γ-聚麸胺酸类眼科手术冲洗液

摘要

本发明公开了一种含量足以冲洗患者眼部组织的眼科手术冲洗液，其包括：a)增加该冲洗液黏度的有效量γ-聚麸胺酸(γ-PGA)和/或其盐类；以及b)一用于γ-PGA和/或其盐类的眼部可接受水性载体，用以冲洗患者的眼部组织。本发明还公开一种眼科手术冲洗液及医药套组，以降低眼科手术期间压力对眼部组织引发的伤害。

说明书

技术领域

本发明涉及一种眼科手术溶液，特别是一种眼科手术冲洗液。

背景技术

冲洗液常被广泛用于如晶体乳化术(phacoemulsification)、玻璃体切除 术(vitrectomy surgery)及青光眼手术(glaucoma surgery)的眼科手术过程中。 晶体乳化术是一种摘除眼内混浊晶体(称之为白内障)的手术。玻璃体切除 术是一种将部份或全部玻璃状液(vitreous humor)从眼睛移除的手术。青光 眼手术则涉及激光治疗或于眼球中形成切口，以降低眼压。根据台湾健康 保险局报导指出，台湾每年进行约150,000次的眼科手术。眼科手术的效 果与所使用的冲洗液息息相关。不适宜的冲洗液可能会对角膜或晶体造成 伤害，因而导致视力变差、产生盲点、甚至失明。

理想的冲洗液应当具有接近水样液(aqueous humor)的组成及290 mOsm至500mOsm间的渗透压(osmolarity)。冲洗液的主要功能是用来维 持内皮细胞完整性、角膜厚度及视网膜组织。此外，适宜的冲洗液应可于 白内障手术期间保存角膜内皮细胞活性，提供能量来源(即葡萄糖)，维持 适当机能及电解质浓度，并保护角膜内皮细胞避免pH值波动。

平衡盐溶液及BSS已常用于眼内冲洗。BSS的组 成与水样液组成相近。BSS基本上具有四部份组成：1)足量缓冲剂 (即碳酸氢钠)，2)能量来源(即葡萄糖)，3)于7至8间的稳定pH值(即HEPES)， 4)抗氧化剂(即麸胱甘肽，glutathione)。然而，该些眼内冲洗液无法对眼科 手术中最容易受到物理性伤害的角膜(内皮)细胞提供有效充分的保护。研 究指出，复杂的眼科手术(如晶体乳化术)可能会导致严重的并发症。导致 并发症的部分可能因素包括：超音波的机械性作用、未吸出的晶体碎片导 致的物理性伤害、冲洗液导致热产生甚至渗透不正常。这些因素皆可能对 角膜内皮细胞造成伤害，甚至有导致不可回复的水泡性角膜病变(bullous  keratopathy)的风险。

因此，本领域迄今仍有上述缺失及不足尚须解决，尤需发展一种对眼 内组织，尤其是角膜(内皮)细胞，具有较佳保护功能的眼科手术冲洗液。

发明内容

本发明的一种实施方式是一种含量足以冲洗患者眼部组织的眼科手 术冲洗液，其包括：a)增加该冲洗液黏度的有效量γ-聚麸胺酸(γ-PGA)和/ 或其盐类；以及b)一用于γ-PGA和/或其盐类的眼部可接受水性载体，用 以冲洗患者的眼部组织。

本发明的一种实施方式是一种眼科手术冲洗液，其包括：a)增加该冲 洗液黏度的有效量γ-聚麸胺酸(γ-PGA)和/或其盐类；以及b)一用于γ-PGA 和/或其盐类的眼部可接受水性载体。

本发明的再一种实施方式是一种医药套组，其包括：a)如上述的眼科 手术冲洗液；以及b)一说明书(package insert)，其包含印制成的使用指南， 以说明冲洗患者眼部组织的用法。

本发明的再一种实施方式是一种含量足以于眼科手术期间冲洗患者 眼部组织的眼科手术冲洗液，其包括：a)增加该冲洗液黏度的有效量γ- 聚麸胺酸(γ-PGA)和/或其盐类；以及b)一用于γ-PGA和/或其盐类的眼部 可接受水性载体，用以眼科手术期间降低压力对患者眼部组织所引发的伤 害。

附图说明

图1A至1C显示了γ-PGA及右旋糖浓度对冲洗液渗透压的影响；

图2是γ-PGA影响冲洗液渗透压的附图；

图3是γ-PGA影响冲洗液折射率的附图；

图4A-4B显示γ-PGA对细胞生长无显著的影响，(A)牛角膜内皮细胞， (B)人类视网膜色素上皮细胞；

图5A-5B显示γ-PGA对细胞无显著的毒害影响，(A)牛角膜内皮细胞， (B)人类视网膜色素上皮细胞；

图6-7显示染剂染色细胞的显微照片，于荧光显微镜下同时观察含有 或未含γ-PGA培养后的存活细胞及死亡细胞，(6A)培养1天的牛角膜内皮 细胞，(6B)培养1天的牛角膜内皮细胞，(7A)培养1天的人类视网膜色素 上皮细胞，(7B)培养3天的人类视网膜色素上皮细胞，负控制组：氧化铝 (Al₂O₃)萃取培养液；正控制组：含Triton x-100(0.1％)的DMEM/F12培养 液；

图8A显示两支静脉留置针插入兔眼中；

图8B显示借助蠕动泵浦进行冲洗液灌注；

图9显示眼部冲洗期间的角膜厚度变化图。

具体实施方式

下述优选实施例配合附图可使该些及其他实施方式更为清楚，但也可 在不悖离本发明的新颖概念精神及范畴下进行变化及修饰。

附图可说明本发明一种以上具体实施例，且配合文字叙述，可解释本 发明原则。全部附图尽可能使用相同元件符号来代表一具体实施例中相同 或相似元件。

基于本发明背景及每一用词使用的特定背景，使用于本说明书的用词 通常具有本领域中的一般含义。用于描述本发明的某些用词会在下文或说 明书其他地方叙及，以额外引导实施者了解本发明内容。为方便起见，文 中会使用如斜体和/或引号来突出显示某些用词。使用这些突出显示并不会 对用词范围及含义造成影响，无论用词是否被突出显示出来，相同背景下 的用词范围及含义是相同的。相同事物可通过一种以上的方式来叙述。因 此，此处所叙及的一或多个用词可能会使用另一种语言及同义词来表示， 无论是否对用词加以阐述或讨论，其也不会有任何特别的含义。本文会提 供某些用词的同义词。举出的一或多种同义词并不排除使用其他同义词的 可能。本案说明书任何地方所举出的举例，包含此处叙及的任何用词，只 是作为说明用，不应局限本发明或示例性用词的范畴或含义。同样地，本 发明并不限于本案说明书所举的各种具体实施例。

除非有其他定义，否则此处所使用的技术及科学用词含义与本发明所 属技术领域中具有通常知识者一般理解的含义相同。若有所差异，则本文 (包括定义)会载明。

此处使用的“大约”、“大略”或“接近”一般意指所提供值或范围的 20％内，优选为10％内，更优选为5％内。此处所提供的数值为接近值， 亦即，若未特别载明，则表示其为“大约”、“大略”或“接近”。

当叙及数值或范围时，本领域具有通常知识者可了解，其意指包含对 本发明相关特定领域而言适当合理的范围。

就0.32至50厘泊黏度而言，其代表本发明已具体揭露该范围中的所 有百分之一、十分之一及整数单位值。因此，0.32、0.33、0.34、…、0.7、 0.8、0.9、1、2、3、4、…、47、48、49及50厘泊单位值皆包含于本发明 的具体实施例中。

就290至320mOsm渗透压而言，其代表本发明已具体揭露该范围中 的所有整数单位值。因此，290、291、292、…、317、318、319及320mOsm 单位值皆包含于本发明的具体实施例中。

就1.330至1.344折射率而言，其代表本发明已具体揭露该范围中的 所有千分之一单位值。因此，1.330、1.331、1.332、…、1.340、1.341、1.342、 1.343及1.344单位值皆包含于本发明的具体实施例中。

就10,000至2,000,000道尔顿(Daltons)分子量而言，其代表本发明已 具体揭露该范围中的所有整数单位值。因此，10,000、10,001，10,002、…、 1,999,997、1,999,998、1,999,999及2,000,000道尔顿单位值皆包含于本发 明的具体实施例中。

就0.2～1％(重量/体积，w/v)而言，其代表本发明已具体揭露该范围中 的所有十分之一及整数单位值。因此，0.2、0.3、0.4、…、0.7、0.8、0.9 及1％单位值皆包含于本发明的具体实施例中。

在此所使用的“γ-PGA”一般意指“γ-聚麸胺酸和/或其盐类”或“γ- 聚麸胺酸酯(gamma-polyglutamate)”。聚麸胺酸具有2个羧基。其中一个γ- 羧基与α-胺基连接，形成PGA。

可交替使用γ-聚(麸胺酸)及γ-聚麸胺酸(γ-PGA)用词。

在此所使用的“增加冲洗液黏度的有效量”一般意指，相较于未添加 γ-PGA的冲洗液黏度，γ-PGA的存在使冲洗液黏度增加。

交联聚麸胺酸是由数千万分子量的网状结构所组成。相较于PGA，交 联PGA具有较高的吸水力。交联聚麸胺酸分子量大于10,000,000。

在此所使用的“水性生理可接受溶液”一般意指，但不限于，无菌食 盐或无菌缓冲溶液。

在此所使用的“抗氧化剂”一般意指，可减缓或避免其他分子氧化的 分子。抗氧化剂包括，但不限于，麸胱甘肽(glutathione)、维他命C及维他 命E。

渗透作用是溶剂分子穿过选透膜进入高溶质浓度区域的移动，俾使两 侧的溶质浓度相等。溶剂的净移动方向是由较低浓度溶液(低渗透溶液)往 较高浓度溶液(高渗透溶液)。可通过使高渗透溶液的压力相对于低渗透溶 液来的高，以逆转该作用。渗透压是指维持平衡的压力，使溶剂无净移动 现象。渗透压取决于溶质的莫耳浓度而非溶质本身。渗透作用于生物系统 中是极为重要的，许多生物膜具有半透性。

渗透压(osmolarity)为溶质浓度的度量单位，其定义为每公升(L)溶液的 溶质渗透莫耳数(osmols，Osm)(即osmol/L或Osm/L)。溶液的渗透压通常 表示为Osm/L。渗透压是测量每单位体积溶液的溶质渗透莫耳数。

本发明发现，使用黏弹性材料聚-γ-麸胺酸(γ-PGA)作为冲洗液中的额 外成分，可减少眼部手术所造成的伤害。于晶体乳化及吸除(PEA)期间， 分散性黏弹性材料可对眼内组织发挥保护的正面效果。黏弹性材料可降低 眼睛前房及后房内的扰动，协助控制眼内组织碎片及气泡移动。此外，此 类黏弹性材料有助于移除晶体碎片，使外科医生更易通过外科手术用手持 用具的尖端找到碎片。

聚-γ-麸胺酸(γ-PGA)，一种麸胺酸(GA)胺基酸的天然聚合物，可借助 数种细菌、古菌(archaea)及真核生物(eukaryote)来合成。

聚-γ-麸胺酸具有约10,000至2百万范围的分子量。其可被制成符合 不同应用的条件。已知有食品工业上的应用。γ-PGA是纳豆(一种日本传 统食物)黏液的主要组成份，其于1937年首次被Ivnovics发现存在炭疽杆 菌(Bacillus anthracis)的荚膜中。γ-PGA是一种特有的聚阴离子性聚合物， 其是由通过γ-酰胺键(于α-胺基与γ-羧基之间)连接的D form和/或L form 麸胺酸残基所构成。其为具有亲水性、黏滞性、生物可降解性及无毒的生 物材料。基于其特有的离子捕获及高吸水特性，其已被广泛用于各种应用 中，如金属螯合剂、吸收剂、防冻剂、老化抑制剂、药物载体及保湿剂。 过去几年，γ-PGA已被广泛使用作为生物材料，其具有细微膨胀性。其生 物兼容性增加于临床领域上的实用性，如生物胶、组织工程及药物传输系 统。

本发明发现γ-PGA可调整眼部可接受冲洗液的渗透压及黏度。眼科手 术冲洗液的适当渗透压及微黏性可降低并发症及角膜伤害。本发明涉及使 用γ-PGA作为眼部可接受冲洗液或手术溶液添加剂的用途，俾于需要冲洗 的手术期间保护眼睛前房及后房。

γ-PGA是作为调整渗透压并避免组织水肿的用剂。含有γ-PGA的眼部 可接受冲洗液渗透压范围为290～320mOsm。

高分子量(1020k道尔顿)γ-PGA可调整冲洗液黏度。理想黏度可降低 晶体乳化术造成的组织伤害。

目前有许多种不同的γ-PGA载体。然而，本发明的冲洗液载体具有较 佳性质时需包括电解质、缓冲剂(如碳酸氢盐、磷酸盐或其组合)及能量来 源。该些试剂有助于手术期间维持角膜组织的正常功能，促进术后视力快 速回复。然而，本发明对于平衡盐溶液或可能用来形成冲洗液的其他电解 质/营养物溶液种类并无限制。

本发明的一种实施方式是一种冲洗患者眼部组织的方法。该方法包括 下述步骤：将足量的眼科手术冲洗液引至患者的眼部组织，以冲洗患者眼 部组织，其中该冲洗液包括：a)增加该冲洗液黏度的有效量γ-聚麸胺酸 (γ-PGA)和/或其盐类；及b)一用于γ-PGA和/或其盐类的眼部可接受水性 载体。

本发明的另一种实施方式是一种眼科手术冲洗液，其包括：a)增加该 冲洗液黏度的有效量γ-聚麸胺酸(γ-PGA)和/或其盐类；及b)一用于γ-PGA 和/或其盐类的眼部可接受水性载体。

本发明的再一种实施方式是一种医药套组，其包括：a)如上述的眼科 手术冲洗液；及b)一说明书(package insert)，其包含印制成的使用指南， 以说明冲洗患者眼部组织的用法。

于本发明的一实施方式中，该冲洗液具有0.32至50、或0.32至30、 或0.32至3.93厘泊的黏度。

于本发明的另一实施方式中，该冲洗液具有每升290至320mOsm的 渗透压。

于本发明的另一实施方式中，该冲洗液具有0.32至50、或0.32至30、 或0.32至3.93厘泊的黏度，及每升290至320mOsm的渗透压。

于本发明的另一实施方式中，该冲洗液具有1.330至1.344的折射率。

于本发明的另一实施方式中，该冲洗液不包含交联聚麸胺酸，且不具 额外的聚胺基酸或聚合物。

于本发明的另一实施方式中，该眼部可接受水性载体包括一含有电解 质的平衡盐溶液、缓冲剂及能量来源。

于本发明的另一实施方式中，γ-PGA于该眼科手术冲洗液中的浓度范 围为0.2～1％或0.2～0.8％(w/v)。

于本发明的另一实施方式中，γ-PGA具有10,000至2,000,000道尔顿 或1,000,000至2,000,000道尔顿的分子量。

于本发明的再一实施方式中，该眼部可接受水性载体更包括一抗氧化 剂。

于本发明的又一实施方式中，该发明涉及一种降低眼科手术中压力对 患者眼部组织造成伤害的方法。该方法包括下述步骤：将足量的眼科手术 冲洗液引至患者的眼部组织，以冲洗患者眼部组织，其中该冲洗液包括： a)增加该冲洗液黏度的有效量γ-聚麸胺酸(γ-PGA)和/或其盐类；及b)一用 于γ-PGA和/或其盐类的眼部可接受水性载体。

于本发明的另一实施方式中，该眼科手术包括玻璃体切除术(surgical  vitrectomy)、白内障摘除术(cataract extraction)、晶体吸除术(lens aspiration)、 眼前段重建术(anterior segment reconstruction)及晶体乳化术 (phacoemulsification)。

实施例

本发明具体实施方式的示例性仪器、设备、方法及其相关结果如下所 述，其并不局限本发明的范畴。需留意的是，为方便读者理解，实施例可 能会使用标题或副标题，但皆不应局限本发明的范畴。此外，在此提出及 揭露的某些理论，无论对错与否，皆不应局限本发明的范畴，只要本发明 可据以实施即可，无需探讨任何特定理论或作用机制。

材料及方法

材料及试剂

若未特别注明，所有材料及试剂皆购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏 里州圣路易市)。聚-γ-麸胺酸(分子量为1020k Da)购自VEDAN企业股份有 限公司。渗透压仪标准品是由Advanced Instruments公司(美国麻州诺伍德 市)提供。

抗生素、胰蛋白酶及胎牛血清是由Invitrogen(美国加州卡尔斯巴市) 提供。细胞培养盘及培养槽是由Orange Scientific(比利时布赖恩拉勒)提供。 快速细胞增生分析套组是购自BioVision(美国加州)，而细胞毒性分析是购 自Promega(CytoTox 96Assay kit，美国威斯康星州)。牛角膜内皮细胞(bCE cells)及人类视网膜色素上皮细胞(hRPE cells)是来自细胞科学国家中心(台 湾新竹食品工业发展研究所)。

方法

冲洗液渗透压评估

使用Advanced Instrument公司所生产的3D3单次样品渗透压仪(3D3 Single-Sample Osmometer)测量溶液渗透压。制备含有不同浓度 γ-PGA(0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1％)的冲洗液及不含γ-PGA的控制组，以 评估γ-PGA的影响。使用校正标准品(每升100及1500mOsm)，对渗透压 仪进行校正。含有γ-PGA的冲洗液pH值为7.4±0.1。使用碳酸氢钠作为 pH缓冲剂，并使用二次蒸馏水来制备冲洗液。

冲洗液黏度评估

使用具有平行板(parallel plate geometry)配件的旋转流变仪的HAAKE Rheo Stress 600(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)仪器评估 冲洗液黏度。借助控制单元来控制温度。于室温(25℃)及体温(37℃)两种 工作温度下进行评估。将上部不锈钢板(直径为35mm)及底部不锈钢板间 之间隔高度调整为1.05mm。借助速控旋转斜面模式(controlled rate rotation  ramp mode)，测得冲洗液的黏度曲线。剪切率范围是由1s^-1至500s^-1。

冲洗液折射率评估

使用DR-A1折射仪(日本ATAGO)测量折射率(RI)。于室温下制备含有 0.2、0.4、0.6、0.8及1％(重量/体积，w/v)γ-PGA的冲洗液，并小心置放于 棱镜上。当通过接目镜察看时，转动控制钮直到阴影线位于十字准线中心。 再由数字屏幕得知折射率。

γ-PGA生物兼容性评估

将不同浓度的γ-PGA加至细胞培养液中，以评估生物兼容性。以200 毫升的细胞培养液对单层角膜内皮细胞及视网膜色素内皮细胞作测试。以 5×10³细胞/孔的细胞密度，将细胞接种于96孔组织培养盘上，于37℃且 5％二氧化碳培养条件下，使细胞贴附于培养盘底部隔夜后，对负控制组(以 Al₂O₃萃取的细胞培养液)、正控制组(含0.1％Triton X-100的细胞培养液) 及实验组(含0.2％，0.4％，0.6％，0.8％及1％γ-PGA的细胞培养液)的测试组 进行六重复测试。于37℃下培养24小时及72小时后，使用快速细胞增 生分析套组II(Quick Cell Proliferation Assay Kit II)及CYTOTOX非放射 性细胞毒性分析(CYTOTOXNon-Radioactive Cytotoxicity Assay)，对细 胞存活率及细胞毒性进行定量分析。

于培养72小时后，将测试培养液换掉，且每孔改换成0.2ml水溶性 四唑氮盐-8(tetrazolium-8，WST-8)工作溶液，以进行细胞存活率评估。于培 养2小时后，由于细胞线粒体脱氢酶(cellular mitochondrial dehydrogenases) 会使四唑氮盐裂解形成甲臜(formazan)，故WST-8工作溶液的颜色会改变。 借助光谱仪，读取450nm位置上的信号，以对角膜内皮细胞及视网膜色 素内皮细胞的存活率进行定量分析。参考波长为650nm。

将0.05ml培养液移入96孔ELSA盘中，并与0.05ml的基质混合液 (substrate mix)混合，再避光培养30分钟，以进行细胞毒性评估。基质混 合液(substrate mix)中的四唑氮盐会与乳酸脱氢脢(lactate dehydrogenase， LDH)反应，以形成红色甲臜(formazan)产物。借助光谱仪，读取450nm位 置上的信号，对释入培养液中的LDH进行定量评估。另外也对未培养细 胞的培养液进行分析，以作为培养液的背景值。使用细胞溶解液(1％ X-100)，对角膜内皮细胞及视网膜色素内皮细胞进行细胞溶解， 并读取OD₄₉₀值。细胞毒性百分比如下所示：

细胞毒性(％)＝(培养液O.D.-空白O.D.)/(总溶解O.D.-空白O.D.)×100

荧光染色

对于含有0.2、0.4、0.6、0.8及1％(重量/体积)γ-PGA的细胞培养液中 的细胞进行1天及3天的染色，分别使用LIVE/DEAD染色套组(Molecular  Probes#L3224，Eugene，Oregon，USA)染色，并使用NIS Element软件拍摄。

γ-聚(麸胺酸)类眼科手术冲洗液的体内研究

对三只纽西兰白兔(2～3kg)的六只眼睛进行试验。肌肉注射 ketalar/Chanazine 2％(Ketamine：22mg/kg BW；Xylazine：4-6mg/kg BW) 进行全身麻醉后，执行手术。于手术显微镜下，将两支静脉留置针(vein  detained needle)小心穿过角膜而不碰到晶体(图8A)。将其中一支静脉留置 针与填满试验眼科冲洗液的瓶子连接，而另一支则与空瓶连接(图8B)。使 用蠕动泵浦(流速为5mL/min)，于37℃下用冲洗液对角膜内皮进行灌注60 分钟(图8B)。右眼使用0.4％(重量/体积)的γ-聚(麸胺酸)类眼科手术冲洗液 冲洗，而左眼使用生理盐水冲洗。于灌注期间，每隔5至10分钟测量角 膜厚度。

角膜厚度测量

使用具有手控变换器的超音波角膜厚度测量仪(ultrasonic pachymeter) DGH 550(DGH Technology)，测量中心处的角膜厚度。DGH 550是使用回 音突波技术(echo spike technique)测量角膜厚度的超音波角膜厚度测量 仪。于灌注期间，超音波角膜厚度测量仪每隔5至10分钟会测量角膜厚 度。

统计分析

至少作三次统计分析，其结果以平均值±标准偏差(SD)来表示。借助 变异数分析(analysis of variance，简称ANOVA)来评估γ-PGA于生物兼容 性上的影响。p值小于0.05表示有统计学上的明显差异。

结果

含γ-PGA冲洗液的渗透压

右旋糖(dextrose)及γ-PGA对冲洗液渗透压的影响分别如图1A及1B 所示。表1则显示含右旋糖的冲洗液组成(图1A)及含γ-PGA的冲洗液组 成(图1B)。

表1

含5mM右旋糖及0.2、0.4、0.6、0.8及1％γ-PGA的冲洗液渗透压分 别为304、309、314、319及325mOsm(图1C)。当γ-PGA浓度由1％降至 0.2％时，含5mM右旋糖的冲洗液渗透压由325降至304mOsm。然而， 含1、2、3、4、5mM右旋糖但不含γ-PGA的冲洗液渗透压分别为295、 296、296、298、300mOsm(图1A)。因此，右旋糖对冲洗液渗透压的影响 小于γ-PGA。

含γ-PGA的冲洗液黏度

图2显示γ-PGA会使冲洗液黏度呈浓度依赖型增加，而5mM右旋糖 并不会对黏度造成影响。含5mM右旋糖及0，0.2、0.4、0.6、0.8或1％γ-PGA 的冲洗液黏度于室温下(25℃)分别为0.62、1.15、1.72、2.39、3.11及3.93 厘泊(cP)(表2)。当温度提高至体温(37℃)时，冲洗液黏度会下降。含5mM 右旋糖及0、0.2、0.4、0.6、0.8或1％γ-PGA的冲洗液黏度于37℃下分 别为0.32、0.75、1.20、1.73、2.33及2.96cP(表3)。

含γ-PGA的冲洗液折射率

含0.25、0.5、0.75及1％(w/v)γ-PGA的冲洗液折射率分别为1.3346、 1.3350、1.3355及1.3360(图3)。冲洗液的组成包括122mM NaCl、5.08mM KCl、1.05mM CaCl₂、0.98mM MgCl₂、25.0mM NaHCO₃、3.0mM Na₂HPO₄、 0～1％(w/v)γ-PGA、及用来将pH值调至7.2～7.4的HCl或NaOH。

表2

表3

γ-PGA生物兼容性

于含γ-PGA的培养液中培养牛角膜内皮细胞(bCE cells)及人类视网膜 色素上皮细胞(hRPE cells)，并于第1天及第3天时，使用WST-8及LDH 分析评估细胞存活率及细胞毒性(图4A-B及图5A-B)。WST-8分析是用来 测量存活细胞的数量。以0.2％、0.4％、0.6％、0.8％及1％(w/v)γ-PGA处 理bCE细胞，且于第1天测得取自bCE细胞的培养液OD_450nm分别为0.20 ±0.02、0.19±0.02、0.20±0.02、0.19±0.01及0.17±0.04；而第3天分别 为0.53±0.05、0.47±0.04、0.46±0.10、0.44±0.06及0.41±0.03(图4A)。 以0.2％、0.4％、0.6％、0.8％及1％(w/v)γ-PGA处理hRPE细胞，且于第1 天测得取自hRPE细胞的培养液OD_450nm分别为0.47±0.05、0.51±0.05、 0.52±0.02、0.51±0.06及0.47±0.07，而第3天分别为0.88±0.08、0.88± 0.03、0.81±0.07、0.78±0.09及0.79±0.10(图4B)。浓度为0.2至1％的 γ-PGA对bCE细胞及hRPE细胞存活率没有影响。

对细胞膜损害或破裂进行定量分析，以测定细胞死亡状况。LDH细胞 毒性测试是一种测定死亡及细胞膜损害细胞的比色测定法。因细胞膜损害 而存在培养上清液中的LDH会参与偶合反应，将黄色四唑氮盐转变成红 色的甲臜型染料，其可于492nm处测得吸收峰。甲臜含量会与培养液中 的LDH含量呈正比，进而与死亡或损害细胞数量呈正比。第1天所测得 的0.2％、0.4％、0.6％、0.8％及1％γ-PGA培养液中bCE细胞毒性百分比 分别为7.77±3.5％、8.90±3.5％、5.76±2.8％、10.86±2.8％及10.65±2.5％； 而第3天分别为16.11±5.8％、12.11±6.6％、8.66±4.0％、4.61±3.7％及 2.76±0.4％。第1天所测得的0.2％、0.4％、0.6％、0.8％及1％γ-PGA培养 液中hRPE细胞毒性百分比分别为2.97±0.6％、2.74±0.4％、3.95±1.0％、 2.99±1.0％及4.78±0.9％；而第3天分别为2.85±0.3％、2.77±1.5％、3.74 ±1.5％、8.11±1.9％及10.37±0.9％。含γ-PGA培养液与负控制组间并无 明显差异(图5A-B)。细胞毒性百分比，以死亡细胞数量除以总细胞数量来 表示，其是如下式算得：细胞毒性(％)＝(培养液O.D.-空白O.D.)/(总溶解 O.D.-空白O.D.)×100。

细胞荧光染色

存/亡细胞染色套组(Live/Dead staining kit)是使用钙黄绿素 -AM(calcein-AM)及乙锭(ethidium homodimer，EthD-1)两种荧光染剂。钙黄 绿素-AM是一种广泛使用的绿色荧光细胞标记且具有可透膜性。一旦钙黄 绿素-AM(非荧光分子)进入细胞中，就会被细胞内的酯酶水解成带负电的 绿色荧光钙黄绿素。荧光钙黄绿素会留在活细胞的细胞质中。此为细胞存 活率终点测定。借助485nm激发波长及530放光波长来观察荧光信号。 测定时所产生的荧光信号会与样品中存活细胞数量呈比例关系。死亡细胞 具有损害的细胞膜。乙锭(EthD-1)会进入损害细胞，且与核酸键结时会放 出荧光。EthD-1会于损害或死亡细胞中产生亮红色荧光。结果显示，含 γ-PGA培养液中的bCE及Hrpe细胞几乎全部存活(图6A-B及7A-B)。

含γ-PGA的冲洗液对角膜厚度的影像

通过两支穿入兔眼的静脉留置针进行冲洗液眼内灌注，并于灌注期间 测量角膜厚度(图8A)。借助蠕动泵浦来驱动冲洗液的流动(图8B)。于开始 灌注20分钟期间，角膜厚度增加。图9显示，相较于生理盐水测试组， 使用含γ-聚(麸胺酸)类眼部溶液冲洗测试组的角膜厚度变化明显较小。生 理盐水冲洗测试组及含0.4％(w/v)γ-聚(麸胺酸)溶液冲洗测试组的角膜厚度 变化分别为47μm及32μm。插入静脉留置针所导致的伤害可能是角膜厚 度一开始增加的原因。之后，使用γ-聚(麸胺酸)类眼科手术冲洗液持续灌 注角膜1小时期间，角膜厚度只些微增加约36μm(图9)。相反的，使用生 理盐水持续灌注角膜60分钟期间，角膜厚度呈现持续增加的状况，灌注1 小时后，角膜厚度增加约58μm，与使用γ-聚(麸胺酸)类眼科手术冲洗液 冲洗的测试组比较，其大约增加到1.6倍。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行 了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。