一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗

摘要

本发明涉及生物兽药技术领域，公开一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗。一种鸡艾美耳球虫多价多表位DNA疫苗，包含真核表达载体以及其中插入的T细胞表位集中的4个基因片段：序列为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基所示的NA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第319-645个碱基所示的TA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第652-984个碱基所示的LDH-2以及序列为SEQ ID NO.1的第991-1299个碱基所示的EMCDPK-1；以及序列为SEQ ID NO.1的第1309-1740个碱基所示的鸡白介素-2基因chIL-2。该疫苗在抗球虫感染中，不仅能够抵抗4种球虫的混合感染，而且具有良好的免疫保护效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生物兽药技术领域，涉及一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗。

背景技术

鸡球虫病是一种严重危害养鸡业生产发展的寄生原虫病，每年因此而导致的经济损失高达20亿英镑以 上。随着鸡球虫抗药性和药物残留问题的日趋严重，人们期待用更理想的方法代替抗球虫药的使用。然而 球虫活疫苗的成功研制和应用提供了一种可代替药物控制鸡球虫病的技术手段，但却存在成本高、难保存、 散毒及潜在的致病威胁等缺点。因此随着分子生物学和现代生物技术的发展，DNA疫苗以其独特的优势显 示出在未来畜禽疫病控制中的诱人前景，它与传统疫苗相比，具有成本低、稳定、便于贮藏和运输、安全 性高、在体内维持时间长、制备简单等优点。

国内外一些学者已经构建了一些鸡球虫DNA疫苗，但多集中在单价疫苗的研究上，关于多价DNA疫 苗的研究未见报道。能够感染鸡的球虫公认的有7种，危害较大的有4种，分别是柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和堆型艾美耳球虫(E.acervulina)， 在临床上，这4种球虫多为混合感染，给养鸡业带来了巨大的危害，因此，研制能够同时抵抗4种球虫混 合感染的多价DNA疫苗显得尤为重要。

同时随着分子生物学及免疫学技术的日益成熟，抗原分子表位的研究成了近年来新的发展趋势。研究 表明，T细胞免疫应答反应在抗球虫免疫应答中处于核心地位，因而选择鸡球虫能够编码集中的T细胞表位 的多种基因片段串联起来，将其构建成球虫多表位DNA疫苗，这样既增加了T细胞表位的浓度和密度，又增 强了重组抗原的反应范围。因此本试验诣在构建出抗球虫混合感染的多价多表位DNA疫苗。

IL-2是细胞介导免疫中的一种重要的细胞因子，具有广谱的免疫增强作用，它能促进CD4⁺T细胞和 CD8⁺T细胞的分化增殖，维持T细胞生长，促进NK细胞和B细胞功能。许多研究表明，IL-2与球虫基因 联合插入到DNA疫苗载体中所构建的免疫调节型DNA疫苗，产生的免疫保护效果要明显优于单独构建的 DNA疫苗。

本发明运用DNAstar软件，对E.tenella的TA4、5401、pEtK2和mic4抗原基因，E.necatrix的NA4 抗原基因，E.maxima的EMCDPK抗原基因和E.acervulina的LDH和3-1E抗原基因的抗原表位进行分析， 每个基因选取1到2段T细胞表位比较集中的序列进行动物保护试验，筛选出免疫保护效果最好的抗原T 细胞表位，并将这4种球虫的T细胞表位同时克隆到同一DNA疫苗载体pVAX1中，同时串联具有免疫调 节作用的chIL-2作为基因佐剂，构建出能够抵抗4种球虫混合感染的免疫调节型多价多表位DNA疫苗，并 进行免疫保护性试验，检测其对临床上危害最为严重的4种球虫的抵抗力，以期为该疫苗在临床上的应用 提供参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够预防多种鸡球虫混合感染的免疫调节型多价多表位的DNA疫苗。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种鸡艾美耳球虫(Eimeria spp)多价多表位DNA疫苗，该疫苗包含其中插入T细胞表位集中的4 个基因片段：NA4-1(E.necatrix)、TA4-1(E.tenella)、EMCDPK-1(E.maxima)以及LDH-2(E.acervulina)， NA4-1、TA4-1、LDH-2、EMCDPK-1核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基，第319-645个碱 基，第652-984个碱基，第991-1299个碱基。

所述的4个基因片段NA4-1、TA4-1、EMCDPK-1和LDH-2通过连接成融合基因 NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1的形式插入真核表达载体中，该融合基因 NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1序列如SEQ ID NO.40所示。

一种鸡艾美耳球虫多价多表位DNA疫苗，包含真核表达载体以及其中插入的T细胞表位集中的4个 基因片段：序列为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基所示的NA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第319-645个碱 基所示的TA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第652-984个碱基所示的LDH-2以及序列为SEQ ID NO.1的第 991-1299个碱基所示的EMCDPK-1；以及序列为SEQ ID NO.1的第1309-1740个碱基所示的鸡白介素-2基 因chIL-2。

所述的NA4-1、TA4-1、EMCDPK-1、LDH-2和chIL-2连接在一起形成序列为SEQ ID NO.1所示的的 融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2，插入到真核表达载体pVAX1中组成免疫调节型多价多表 位DNA疫苗pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2，质粒谱图见图1。

该DNA疫苗可以在制备预防和/或治疗鸡球虫病的药物制剂中的应用。

本发明建立在本实验室下列发现之上：含有E.tenella、E.necatrix、E.maxima子孢子阶段抗原基因TA4、 NA4、EMCDPK和在E.acervulina不同发育阶段(卵囊，子孢子，裂殖体，裂殖子)均有表达的抗原基因LDH 的真核质粒载体能够为鸡提供针对艾美耳球虫的有效免疫保护；将chIL-2基因与球虫保护性基因一起引入真 核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。

生产本发明鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗的方法，简而言之，其技术路线如下：

1.多价多表位DNA疫苗的4种鸡球虫候选多表位基因片段的筛选：运用DNAstar软件对E.tenella的TA4(李 祥瑞.用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL 200510124048.4)、 5401(黄欣梅.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-5401-IFN-γ的研究.南京农业大学硕士论文， 2006)、pEtK2(谢昆等.柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析.中国兽医科 学，2007，37(03)：200-204)和mic4(陈益.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA-IL-2-mic4的研究. 南京农业大学硕士论文，2005)抗原基因，E.necatrix的NA4(李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调 节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL200810155080.2)抗原基因，E.maxima的EMCDPK (Mohammed Ali A.Shah.Research on the Multi-epitopes DNA Vaccines against Chicken Coccidiosis.南京农业 大学博士学位论文，2010)抗原基因和E.acervulina的LDH(宋鸿雁.堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗 免疫保护作用及免疫机理研究.南京农业大学博士学位论文，2010)和3-1E(周婷婷.五种鸡堆型艾美耳球 虫DNA疫苗免疫保护效果比较.南京农业大学硕士学位论文，2008)抗原基因的抗原表位进行分析，每个基 因选取1到2段T细胞表位比较集中的序列通过动物保护试验，筛选出免疫保护效果最好的抗原T细胞表位： NA4-1(E.necatrix)、TA4-1(E.tenella)、EMCDPK-1(E.maxima)以及LDH-2(e.acervulina)。

2.免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的构建。

3.免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2在鸡体内转录与翻译情况 检测

4.免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的免疫保护性检测

本发明具有以下优点和效果：

1.该疫苗是DNA疫苗，与传统疫苗相比，具有安全性高、在体内维持时间长、制备简单、热稳定性良好、 便于贮藏和运输、使用省时省力等优点。

2.鸡球虫临床上多为混合感染，本发明两种疫苗均包含危害严重的4种球虫的抗原基因片段，能够抵抗4 种球虫的混合感染。

3.T细胞免疫应答反应在球虫免疫应答中处于核心地位。本发明两种疫苗所选用的4个基因，都编码集中的 T细胞表位，特异性地诱导T细胞免疫应答反应；通过选择最佳和最具免疫保护潜力的T细胞表位诱生特异性 免疫应答，能尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负面影响；4个片段串联以增加表位浓度和密度， 增强重组抗原的反应范围。

4.鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，包括chIL-2。它能促进CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的分化增殖，维持 T细胞生长，促进NK细胞和B细胞功能。DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2含有chIL-2 基因，增强了该疫苗的免疫保护效果。试验证明，该疫苗在抗球虫感染中，不仅能够抵抗4种球虫的混合感 染，而且具有良好的免疫保护效果。

附图说明

图1为DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的结构示意图。

图2为利用DNAstar对候选抗原基因的抗原表位分析结果。

图3为pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的RT-PCR检测图，

M：DNA分子量标准物DL2000；1-5：分别为NA4-1(326bp)、TA4-1(343bp)、LDH-2(349bp)、EMCDPK-1 (329bp)、chIL-2(432bp)的检测；6：空白对照。

图4为以大鼠抗NA4重组蛋白多克隆抗体对pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2进行Western-blot 检测结果图，

M：蛋白Marker，1：注射部位(腿肌)裂解上清；2：非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。

图5为以大鼠抗TA4重组蛋白多克隆抗体对pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2进行Western-blot 检测结果图；

M：蛋白Marker，1：注射部位(腿肌)裂解上清；2：非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。

图6为以大鼠抗LDH重组蛋白多克隆抗体对pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2进行Western-blot 检测结果图；

M：蛋白Marker，1：注射部位(腿肌)裂解上清；2：非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。

具体实施方式

基础材料：

1.孢子化卵囊：江苏株柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，每3个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80％以上 (索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998.)。

2.实验动物：0龄的小公雏购自南京青龙山鸡场，自出壳至实验结束时饲养在严格消毒，无球虫的环境中， 自由采食和饮水。

3.质粒与菌种：宿主菌E.coli DH5α、BL21、质粒pMD18-T-mic4(陈益.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型 DNA疫苗pcDNA-IL-2-mic4的研究.南京农业大学硕士论文，2005)pET-28a(+)-NA4(李祥瑞等.预防鸡 毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号：ZL 200810155080.2)、 pcDNA-TA4-Xa-chIL-2(ZL 200510124048.4实施例3)、pET-28a(+)-TA4(即专利号：ZL 200510124048.4 实施例4中的pET-TA4)、pET-28a(+)-LDH(宋鸿雁.堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用 及免疫机理研究.南京农业大学博士学位论文，2010)，pMD18-T-pEtK2(谢昆.柔嫩艾美耳球虫免疫调节 型DNA疫苗pEtK2-IL-2的研究.南京农业大学硕士论文，2004)和pMD18-T-5401(黄欣梅.鸡柔嫩艾美 耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-5401-IFN-γ的研究.南京农业大学硕士论文，2006)，pMD18-T-3E-1 (周婷婷.五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较.南京农业大学硕士学位论文，2008)、 pMD18-T-EMCDPK(Mohammed Ali A.Shah.Research on the Multi-epitopes DNA Vaccines agamst Chicken Coccidiosis.南京农业大学博士学位论文，2010)真核表达载体pVAX1(Invitrogen公司)。

4.工具酶与试剂：Trizol试剂为Promega公司产品；DEPC为Amresco公司产品；β-巯基乙醇为Fluka公司 产品；反转录酶AMV、Oligo(dT)18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量标准物DL2000、T4DNA Ligase、限制 性内切酶，水饱和酚、琼脂糖胶回收试剂盒均为大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品；其余试剂为国 产分析纯。

5.主要仪器设备：冷冻台式离心机(Eppendorf centrifuge 5417R)；紫外可见分光光度计(Bio-Rad)；PCR 仪(HYBAID公司)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；紫外分析仪(WD-9304C型，北京 市六一仪器厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)。

实施例1.多价多表位DNA疫苗的4种鸡球虫候选多表位基因片段的筛选

1多价多表位DNA疫苗候选抗原基因的抗原表位分析

利用DNAstar对E.tenella的4个抗原基因TA4(李祥瑞.用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗. 中华人民共和国发明专利，专利号：ZL 200510124048.4，SEQNO.1中的第1-648个核苷酸)、mic4(陈益. 鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA-IL-2-mic4的研究.南京农业大学硕士论文，2005)、pEtK2 (谢昆.柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IL-2的研究.南京农业大学硕士论文，2004)和5401 (黄欣梅.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-5401-IFN-γ的研究.南京农业大学硕士论文， 2006)，E.necatrix的NA4(李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国 发明专利，专利号：ZL200810155080.2)，E.acervulina的LDH(宋鸿雁.堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA 疫苗免疫保护作用及免疫机理研究.南京农业大学博士学位论文，2010)和3E-1(周婷婷.五种鸡堆型艾美 耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较.南京农业大学硕士学位论文，2008)以及E.maxima的EMCDPK (Mohammed Ali A.Shah.Research on the Multi-epitopes DNA Vaccines against Chicken Coccidiosis.南京农业 大学博士学位论文，2010)基因序列进行抗原表位分析，各确定1-2段T细胞表位比较集中的序列(见图2)， TA4基因中T细胞表位比较集中的序列为TA4-1(TA4基因的第40-366个核苷酸)，mic4基因中T细胞 表位比较集中的序列为mic4-1(mic4基因的第109-387个核苷酸)和mic4-2(mic4基因的第487-771个 核苷酸)，pEtK2基因中T细胞表位比较集中的序列为pEtK2-1(pEtK2基因的第43-450个核苷酸)和pEtK2-2 (pEtK2基因的第508-954个核苷酸)，5401基因中T细胞表位比较集中的序列为5401-1(5401基因的 第463-852个核苷酸)，NA4基因中T细胞表位比较集中的序列为NA4-1(NA4基因的第61-369个核 苷酸)和NA4-2(NA4基因的第343-681个核苷酸)，LDH基因中T细胞表位比较集中的序列为LDH-1 (LDH基因的第52-366个核苷酸)和LDH-2(LDH基因的第385-717个核苷酸)，3E-1基因中T细胞 表位比较集中的序列为3E-1-1(3E-1基因的第34-243个核苷酸)和3E-1-2(3E-1基因的第268-501个 核苷酸)，EMCDPK基因中T细胞表位比较集中的序列为EMCDPK-1(EMCDPK基因的第325-633个核 苷酸)和EMCDPK-2(EMCDPK基因的第886-1206个核苷酸)。

选择参数为：

1)Hydropathy-Hopp-Woods-通过计算蛋白质序列上的最大局部亲水性寻找蛋白质的抗原决定簇。

2)Antigenicity-AMPHI-根据序列预测免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点。

3)Antigenicity-Rothbard-Taylor-预测含有特定基序(motif)的潜在T淋巴细胞抗原决定簇。

4)Antigenicity-Jameson-Wolf-通过联合现有的蛋白质结构预测方法预测潜在的蛋白质抗原决定簇。

2多价多表位DNA疫苗的4种鸡球虫候选多表位基因片段的筛选

2.14种鸡球虫候选多表位基因片段的克隆与DNA疫苗的构建

根据所选定的序列，利用软件primer premier5.0设计以下14对特异性引物，由Invitrogen公司合成， 引物序列及扩增模板见表1。

表1用于克隆候选多表位基因片段的引物序列及扩增模板

用上述14对引物，分别以pMD18-T-mic4、pET-28a(+)-NA4、pET-28a(+)-TA4、pET-28a(+)-LDH、 pMD18-T-pEtK2、pMD18-T-5401、pMD18-T-3E-1和pMD18-T-EMCDPK为模板，通过PCR扩增的方法将 上述选定的14个多表位基因片段克隆出来，反应体系如下：10×PCRbuffer 2.5μL，MgCl₂(25mmol/L)1.5μL， dNTP(2.5mmol/L)1.0μL，上游引物(50pmol/L)0.5μL，下游引物(50pmol/L)0.5μL，相应的质粒模板 (0.5μg/μL)2.5μL，rTaq DNA聚合酶(20U/μL)0.5μL，灭菌双蒸水16μL，共25.0μL。反应条件为：94℃ 预变性8min；94℃变性60s，退火60s(14个片段的退火温度如下：TA4-157℃、mic4-160.8℃、mic4-2 60.8℃、5401-160.9℃、pEtK2-158.7℃、pEtK2-259.3℃、LDH-153.6℃、LDH-254.6℃、3E-1-158℃、3E-1-2 52.9℃、NA4-155.4℃、NA4-258.2℃、EMCDPK-151.6℃、EMCDPK-252.6℃)，72℃延伸60s，30个循 环，然后72℃延伸10min。循环反应结束后，取10μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果。紫外 灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶，用TaKaRa公司胶回收试剂盒回收纯化目的片段，PCR并且分别连接 到pVAX1中构建成了14个DNA疫苗，分别为pVAX1-TA4-1、pVAX1-mic4-1、pVAX1-mic4-2、 pVAX1-pEtK2-1、pVAX1-pEtK2-2、pVAX1-5401-1、pVAX1-NA4-1、pVAX1-NA4-2、pVAX1-LDH-2、 pVAX1-LDH-2、pVAX1-3E-1-1、pVAX1-3E-1-2、pVAX1-EMCDPK-1和pVAX1-EMCDPK-2。

2.24种鸡球虫候选多表位基因片段的筛选

2.2.1试验设计

用上述所构建的14个DNA疫苗进行动物免疫保护试验来筛选4种鸡球虫免疫保护效果最好的多表位 基因片段。14日龄鸡逐只称重，淘汰偏重和偏轻的个体，随机分组并调整各组间的总体重或平均体重，使 其接近一致，每组30只。设计了14个DNA疫苗试验组，4种球虫分别设立pVAX1空载体、非免疫非攻 虫和非免疫攻虫3个对照组，共26组。试验组14日龄腿部肌肉注射相应的DNA疫苗，每只鸡注射100μg； 21日龄加强免疫，每只鸡注射100μg，空载体对照组注射pVAX1，另外2个对照组注射Tris-HCl-EDTA缓 冲液(TE，pH8.0)。28日龄，除非免疫非攻虫组外，其余分别经口接种新鲜的E.tenella、E.necatrix、E.maxima 和E.acervulina孢子化卵囊5×10⁴个/羽、5×10⁴个/羽、10×10⁴个/羽和10×10⁴个/羽。攻虫时，每种球虫分别 设立pVAX1空载体组、非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组。各组于首免时，攻虫时和扑杀时逐只称 重。攻虫后7天(即35日龄)扑杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数。

2.2.2免疫保护效果观察

2.2.2.1增重效果

注射DNA疫苗前，逐羽称鸡体重，然后分别在攻虫时和宰杀时逐羽称重，计算注射后至攻虫前、以及 攻虫后到宰杀时鸡体重变化情况，然后计算平均增重和相对增重。

平均增重＝宰杀时平均体重-攻虫时平均体重

增重率＝(宰杀时平均体重-攻虫时平均体重)/攻虫时平均体重×100％

相对增重率＝(各试验组增重率/非感染非免疫组增重率)×100％

2.2.2.2肠道病变记分

攻虫后7天宰杀全部鸡，逐羽观察肠道病变，并按Johnson方法(索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京： 中国农业大学出版社，1998，373-377)病变记分方法进行肠道病变记分。具体记分方法如下：

感染E.tenella后的盲肠病变记分：0分，表示正常，无肉眼病变。+1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点， 肠壁不增厚，内容物正常。+2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常。+ 3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚明显，盲肠中 粪便含量少。+4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记+4分。 两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准。

感染E.necatrix后小肠病变记分：0分，无肉眼病变。+1分，从小肠中部浆膜面看有散在的针尖状出 血点或白色斑点，粘膜损伤不明显。+2分，从小肠中部浆膜面看有多量的出血点，也可见到中部肠管稍充 气。+3分，小肠腔有大量出血，浆膜面见有红色或白色斑点。粘膜面粗糙，增厚，有许多针尖状出血点。 肠内容物含量少；充气达小肠下半段，小肠粗度明显加大但长度明显缩小。+4分，小肠因严重出血而呈暗 红色、褐色，大部分肠管气胀明显，粘膜增厚加剧，肠腔内充满血液和粘膜组织的碎片，从浆膜面看，在 感染部位组织见到白色或红色病状，在死亡鸡只病灶为白色和黑色，呈“白盐与黑胡椒”之外观，有些情况， 可见到寄生性肉芽肿，肠管增粗一倍，长度缩短一倍。死亡鸡只也记+4分。

感染E.maxima后小肠病变记分：0分，无肉眼可见病变。+1分，小肠中段浆膜面隐约可见出血点， 肠腔中有少量桔黄色粘液，肠管形状不见异常。+2分，小肠中段浆膜面有多量出血点，肠腔中见有多量桔 黄色粘液，肠壁增厚。+3分，小肠充气，壁增厚，粘膜面粗糙，小肠内容物含有小血凝块和粘液。+4分， 小肠充气明显，肠壁高度增厚，肠内容物含有大量血凝块和红褐色血液。病死鸡只也计+4分。

感染E.acervulina后小肠病变记分：0分，无肉眼可见病变。+1分，十二指肠浆膜面有散在的白色斑， 每平方厘米不超过5处。+2分，白色斑增多但不融合，形成白色梯形条纹状外观，3周龄以上的鸡，病变 可扩展到十二指肠下20cm，肠壁不增厚，内容物正常。+3分，白色病灶增多且融合成片，小肠壁增厚。 内容物呈水样，病变蔓延到卵黄囊憩室之后。+4分，被感染的肠绒毛缩短融合，使十二指肠和小肠粘膜呈 灰白色，肠壁高度肥厚，肠内容物呈奶油状。死亡鸡只也计为+4分。

2.2.2.3卵囊计数

按麦克马斯特法计算卵囊，具体为：攻虫后第7天，宰杀全部鸡，逐羽取其各球虫种对应肠道内容物， 各取2g，加58mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满2个计数室，静止1-2min，镜检计数2个计数室的 卵囊数。计数室容积为1×1×0.15＝0.15mL，0.15mL内含肠道内容物2×0.15/(10+50)＝0.005g，2个计数室 则为0.01g，所得卵囊数乘100即为克肠道内容物卵囊数。

卵囊减少率(％)＝(非免疫攻虫组卵囊数-试验组卵囊数)/非免疫攻虫组卵囊数×100

2.2.2.4抗球虫指数(Anticoccidial Index，ACI)

ACI是包括存活率、增重、病变、卵囊产量等多项参数，综合评定后作为判定抗球虫药物效力或疫苗 免疫效果的指标(索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社，1998，373-377)。采用如下 ACI判定公式进行判定。

ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)。ACI≥180为保护效果明显，ACI＝160～179为保护效 果一般，ACI＜160为无保护效果。

存活率＝(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100％

相对增重率＝(试验组增重率/非感染非免疫组增重率)×100％

病变值(0～40)＝各试验组的平均病变记分(0～4)×10

卵囊值(0～40)的转化标准如下：E.tenella盲肠内容物卵囊百万数(×10⁶)若小于0.1，卵囊值则计 为0，若为0.1～1.0，则计为1，若为1.0～2.0，则计为5，若为2.0～5.0，则计为10，若为5.0～6.0，则计 为15，若为6.0～10.0，则计为20，若为10.0～11.0，则计为30，若大于11.0，则计为40；E.necatrix盲肠 内容物卵囊十万数(×10⁵)若小于0.1，卵囊值则计为0，若为0.1～1.0，则计为1，若为1.0～2.0，则计为 5，若为2.0～5.0，则计为10，若为5.0～6.0，则计为15，若为6.0～10.0，则计为20，若为10.0～11.0，则 计为30，若大于11.0，则计为40；E.maxima和E.acervulina肠内容物卵囊值取决于试验组卵囊数占非免疫 攻虫组的比例(％)，若此比例(％)为0～1.0，卵囊值则计为0，若为1～25，则计为1，若为1～25，则计为1， 若为26～50，则计为10，若为51～75，则计为20，若为76～100，则计为40。

2.2.3结果

据SPSS软件统计分析，免疫时各组鸡体重组间差异不显著(P＞0.05)，表明试验动物分组情况是合理 的；平均增重表示疫苗对鸡体的免疫保护作用，由表2～5可以看出各免疫剂量组鸡的平均增重均明显高于 非免疫攻虫组鸡的平均增重，差异显著(P＜0.05)，非免疫非攻虫组高于非免疫攻虫组，差异显著(P＜0.05)； pVAX1-TA4-1组在减少E.tenella感染对鸡体增重负面影响和减轻E.tenella感染引起的肠道病变和降低卵 囊量方面效果相对明显对E.tenella感染组的免疫保护效果最好，ACI为165.48；pVAX1-NA4-1组在减少 E.necatrix感染对鸡体增重负面影响和减轻E.necatrix感染引起的肠道病变和降低卵囊量方面效果相对明 显，对E.necatrix感染组的免疫保护效果最好，ACI为174.77；pVAX1-EMCDPK-1组在减少E.maxima感 染对鸡体增重负面影响和减少E.maxima感染引起的肠道病变和降低卵囊量方面效果相对明显，对E. maxima感染组的免疫保护效果较好，ACI为167.18；pVAX1.0-LDH-2组在减少E.acervulina感染对鸡体增 重负面影响和减少E.acervulina感染引起的肠道病变和降低卵囊量方面效果相对明显，对E.acervulina感染 组的免疫保护效果最好，ACI值最高，大于160。

综上所述，筛选出的4个种球虫的免疫保护效果最好的多表位基因片段分别为TA4-1(E.tenella)、NA4-1 (E.necatrix)、LDH-2(E.acervulina)和EMCDPK-1(E.maxima)。本发明选择这4个多表位基因片段作 为构建4种艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗的候选基因片段。

表2DNA疫苗免疫鸡对E.tenella感染的综合保护效果

注：同一列标有不同字母表示差异显著(P＜0.05)，标有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，下同。

表3DNA疫苗免疫鸡对E.necatrix感染的综合保护效果

表4DNA疫苗免疫鸡对E.maxima感染的综合保护效果

表5DNA疫苗免疫鸡对E.maxima感染的综合保护效果

实施例2.免疫调节型多价多表位DNA疫苗的构建

1.TA4-1、NA4-1、LDH-2、EMCDPK-1和chIL-2的PCR扩增

根据所构建的重组质粒对酶切位点以及对阅读框的不同要求，利用软件primer premier5.0设计5对特异 性引物，并送往大连宝生物(TaKaRa)合成引物。序列如下：

NA4-1上游引物：SEQ ID NO.30，NA4-1下游引物：SEQ ID NO.31；

TA4-1上游引物：SEQ ID NO.32，TA4-1下游引物：SEQ ID NO.33；

LDH-2上游引物：SEQ ID NO.34，LDH-2下游引物：SEQ ID NO.35；

EMCDPK-1上游引物：SEQ ID NO.36，EMCDPK-1下游引物：SEQ ID NO.37；

chIL-2上游引物：SEQ ID NO.38，chIL-2下游引物：SEQ ID NO.39。

在NA4-1片段的上游加入HindIII酶切位点和ATG，下游加入Kpn I酶切位点；TA4-1片段的上游加入 Kpn I酶切位点，下游加入EcoR I酶切位点；LDH-2片段的上游加入EcoR I酶切位点，下游加入EcoRV 酶切位点；EMCDPK-1片段的上游加入EcoRV酶切位点，下游加入Not I酶切位点；chIL-2片段的上游加 入Not I酶切位点，下游加入Xba I酶切位点。

利用特异性引物，分别以质粒pET-28a(+)-NA4、pET-28a(+)-TA4、pET-28a(+)-LDH、pMD18-T-EMCDPK 和pcDNA-TA4-chIL-2为模板，按分子克隆方法(Sambrook J，Russell DW.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.)PCR扩增NA4-1、TA4-1、LDH-2、 EMCDPK-1和chIL-2基因片段。用1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果。

2.重组质粒pVAX1-NA4-1的构建

将PCR产物NA4-1经琼脂糖凝胶电泳后，用TIANGEN公司胶回收试剂盒纯化目的片段，具体方法参 照说明书。对回收纯化的NA4-1和表达载体pVAX1进行Hind III和Kpn I的双酶切处理，酶切产物经1％琼 脂糖凝胶电泳后，按照胶回收试剂盒回收并纯化片段。将纯化的NA4-1与pVAX1连接，连接体系为10.0μL： 灭菌双蒸水4.5μL，T4DNA ligase(TaKaRa)0.5μL，10×T4DNA ligase Buffer(TaKaRa)1μL，双酶切后 的NA4-1与载体pVAX1分别为3μL和1μL。混合后于16℃保温桶中连接过夜。将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，提取质粒进行双酶切鉴定，并送至Invitrogen公司测序。

3.免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的构建

把构建好的重组质粒pVAX1-NA4-1和PCR产物TA4-1用Kpn I和EcoR I双酶切，回收TA4-1目的基因片 段和pVAX1-NA4-1大片段，把TA4-1与pVAX1-NA4-1大片段连接构建成重组质粒pVAX1-NA4-1-TA4-1，连 接与转化的方法同上述“2.重组质粒pVAX1-NA4-1的构建”；再用EcoR I和EcoRV双酶切PCR产物LDH-2和 pVAX1-NA4-1-TA4-1，回收LDH-2和pVAX1-NA4-1-TA4-1大片段，把LDH-2与pVAX1-NA4-1大片段连接构 建成重组质粒pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2；然后用EcoRV和Not I双酶切PCR产物EMCDPK-1和 pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2，回收EMCDPK-1目的基因片段和pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2大片段，把 EMCDPK-1与pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2大片段连接构建成重组质粒pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2- EMCDPK-1；最后用Not I和Xba I双酶切PCR产物IL-2和pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1，回收IL-2 和pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1大片段，把IL-2与pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1连接 构建成免疫调节型多价表位DNA疫苗pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2。在 pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的构建过程中，同时得到pVAX1-TA4-1-NA4-1、 pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2、pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1质粒。连接方法同上述“2.重组质粒 pVAX1-NA4-1的构建”，连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，提取质粒。对重组质粒用相对应的内 切酶进行酶切鉴定，结果表明，重组质粒构建成功。将构建好的质粒测序，融合基因 NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，NA4-1、TA4-1、LDH-2、EMCDPK-1 核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基，第319-645个碱基，第652-984个碱基，第991-1299个碱 基，chIL-2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1的第1309-1740个碱基。

实施例3免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2在鸡体内转录 情况检测

对转化有重组质粒pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的E.coli DH5α菌液大量培养，大量 提取重组质粒pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2(萨姆布鲁克J，拉塞尔D W.分子克隆实验指 南[M].(第三版).黄培堂等译.北京：科学出版社，2002，26-50)，分别经腿部肌肉注射7日龄雏鸡(100μg/ 只)，一周后分别取注射部位(腿肌)和非注射部位肌肉(胸部)，一步法分别提取总RNA，加入DnaRase 除去残余的重组质粒和基因组DNA，以总mRNA为模板做RT-PCR分别扩增目的基因。结果显示目的基因 NA4-1、TA4-1、LDH-2、EMCDPK-1和IL-2在注射部位都能检测到，而非注射部位没有检测到(见图3)。 实施例4.免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2在鸡体内翻译 情况检测

1、NA4、TA4、LDH重组蛋白抗血清的制备

将重组质粒pET-28a(+)-NA4、pET-28a(+)-TA4、pET-28a(+)-LDH分别转化入E.coli BL21感受态细菌中 得到分别含pET-28a(+)-NA4、pET-28a(+)-TA4、pET-28a(+)-LDH的基因工程菌，将此菌液按1∶100的比例 接于含50mg/L Kana⁺的LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6左右，加入IPTG，使终浓度为1mmol/mL， 继续进行诱导表达，分别收集0、15、30、45、60、75min的菌液各1mL待用。

按照上述方法大量诱导表达pET-28a(+)-NA4、pET-28a(+)-TA4、pET-28a(+)-LDH。收集菌体，超声破 碎后，离心，上清经过His-标签蛋白纯化柱纯化后，即得到纯化的NA4、TA4、LDH重组蛋白，测定浓度 后免疫一组1月龄健康大鼠。首次免疫每只大鼠用100μg蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀，乳化后进行背 部皮下多点注射，两周后开始每周一次的加强免疫，加强免疫时改用弗氏不完全佐剂。当间接ELISA法检 测抗体效价达1∶6400时杀鼠取血清，-20℃保存备用。

2、Western-blot检测

大量提取重组质粒pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2，腿部肌肉注射一周龄鸡(100μg/只)， 一周后分别取注射部位(腿肌)和非注射部位肌肉(胸部)，裂解液裂解1h，12000r/min离心5min取上清 制样，用大鼠抗NA4、TA4、LDH重组蛋白的多克隆抗体作为一抗，山羊抗大鼠IgG(优宁维)作为二抗， 进行Western-blot检测目的基因的表达情况，结果显示目的基因在注射部位表达(见图4-6)。

实施例5.免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2的免疫保护性 检测

1.实验设计

0日龄雏鸡饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由饮水采食。14日龄逐只称重并编号，淘汰偏重和 偏轻的鸡只，随机分组并调整个实验组间的总体重或平均体重。使它们接近一致，每组30只。设计了4个 免疫调节型多价表位DNA疫苗组：pVAX1-TA4-1-NA4-1、pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2、 pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1和pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2，各疫苗组分别 以E.tenella、E.necatrix、E.maxima、E.acervulina攻虫；每种球虫分别设立pVAX1空载体、非免疫攻虫 对照组和非免疫非攻虫对照组，共25组。

4个试验组14日龄腿部肌肉注射相应的DNA疫苗，每只鸡注射100μg，21日龄加强免疫，注射剂量 也为100μg，对照组注射TE。28日龄，除非免疫非攻虫组外，其余各组分别经口接种新鲜的E.tenella、E. necatrix、E.maxima、E.acervulina孢子化卵囊5×10⁴个/羽、5×10⁴个/羽、10×10⁴个/羽、10×10⁴个/羽。各组 于首免时，攻虫时和剖杀时逐只称重。攻虫后7天(即35日龄)剖杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数， 分组情况见表6-9。

2.免疫保护效果的观察同前实施例1中2.2.2。

3.免疫保护效果分析

由表6-9可以看出pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1和 pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2组在减少E.tenella、E.necatrix、E.maxima和E.acervulina 感染对鸡体增重负面影响方面效果明显；在减少E.tenella、E.necatrix、E.maxima和E.acervulina感染引 起的肠道病变和降低卵囊量方面效果明显；pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2组对E.tenella、 E.necatrix、E.maxima和E.acervulina感染组的免疫保护效果最好，ACI分别为175.91、180.96、170.18和 170.40。综上所述，pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2组对E.tenella、E.necatrix、E.maxima和 E.acervulina感染组的免疫保护效果最好，pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1组的免疫保护效果次 之。

表6DNA疫苗免疫鸡对E.tenella感染的综合保护效果

注：p-N1-T1表示pVAX1-NA4-1-TA4-1；p-N1-T1-L2表示pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2；

p-N1-T1-L2-E1表示pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1；

p-N1-T1-L2-E1-IL2表示pVAX1-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2，下同。

表7DNA疫苗免疫鸡对E.necatrix感染的综合保护效果

表8DNA疫苗免疫鸡对E.maxima感染的综合保护效果

表9DNA疫苗免疫鸡对E.acervulina感染的综合保护效果