检测和/或定量沙门氏菌属物种的肽核酸探针,试剂盒和方法和其应用

摘要

本发明涉及用于检测不同类型的样品中的沙门氏菌属（Salmonella）的肽核酸（PNA）探针的开发。PNA是DNA的合成分子类似物，由于其物理化学性质，允许相比DNA探针，以更高灵敏度更快的分析。将这些探针与荧光原位杂交（FISH），允许样品中微生物的直接可视化的分子生物学技术组合。这2种技术的组合致使FISH成为更快的，更简单的和更有效的方法。可将此探针应用于多种样品诸如血，食品，活组织检查，粪便，水和其他临床，环境或农业和食品工业样品。本发明也包括用于使用以上所述的样品类型鉴定沙门氏菌属（Salmonella spp.）物种的检测试剂盒和相应过程的开发。

说明书

【技术领域】

本发明涉及检测与临床和食品安全性关联的微生物的方法。为此 目的，开发了检测沙门氏菌属（Salmonella）的PNA探针。

除了探针之外，本发明包括ONA FISH方法和其应用于检测和/ 或定量沙门氏菌属（Salmonella spp.）物种的试剂盒，其可用于食品 和临床领域。

【背景技术】

沙门氏菌属（Salmonella）包括可导致跨简单胃肠炎到系统性感 染的疾病的几种病原性细菌。疾病严重性通常由沙门氏菌属 （Salmonella）物种/株的毒力，宿主（人或其他动物物种）和宿主健 康状态测定。

属的种系发生分析显示了其分为2个物种：乍得沙门氏菌 （Salmonella bongori）和肠沙门氏菌（Salmonella enterica）。虽然如 此，至今已鉴定多于2500种血清型，大多数能感染人和广范围的动物 物种。沙门氏菌属（Salmonella）株被常规鉴定，及根据 Kauffmann-White血清分型方案分类，其基于外膜中存在的抗原类型。

此细菌可经粪便-口腔途径或当发生土壤，水和食品的粪便污染时 通过与外部贮器直接接触而直接在人之间传播。因此开发稳健的检测 方法致使鉴定全部这些样品类型的细菌变得重要。例如，“Food and  drug Administration”旨在通过在家禽饲养场实施对于污染的卵壳的 测试程序来控制肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）的传播，由于 卵壳已鉴定为在微生物传播中重要。

沙门氏菌属（Salmonella）的检测传统上使用培养方法进行。但 是，这些方法是艰辛而且耗时（4～6天）和艰辛的过程。像这样，需 要可辅助控制细菌以便减少人和动物中的沙门氏菌病的更快的和更可 靠的新方法的开发。为此目的，已开发许多分子检测方法，以减少鉴 定食品，粪便，水和临床样品中的沙门氏菌属（Salmonella）需要的 时间。这些方法包括免疫酶测定（ELISA），聚合酶链反应（PCR）， 及FISH。但是，一些研究显示，基于PCR及ELISA的方法无法检 测一些通过培养方法为阳性的样品。即便如此，基于PCR的方法被证 明为相比ELISA方法更精确。另一方面，当在PCR之前进行选择性 富集步骤，不仅检测全部培养-阳性样品，而且通过PCR可检测未通 过培养方法检测到的沙门氏菌属（Salmonella）的存在。这些研究揭 示，富集步骤可通过消除问题诸如在特定类型的样品，诸如食品和粪 便样品中低数的细菌和抑制性物质的存在而增加分子检定灵敏度。但 是，基于PCR的方法通常需要DNA提取步骤，而且以上方法均不， 除了FISH之外，允许样品之中细菌的直接可视化。此可为重要，例 如，通过允许直接评估样品中卵壳的沙门氏菌属（Salmonella）污染。

FISH是广泛应用于样品之内细菌鉴定和定位的分子测定。此方 法基于小寡核苷酸（探针）与特定rRNA区的特异性结合。探针偶联 于荧光色素，且在杂交之后，荧光信号由于细胞之内的高rRNA拷贝 数而可检测。已有一些研究报道使用DNA探针的沙门氏菌属 （Salmonella）检测（Kutter等人,2006;Nordentoft等人,1997）。

近来，已开发用于微生物检测的肽核酸探针（PNA）。这些分子 模拟DNA及能遵从Watson-Crick规则与互补核酸特异性杂交。但是， 建立的键更强，由于，在PNA分子中，其带负电的糖-磷酸酯主链结 构被单元中中性重复的（2-氨基乙基）甘氨酸取代。FISH技术中此分 子的充足的使用致使过程更稳健，更快和更有效。

对于沙门氏菌属（Salmonella），已之前开发PNA FISH方法 （Perry-O’Keefe等人,2001）。但是，使用的探针具有与其他物种， 诸如伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans），蚜虫 巴克纳氏菌（Buchnera aphidicola），流感嗜血杆菌（Haemophilus  influenza）和耶尔森菌属（Yersinia spp.）物种互补的序列，使其成为 对于诊断欠有吸引力。由此认为，设计及测试新探针及开发用于此特 定微生物的新方法是重要的。

重要的是注意到，尽管优化之后非常稳健，PNA FISH方法的开 发就如PCR方法的开发，极其需求及需要涉及的不同参数的化学和物 理特征的大量知识。此外，熟知的是，使PNA FISH方法对生物工作， 不保证靶向相同的生物的其他序列会发挥功能。而且，尽管研究者通 常感觉对出版阴性结果天然缺乏兴趣，几个研究可见于文献，其中作 者仅能致力于对用于相同的微生物的一些探针工作。

【发明内容】

本发明涉及肽核酸（PNA）探针和其用于检测沙门氏菌属 （Salmonella）（即,鉴定或定量）的方法。

本发明中描述的探针识别微生物23S rRNA或对应于提及的 rRNA的基因组序列。PNA探针具有其结构固有的生理化学特征，且 当将它们应用于基于FISH的方法时，允许相比使用DNA更快的，更 稳健的和更特异性分析。

此方法的优势之一是探针在广泛的生物学样品中稳健地工作，其 通常不与其他检测分子方法发生。

另一关联方面是检测需要的时间。本发明开发的方法匹配余下分 子方法报道的最佳时间，甚至当样品类型在分析之前需要富集步骤时。 对于临床或食品安全角度，方法的快速及可靠性可决定污染和/或感染 的适当的及及时处理。

本发明的另一方面涉及基于此探针向荧光原位杂交（FISH）的应 用的试剂盒的开发，允许在广普生物学样品中，以迅速和简单方式检 测沙门氏菌属（Salmonella）。

在本发明的优选的实施方式中，此处描述的PNA探针允许检测沙 门氏菌属（Salmonella）的rRNA，rDNA或rRNA的互补序列中的靶 序列。

本发明的实施方式之一是描述用于检测和/或定量沙门氏菌属 （Salmonella）的PNA探针，其特征在于，其与序列SEQ ID NO:1 －5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’具有至少86%的相似性，优选与序 列SEQ ID NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’具有87%，88%， 89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%， 99%，100%的相似性。

在本发明的更可优选的实施方式中，将之前描述的序列连接到至 少一种类型的可检测的级分。使用的可检测的级分的类型可尤其选自 以下基团之一：缀合物，分支的检测系统，生色团，荧光团，放射性 同位素，酶，半抗原或发光化合物。

在甚至更可优选的实施方式中，荧光团可尤其为以下中的至少一 种：Alexa系列荧光团，花青苷，5-（及-6）羧基-2'，7'-二氯荧光素， 5-ROX（5-羧基-X-若丹明,三乙基铵盐）。

仍是本发明的主题的是用于检测生物学样品中沙门氏菌属 （Salmonella）的存在或缺失和/或定量的试剂盒。

在本发明的更可优选的实施方式中，试剂盒可额外地存在以下溶 液中的至少一种：固定溶液，杂交溶液及洗涤溶液。

在本发明的再一优选的实施方式中，固定溶液可包含多聚甲醛和 乙醇，即2～8%（重量/vol）的多聚甲醛和25～90%（vol/vol）的乙 醇，和/或杂交溶液可包含甲酰胺。

仍是本发明的对象的是描述用于检测沙门氏菌属（Salmonella） 或用于检测生物学样品中的沙门氏菌属（Salmonella）的方法，其使 用早先提及的PNA探针及其包括以下步骤：

●PNA探针与生物学样品接触；

●PNA探针与存在于生物学样品之中的微生物的靶序列杂交；

●作为指示生物学样品中提及的检测和定量的杂交检测，杂交可 优选通过荧光进行。

生物学样品可尤其从血，空气，食品，水，活组织检查或粪便获 取。

仍是本发明的对象的是早先描述的PNA探针，早先描述的试剂盒 和方法应用于检测沙门氏菌属（Salmonella），或检测生物学样品中 的沙门氏菌属（Salmonella）的方法的用途。

【发明概述】

本发明包含旨在用于检测或定量沙门氏菌属（Salmonella）株的 PNA探针，试剂，方法和试剂盒。

此处描述的PNA探针允许通过键合rRNA，对应于rRNA（r） 的基因组序列，或它们的互补序列来特异性检测沙门氏菌属 （Salmonella）。

PNA探针（关于DNA探针）的更高特异性允许相关的核苷酸序 列之间的更佳区别。

此与此探针具有特定关联，由于有一些与沙门氏菌属 （Salmonella）系统发生地相关的微生物，其在选择的靶区之内存在 仅一个错配（本发明描述的探针的第14位的核苷酸）。此情况的一些 例是志贺菌属（Shigella）物种，小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia   enterocolitica）物种和大肠埃希氏菌（Escherichia coli）K12株。

本发明中描述的PNA探针具有15个核苷酸，具有以下核苷酸序 列：

SEQ ID NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’。

但是，待用于检测的探针可与上述序列存在至少86%的同一性。

将此探针应用于通过荧光原位杂交（FISH）分析，其在沙门氏菌 属（Salmonella）-阳性样品的情况中，导致通过荧光显微镜检或通过 流式细胞术可检测的荧光信号的发射。

依经验使用特定软件进行新PNA-FISH探针的开发。起初通过靶 向微生物的rDNA序列与相关的微生物的序列的比对进行探针序列的 选择。此允许潜在地有用的区的鉴定，然后基于其他参数诸如特异性， 杂交温度，鸟嘌呤/胞嘧啶的百分率，键合自由能和二级结构对其评价。

探针设计及合成之后，不得不开发FISH过程，固定/渗透化，杂 交和洗涤的3个步骤，及就选择的探针进行优化。此过程通常涉及以 下参数：温度，甲酰胺和乙醇浓度，及杂交及洗涤时间。重要的是注 意到，由于处理复杂性和大量的变量，不是总是可能开发对于各序列 的方法，由此，常常测试几种替代品和序列。

良好-成功的杂交然后允许通过荧光显微镜检，流式细胞术或实时 PCR推知微生物的存在/缺失和甚至浓度。检测的荧光信号通常是小 探针与存在于细菌细胞质中的几十个或几百个rRNA拷贝特异性结合 的结果。报道由探针和靶形成的稳定的复合物的存在的探针的该可检 测的级分选自以下基团之一：缀合物，分支的检测系统，生色团，荧 光团，放射性同位素，酶，半抗原或发光化合物。

本发明中描述的方法包括样品和与之前描述的具有类似序列的至 少一种PNA探针的接触。因而，与用于检测沙门氏菌属（Salmonella） 的基于表型特征和需要几天来产生结果的常规方法相反，分析基于具 有确定的结果的单测试。

仍是本发明的对象的是适合用于进行测试以检测，即，发现，鉴 定或测量存在沙门氏菌属（Salmonella）的生物学样品的试剂盒。试 剂盒包含PNA探针和进行原位杂交测试需要的其他选择的试剂或化 合物。

在更可优选的实现中，适合用于进行用于检测，鉴定或定量沙门 氏菌属（Salmonella）的测定的试剂盒包含额外地固定，杂交和洗涤 溶液。

优选地，方法旨在为用于治疗性决定和质量控制的诊断佐剂。由 此，此用于沙门氏菌属（Salmonella）鉴定的方法的实施会允许对细 菌的充足的临床处理和污染来源的早期鉴定。

PNA探针可直接应用于在载玻片上制备的样品，由于这些探针的 应用不涉及在杂交之前用于细胞膜渗透化的试剂或酶的使用。但是， 需要杂交中常使用的一些化合物。

因此，探针正常包括进更用户-友好的试剂盒中。

如果需要方法涉及通过流式细胞术的PNA FISH分析，可使用相 同的杂交化合物将探针应用于悬浮液中的样品。

【定义】

（a）如本文所用，术语"核苷酸"包括使用与核酸相关的技术的 人员通常知道的天然的和人工分子，由此产生特异性结合核酸的聚合 物；

（b）当使用的术语"核苷酸序列"与含有亚基的聚合物段所指相 同，在此情况中是核苷酸；

（c）术语"靶序列"指称旨在在测试中检测的沙门氏菌属 （Salmonella）的核苷酸序列，其中探针的核苷酸的部分被设计为杂 交；

（d）术语"PNA探针"指称具有核苷酸序列且对于与目标微生物 的靶序列杂交特异性的PNA的亚基的聚合物。PNA分子是带负电的 糖-磷酸主链结构被由重复的N-（2-氨基乙基）甘氨酸单元形成的手性 和电中性取代的DNA模拟物；

（e）当使用术语"可检测的级分"时，其指称可连接于探针，由 此致使探针由仪器或方法可检测的分子；

（f）术语"样品"指称可含有用于检测的微生物或靶序列的任何生 物学样品。样品可为临床（例如血,尿,粪便,等），食品（例如肉,卵, 婴儿配方,乳,等）或环境（例如水）。

【附图说明】

图1代表用于探针选择的23S rRNA序列的部分比对。在比对之 上显示SalPNA1873探针的互补序列，并也标记多态位置。

【发明详述】

【PNA探针设计】

为了鉴定潜在地有用的寡核苷酸以用作探针，选择在National  Centre for Biotechnology Information（NCBI）网站 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）可利用的17种23S rRNA基 因序列。此选择含有10种沙门氏菌属（Salmonella）序列，包括各7 个亚种的代表性的株，及来自属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的 相关的物种的7种其他株（图1）。使用在欧洲生物信息学学会（EBI） 可利用的ClustalW软件比对序列，并选择目标区。鉴定6个潜在地有 用的区，然后在NCBI（BLAST软件）及在SILVA rRNA数据库计 划（软件Probe Check）测试，以便发现具有检测的最高数的沙门氏 菌属（Salmonella）序列及检测的最低数的非-沙门氏菌属（Salmonella） 序列的探针。也使用其他标准用于探针选择，诸如：高鸟嘌呤/胞嘧啶 百分率；二级结构和杂交温度的类型。

在NCBI数据库中仅1个18bp的区呈现能检测全部沙门氏菌属 （Salmonella）株。对于此区，设计4种可能的探针。选择这些之一， 由于其未与任何非-沙门氏菌属（Salmonella）序列杂交，且其含有60% 的GC碱基。根据提及的选择标准，选择的序列是： 5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3’。此序列在肠沙门氏菌肠亚种伤寒血清 型变种（S.enterica subsp.enterica serovar Typhimurium）LT2（ATCC 43971）株，登录号No.U77920的第1873和1887位的23S rRNA之 间杂交。探针根据在株LT2中靶序列的初始位置命名为SalPNA1873。

随后，合成选择的序列，并将寡核苷酸，在N末端，附接到荧光 色素Alexa Fluor594。

【PNA探针性能的理论评估】

在探针设计之后，通过测定灵敏度和特异性的理论值来评价其性 能。这些参数用以上提及的在rRNA SILVA数据库可利用的软件 ProbeCheck评价。对于此理论估计，考虑了数据库中全部101种沙门 氏菌属（Salmonella）序列（仅包括具有至少1,900bp的良好-质量序 列）。将探针与存在于对于大RNA亚基（LSU,23S/28S）的数据库的 总11,124个序列比对。也针对对于小亚基（SSU,16S/18S）的数据库 测试，以评定与16S rRNA序列可能的交叉杂交的存在。特异性计算 为nS/(TnS)×100，其中nS代表未与探针反应的非-沙门氏菌属 （Salmonella）株的数，和TnS是检查的非-沙门氏菌属（Salmonella） 株的总数。灵敏度计算为S/(TS)×100，其中S代表由探针检测的沙门 氏菌属（Salmonella）株的数，和TS是存在于数据库中的沙门氏菌属 （Salmonella）株的总数。

搜索确认，探针SalPNA1873仅检测数据库中存在的101种沙门 氏菌属（Salmonella spp.）物种序列。因此，获得100%的理论特异性 和灵敏度（表1）。

为了比较此研究中开发的探针与早先开发的探针，测试探针的理 论特异性和灵敏度：

●Sal23S10(Perry-O’Keefe等人，2001)－SEQ ID NO:6；

●Salm63（Kutter等人,2006）－SEQ ID NO:7；

●Sal3（Nordentoft等人,1997）－SEQ ID NO:8

也用ProbeCheck软件评定（表1）。

这些序列的理论评定显示，探针SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 和SEQ ID NO:8，分别检测沙门氏菌属（Salmonella）的95，73和 96个序列，数据库中存在的101株，其对应于94%，72%和95%的 灵敏度值。关于检测的非-沙门氏菌属（Salmonella）序列的数，SEQ ID  NO:1和SEQ ID NO:8未检测任何序列，不像SEQ ID NO:6和SEQ  ID NO:7。这些值允许估计100%（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:8）， 98.13%（SEQ ID NO:6）和99.97%（SEQ ID NO:7）的特异性。

进行的理论评估显示，探针SalPNA1873改善沙门氏菌属 （Salmonella）的检测主要由于2方面：此文献中描述的探针的PNA 分子的优势和特异性和灵敏度值。对于探针sal3和Salm63，PNA分 子使得FISH过程相比DNA FISH过程更容易和更快，而无既有的 PNA探针超过对于探针SalPNA1873获得的特异性和灵敏度的理论 值。

表1：用于检测沙门氏菌属（Salmonella spp.）物种的既有探针的 理论特异性和灵敏度

*在数据库中存在的总共101个沙门氏菌属（Salmonella）序列中 检测的沙门氏菌属（Salmonella）株。

#在数据库中保藏的总共11,023个非-沙门氏菌属（Salmonella） 序列中检测的非-沙门氏菌属（Salmonella）株。

本发明的PNA探针包含优选15个核苷酸，且可与序列SEQ ID  NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’具有至少86%同一性，优选 与SEQ ID NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’具有87%， 88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%,96%，97%，98%， 99%，100%的相似性。

或者，本发明也涵盖探针的核苷酸序列的变异。该变异可包括缺 失，插入，其中。例如以下序列之一：

●SEQ ID NO:2－5’-TCA GGA GCT TCG CTT-3’；

●SEQ ID NO:3－5’-GGA GCT TCG CTT GCG-3’；

●SEQ ID NO:4－5’-TCA GGA GCT TCG CTT GC-3’；

●SEQ ID NO:5－5’-AGG AGC TCC GCT TGC-3’。

【PNA探针的可检测的级分】

不限于下列实施例，PNA探针的可检测的级分可包括各种类型的 分子，尤其诸如葡聚糖缀合物，生色团，荧光团，放射性同位素，酶， 半抗原，化学发光化合物。

作为一例，在可优选使用的那些荧光团类之中是(但不限于)： Alexa系列荧光团，Alexa Fluor系列，花青苷，5-（及-6）羧基-2',7'- 二氯荧光素，5-ROX（5-羧基-X-若丹明），三乙基铵盐。

【方法】

本发明提供测定沙门氏菌属（Salmonella）的存在的方法，其使 用与此处描述的15个核苷酸的区-SEQ ID NO:1具有至少86%的同源 性的核苷酸序列。

方法可包括使具有本文所述的PNA探针的样品在适当的杂交条 件或适当的原位杂交条件下与细菌靶序列接触（如显示于实施例1）。

方法可分为：样品制备（其在必需时包括富集步骤），固定，杂 交，洗涤和结果的可视化（见实施例1）。

方法可对粘附的或悬浮的细胞实施。

【杂交条件-优化】

以下步骤是杂交条件的可能的优化，无对本发明的限制：

有影响PNA探针和靶序列的杂交的几种因素。这些包括：甲酰胺 （或其他变性化学试剂）的百分率，盐浓度和因而离子强度，杂交温 度，去污剂浓度，pH和其他。

为了测定最佳杂交条件，个别修改不同因素和变化各因素直到达 到期望的辨别程度可为必需。

更近靶序列来自样品中的另一非-靶，需要更大严格度程度以限定 影响杂交的各种因素。

在本发明中，非-靶序列，诸如志贺菌属（Shigella）物种，可相 比靶序列具有仅1个不同核苷酸，及像这样增加的水平的区别是避免 非特异性杂交必需的。

对于此文献中描述的探针，检测了以下条件：

●53℃和59℃之间的杂交温度。对于在载玻片中的杂交和在悬浮 液中的杂交，于57℃获得最强荧光信号。

●使用50%和80%之间的乙醇浓度的固定步骤，但在信号强度中 未观察到差异。

●测试了杂交时间（30,45,60和90min），但较短时间和更长一 样有效。

在以上所述的全部参数的优化之后，发现导致更强荧光信号的方 法如下：

在专用的载玻片中制备各细菌培养涂片用于荧光显微镜检观察。 然后涂片是：

●浸入4%（wt/vol）多聚甲醛（Sigma）10分钟，之后是50% （vol/vol）乙醇，也持续10分钟；

●将样品风干，然后用20μl的含有下列成分的杂交溶液覆盖：10% （wt/vol）硫酸葡聚糖（Sigma）；10mM NaCl（Sigma）；30%（vol/vol） 甲酰胺（Sigma）；0.1%（wt/vol）焦磷酸钠（Sigma）；0.2%（wt/vol） 聚乙烯吡咯烷酮（Sigma）；0.2%（wt/vol）Ficoll（Sigma）；5mM EDTA 二钠（Sigma）；0.1%（vol/vol）Triton X-100（Sigma）；50mM Tris-HCl （pH7.5;Sigma）和200nM的PNA探针；

●将样品用盖玻片覆盖，其放进小湿盒，避光及于57℃温育30分 钟；

●然后，将盖玻片移出，并将载玻片浸入预加温的含有下列成分 的洗涤溶液（57℃）：5mM Tris碱（Sigma），15mM NaCl（Sigma） 和1%（vol/vol）Triton X-100（pH10;Sigma）。

●也于57℃进行洗涤步骤30分钟。随后，从洗涤溶液除去载玻片， 及在相同的温育器中于57℃干燥约5分钟。

●显微镜观察之前，放置一滴非-荧光浸没油（Merck），并用盖 玻片覆盖。在显微镜检之前将载玻片在暗处存储最多24小时。

杂交也可在悬浮液中进行。在一些情况中，此过程辅助几乎完全 消除自体荧光，即红细胞的自体荧光，在血样品的情况中，及婴儿配 方中蛋白的自体荧光。在此情况中，将在无菌水中均质化的培养物离 心（10,000×g持续5分钟），并将沉淀在500μl 4%多聚甲醛中均质化。 在1小时之后，将细胞再离心一次，以便移出多聚甲醛，并将沉淀在 500μl的50%（vol/vol）乙醇中均质化。于-20℃温育30min后，将细 胞在100μl的具有200nM PNA探针的杂交溶液中再一次均质化，并 于57℃温育30min。杂交之后，将细胞离心及在500μl的洗涤溶液中 均质化（如上所述），并于57℃温育30min。最终，将细胞离心，以 移出洗涤溶液，并在500μl的无菌水中均质化。接下来，将20μl的细 胞悬浮液在适合于荧光的显微镜载玻片上扩展，或将200μl通过膜（孔 径0.2μm,硝酸纤维素,Whatman）过滤。

为了检查获得的信号与自体荧光不相关，将全部样品用显微镜中 可利用的其他滤器观察。将样品也同时用DAPI染色，以确认存在于 样品的全部细胞用探针SalPNA1873－SEQ ID NO:1（本发明中描述 的）标记。而且，在各测定中进行阴性对照，跟随方法全部步骤，但 不将探针添加到杂交溶液。

【探针实验特异性和灵敏度的测试】

一旦杂交方法被完全优化，测试PNA探针的特异性和灵敏度的实 验值。

对此，将过程应用于61种代表性的沙门氏菌属（Salmonella）株 （属于2种沙门氏菌属（Salmonella）物种及6种肠沙门氏菌（S. enterica）亚种）及46种其他株。后来的株包括属于相同的家族的25 种分类学上相关的株（志贺菌属（Shigella），克雷伯菌属（Klebsiella）， 柠檬酸杆菌属（Citrobacter），泛菌属（Pantoea），耶尔森菌属（Yersinia）， 肠杆菌属（Enterobacter），埃希氏菌属（Escherichia）和沙雷氏菌属 （Serratia））和属于不同目（假单胞菌属（Pseudomonas）），纲（螺 杆菌属（Helicobacter）和弯曲菌属（Campylobacter）），或甚至门（利 斯特菌属（Listeria）和葡萄球菌属（Staphylococcus））的21株。除 了未被SalPNA1873－SEQ ID NO:1检测的肠沙门氏菌VI亚种（S. enterica subsp.VI）之外，检测全部其余59个沙门氏菌属（Salmonella） 株，然而对于使用的其他物种未观察到杂交。对于3种志贺菌属 （Shigella）物种不可能评定PNA-FISH结果，由于在阳性和阴性（无 探针）样品中检测到的这些株的强自体荧光信号。此结果无关于探针 和志贺菌属（Shigella）物种之间的仅1个核苷酸的差异，因为弗氏志 贺菌（Shigella flexneri），其具有类似RNA序列，未与探针杂交。而 且，其他物种诸如小肠结肠炎耶尔森菌（Y.enterocolitica）及大肠埃 希氏菌（Escherichia coli）K-12也在相同的位置具有精确地仅1个错 配，且未观察到交叉-反应。此结果支持来自其他作者的观察，这些作 者说到PNA探针允许区别具有仅1个核苷酸错配的序列（Petersen等 人,2004）。基于这些结果，获得100%的实验特异性和96.7%的灵敏 度。

【富集】

可尤其从食品，活组织检查，血，水，粪便得到待分析的样品。

含有沙门氏菌属（Salmonella）的样品通常呈现低污染水平。因 为此，建议了辅助检测过程的富集步骤。此富集步骤可使用几种类型 的培养基进行，用于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和/或沙门氏菌属 （Salmonella）的从富含复合物的培养基到选择性培养基。温育温度 可依赖于选择的培养基，及建议的温育时间应为8～24小时。

在4种不同类型的样品：水，粪便，婴儿配方和血中测试本发明 中描述的PNA探针。将样品根据各类型的样品的分析中通常使用的方 法富集。在水和粪便样品的情况中，如国际标准化组织（ISO）所建 议，使用缓冲的胨化的水（BPW）进行第1预富集步骤（16～18小时）。 此富集之后，探针允许全部测试的样品中的检测沙门氏菌属 （Salmonella），而结果与通过对于这些样品建议的ISO方法（对于 粪便和水样品，分别为ISO 6579:2002（检测食品和动物饲料中的沙门 氏菌属（Salmonella））和ISO 6340:1995（水质量-检测和枚举沙门氏 菌属（Salmonella）））获得的那些一致。

在婴儿配方的情况中，如之前对于检测相同的类型的样品中的阪 崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）推荐的，将后者溶于水（1:10）及 于37℃温育8小时。在血样品的情况中，在血培养中通常使用的培养 基（TSB-胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤）中于37℃进行富集16～18小 时。富集之后，在载玻片或悬浮液中进行细菌检测。杂交之前，样品 应在蒸馏的无菌水中1:10稀释，以便最小化一些组分（例如婴儿配方 或红细胞的蛋白）的自体荧光的干扰。使用本发明中描述的PNA探针， 含有沙门氏菌属（Salmonella）的全部样品是阳性。

这些实验显示，使用此PNA探针的检测方法通常能在不同类型的 样品中在小于20小时内检测沙门氏菌属（Salmonella）。而且显示， 可通过进行仅8小时的富集步骤来检测含有仅1CFU/ml的样品。

尽管已测试用于各类型的样品的建议的富集培养基，标准化富集 步骤是可能的。几个作者已显示，可将缓冲的胨化的水（BPW）用作 富集含有沙门氏菌属（Salmonella）的样品，甚至对于具有高水平的 竞争微生物的样品的通用培养基。

将此方法与就上述样品使用的常规方法比较，显示，PNA样品的 实施可节省沙门氏菌属（Salmonella）细菌的检测至少3天。

在固体和紧凑样品的情况中，应使这些经历用平刀片冲击的机械 过程，其解离样品，将细菌释放到缓冲的胨化的水。在活组织检查的 情况中，将样品切成3～5μm片，放置在载玻片上，并无需富集步骤 而直接杂交。

用于检测沙门氏菌属（Salmonella）开发的多数方法基于PCR技 术或基于选择性培养基。而前者在技术上有更多需求，且通常也涉及 富集步骤以改善检测限；后者是耗时的且可给出不精确的结果（12,34, 38）。此工作中提供的PNA-FISH流程相比PCR方法技术上要求较 少，且相比培养方法更快和更精确。尽管需要富集步骤，获得结果需 要的总时间小于20h（除了PIF,其耗时仅12h），相比对于基于PCR 的方法报道的那些（9,12,35,39），值类似或甚至更佳。

此处描述的方法，对于沙门氏菌属（Salmonella）探针，及甚至 对于PCR和ELISA流程，展示为是目前使用的基于培养的技术的可 靠的替代方法。其显示，相比常规培养技术，此处描述的PNA探针允 许在检测中节省3天，相比之前描述的探针，无论它们是DNA或PNA， 呈现更高特异性（见表1），且未受在一些分子方法，即PCR中发挥 抑制物的作用的物质的存在的影响。

【结果的可视化】

此步骤可在具有对于使用的荧光团敏感的滤光片的任何落射荧光 显微镜中进行。存在于显微镜的不能检测探针的荧光信号的其他滤光 片用于确认自体荧光的缺失。

【试剂盒】

本发明也涉及允许测试来自沙门氏菌属（Salmonella）的细菌的 存在的试剂盒。

本发明的试剂盒包含与SEQ ID NO:1具有至少86%同一性的 PNA探针和选择用于进行测试的另一试剂或组合物。

本发明的PNA探针，其特征，方法和试剂盒是适合于在靶生物内 部存在或不存在的核酸序列的分析。像这样，本发明可用于，生物分 析或提取自或源于目的生物的核酸的分析，暗示靶序列的来源不是对 本发明的限制。

下列实施例例证用于实施本发明的不同情况和几个步骤，是本发 明的优选的实施方式，不旨在限制它们之中的任何：

【实施例】

【实施例1：在不同样品（临床,食品或环境样品）中属于沙门氏 菌属（Salmonella）的细菌的检测】

【序列】

SEQ ID NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’（偶联于Alexa  Fluor 594）

【样品制备】

在应用PNA探针之前，使临床，食品或环境样品之前经历富集步 骤。此发生，因为通常沙门氏菌属（Salmonella）呈现低污染水平。 此富集步骤可使用对于用于各样品的常规分析方法建议的培养基进 行。在食品，动物饲料，粪便或水的情况中，使用BPW。对于粉末化 的乳或婴儿配方，使用无菌水来以1/10（重量/vol）比溶解粉。对于 血样品，使用复合TSB培养基，通常用于血培养物。

于37℃，以120rpm跨8（乳粉和婴儿配方）和16～18小时（粪 便,水,血,等）之间的温育时间。对于不同样品类型的同时分析，建 议的是，将使用的方法通过于37℃，120rpm在BPW中进行富集8 小时来标准化。在阴性结果的情况中，在8小时的温育之后，应在过 夜富集（16～18小时）之后重复PNA FISH分析。富集步骤之后，将 一滴培养基放入适合用于荧光的载玻片。将载玻片在温育器炉中于 57℃放置约5分钟，或使风干。不需要富集步骤的样品应在固定步骤 中起始过程。

【固定】

为在杂交过程期间防止23S rRNA的损失，将样品浸入4%多聚 甲醛（wt/vol）和50%乙醇（vol/vol）的溶液各10分钟。

【杂交】

固定之后，然后将样品用一滴含有下列成分的杂交溶液覆盖：10% （wt/vol）硫酸葡聚糖（Sigma）；10mM NaCl（Sigma）；30%（vol/vol） 甲酰胺（Sigma）；0.1%（wt/vol）焦磷酸钠（Sigma）；0.2%（wt/vol） 聚乙烯吡咯烷酮（Sigma）；0.2%（wt/vol）Ficoll（Sigma）；5mM EDTA 二钠（Sigma）；0.1%（vol/vol）Triton X-100（Sigma）；50mM Tris-HCl （pH7.5;Sigma）；及200nM PNA探针。将样品用盖玻片覆盖（为 了保证探针的均质扩展），放置进小湿盒（为了防止杂交溶液的蒸发）， 避光及于57℃温育30分钟。

【洗涤】

杂交时间之后，将盖玻片移出，并将载玻片浸入于57℃预加温的 含有5mM Tris碱，15mM NaCl和1%（vol/vol）Triton X-100（pH10） 的洗涤溶液。然后将样品放进炉，于杂交温度持续30分钟。随后，从 洗涤溶液除去载玻片，并在相同的温育器中，于57℃干燥约5分钟。 在显微镜可视化之前，放置一滴非-荧光浸没油（Merck）及用盖玻片 覆盖。在显微镜检之前，在暗处保持载玻片24小时的最大时期。

【结果】

通过在具有能检测键合到PNA探针的荧光色素Alexa Fluor 594 的滤光片的荧光显微镜中观察来获得结果。

【实施例2：婴儿配方中沙门氏菌属（Salmonella）和克罗诺杆菌 属（Cronobacter）细菌的检测】

此实施例例证将对于沙门氏菌属（Salmonella spp.）物种的探针 与之前在Almeida等人，2009中开发的对于克罗诺杆菌属 （Cronobacter spp.）物种的探针一起使用的可能性。这2个属在最近 被鉴定为粉末化的婴儿配方的最频繁的污染物，该污染是新生儿婴儿 中菌血症，脑膜炎及坏死小肠结肠炎的主要原因。这2种探针呈现非 常近似的杂交温度，且可在多重测定（同时利用几种探针）中容易使 用。

【序列】

SEQ ID NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’（偶联于Alexa  Fluor 594）

SEQ ID NO:6－5’-TGC AGG ATT CTC TGG-3’（偶联于Alexa  Fluor 488）

【样品制备】

将10g的各婴儿配方称重及与90ml的无菌水水合。可使用更高 量的婴儿配方，但保持比1/10（重量/vol）。随后，将水合的样品于 37℃和120rpm温育8小时。富集之后，取样品及1/10稀释，以最小 化来自婴儿配方蛋白的自体荧光的干扰。最终

将1滴稀释的样品放入适合的载玻片，并在温育器中于57℃风干 约5分钟。

【杂交】

如之前在实施例1中所述，仅有1个轻微差异，进行杂交。杂交 溶液含有2种探针：用于检测沙门氏菌属（Salmonella）的PNA探针 和用于检测克罗诺杆菌属（Cronobacter）的PNA探针，各为200nM 的浓度。

【洗涤】

根据实施例1中描述的过程进行洗涤。

【结果】

通过用装备用于检测连接到PNA探针的荧光色素Alexa Fluor 594和488的专用的滤光片的荧光显微镜观察样品来获得结果。

【参考文献】

●Almeida,C.,N.F.Azevedo,C.Iversen,S.Fanning,C.W. Keevil,and M.J.Vieira,2009.Development and application of a novel  peptide nucleic acid probe for the specific detection of Cronobacter  genomospecies(Enterobacter sakazakii)in powdered infant formula. Appl Environ Microbiol 75:2925-30.

●Perry-O'Keefe,H.,S.Rigby,K.Oliveira,D.Sorensen,H. Slender,J.Coull,and J.J.Hyldig-Nielsen,2001.Identification of  indicator microorganisms using a standardized PNA FISH method. Journal of Microbiological Methods 47:281-292.-Kutter,S.,A. Hartmann,and M.Schmid.2006.Colonization of barley(Hordeum  vulgare)with Salmonella enterica and Listeria spp.Fems  Microbiology Ecology 56:262-271.

●Nordentoft,S.,H.Christensen,and H.C.Wegener.1997. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide tide probe  targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in  paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in  bacterial smears.Journal of Clinical Microbiology 35:2642-2648.

●WO 02/27036 A2-Probes,probe sets,methods and kits  pertaining for the detection,identification and/or enumeration of  bacteria.

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.用于检测和/或定量沙门氏菌属（Salmonella）的PNA探针， 其特征在于，其包含与SEQ ID NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT  TGC-3’具有至少86%相似性的至少1个序列。

2.权利要求1的PNA探针，其特征在于，其包含以下序列中的 至少一种：

●SEQ ID NO:1－5’-AGG AGC TTC GCT TGC-3’；

●SEQ ID NO:2－5’-TCA GGA GCT TCG CTT-3’；

●SEQ ID NO:3－5’-GGA GCT TCG CTT GCG-3’；

●SEQ ID NO:4－5’-TCA GGA GCT TCG CTT GC-3’。

3.权利要求1的PNA探针，其特征在于，其能检测沙门氏菌属 （Salmonella）rRNA，rDNA或rRNA的序列互补中的靶序列。

4.权利要求1的PNA探针，其特征在于，其额外地包含与SEQ  ID NO:6－5’-TGC AGG ATT CTC TGG-3’具有至少86%相似性的 1个序列。

5.权利要求1～4之任一项的PNA探针，其特征在于，其被连接 于至少一种类型的可检测的级分。

6.权利要求5的PNA探针，其特征在于，探针的可检测的级分 的类型选自下列之一：缀合物，分支的检测系统，生色团，荧光团， 放射性同位素，酶，半抗原或发光化合物。

7.权利要求6的PNA探针，其特征在于，荧光基团是下列中的 至少一种：Alexa系列，Alexa Fluor系列的荧光团，花青苷，5-(及-6) 羧基-2',7'-二氯荧光素，5-ROX（5-羧基-X-若丹明,三乙基铵盐）。

8.用于检测沙门氏菌属（Salmonella）的试剂盒，其特征在于， 其包含权利要求1～7之任一项中描述的探针中的至少一种。

9.权利要求8的试剂盒，其特征在于，其还包含以下溶液中的至 少一种：一种固定溶液，一种杂交溶液及一种洗涤溶液。

10.权利要求9的试剂盒，其特征在于，固定溶液包含多聚甲醛 和乙醇，即2～8%（wt/vol）的多聚甲醛和25～90%（vol/vol）的乙 醇。

11.权利要求9的试剂盒，其特征在于，杂交溶液包含甲酰胺。

12.用于检测沙门氏菌属（Salmonella）的方法，其特征在于， 其使用权利要求1～7中描述的PNA探针，且其包括以下步骤：

（a）PNA探针与生物学样品接触；

（b）PNA探针与存在于所述的样品中的微生物的靶序列杂交；

（c）作为指示所述的样品的所述的检测和定量的杂交检测。

13.权利要求12的方法，其特征在于，生物学样品源于血，空气， 食品，水或活组织检查。

14.权利要求12的方法，其特征在于，杂交由荧光发生。

15.权利要求1～7之任一项中描述的PNA探针的用途，其特征 在于，其应用于检测生物学样品中的沙门氏菌属（Salmonella spp.） 物种的方法。

16.权利要求8～11之任一项中描述的试剂盒的用途，其特征在 于，其应用于检测生物学样品中的沙门氏菌属（Salmonella spp.）物 种。