均回收率分别为102.47％、92.48％、89.94%和96.66％，样品测试结果的平均相对标准偏差分别为3.18%、2.63％、2.74%和3.02％。

附图说明

图1为本发明的测定方法的流程图；

图2为卷烟烟丝中柠檬黄的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图3为卷烟烟丝中苋菜红的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图4为卷烟烟丝中胭脂红的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图5为卷烟烟丝中日落黄的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图6为标准溶液430nm处柠檬黄色谱图；

图7为标准溶液520nm处苋菜红色谱图；

图8为标准溶液510nm处胭脂红色谱图；

图9为标准溶液482nm处日落黄色谱图；

图10为标准溶液630nm处内标物色谱图；

图11为样品溶液430nm处柠檬黄色谱图；

图12为样品溶液520nm处苋菜红色谱图；

图13为样品溶液510nm处胭脂红色谱图；

图14为样品溶液482nm处日落黄色谱图；

图15为样品溶液630nm处内标物色谱图；

具体实施方式

本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述：

实施例1

本实施例对卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）含量的测定方法如下（所述检测方法的流程图如图1所示）

（1）标准溶液的配制：称取四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）各25mg（精确至0.1mg）,用超纯水溶解转移至50mL容量瓶中，定容至刻度并摇匀，作为一级母液；取一级母液1mL至50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，作为二级母液；分别准确移取10μL，50μL，100μL，200μL，500μL，1000μL的二级母液至10mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到系列标准工作溶液，保存于2℃-8℃，有效期1个月。

称取10mg左右的亮蓝标准品，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得到浓度为10μg/mL的亮蓝标准溶液液，作为内标物质。在保存于2℃-8℃，有效期1个月。

（2）样品溶液的制备：称取2支卷烟的烟丝于50mL具塞锥形瓶中，准确加入超纯水30mL，内标液100μL，在振荡器上于150r/min振荡萃取30min；过滤掉烟丝，取5mL滤液过C18固相萃取柱，收集滤液和洗脱液，于液相色谱仪上分析。

（3）色谱分析：所述的色谱分析条件为色谱柱采用Agela Venusil MP C18 液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min；二极管阵列检测器检测波长：柠檬黄为430 nm, 苋菜红为520 nm，胭脂红为510 nm，日落黄482 nm；流动相：A是0.02mol/L乙酸铵，B是乙腈，采用梯度洗脱程序，即初始A是90％，B为10％，10min时A是30％，B是70％，13min时A是90％，B是10％，15min时A是50％，B是50％，总洗脱时间为15min。标准溶液的色谱分析结果如图6-10所示；样品溶液的色谱分析结果如图11-15所示；

（4）卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）含量的计算：首先将标准物质配制成一定浓度的标准溶液，并加入一定浓度的内标液，混合后进样分析，以内标物的峰面积与目标物的峰面积的比值对其相应标准溶液浓度进行回归分析，得到标准工作曲线（参见图2-5）；然后将样品溶液检出的目标物与检测出的内标物峰面积比值，代入标准工作曲线；即得到样品中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）的含量。

然后将样品测得的检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中的四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）质量，由此计算卷烟中日落黄、柠檬黄、胭脂红和苋菜红的含量，计算公式如下:

式中：

m—每克烟丝中柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄的含量，单位为微克每克（μg/g）；

A—样品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄的质量（μg）；

n—称取样品的质量（g）。

由表1和附图4可知，所采用的色谱条件使四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.02－0.03μg/g之间。本实施例样品的柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄的含量分别为22.36μg/g、17.26μg/g、18.65μg/g和19.47μg/g。

实施例2

本实施例对本发明方法的重复性和加标回收率的检测方法如下

采用样品加标回收率试验，分别在样品中加入低中高三个不同浓度的标准溶液进行加标回收率试验，每个样品分别测定6次，色谱分析的条件同实施例1，根据分析结果计算本方法烟丝中柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄的加标回收率及加标后测定值的相对标准偏差，结果如表2所示：

由表2可以看出，在3个加标水平上，利用此方法检测卷烟烟丝中四种色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄）的平均回收率分别为102.47％、92.48％、89.94%和96.66％，样品测试结果的平均相对标准偏差分别为3.18%、2.63％、2.74%和3.02％，说明本法的回收率较高，重复性较好。