一种通用型PiggyBac转座子转基因载体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种通用型PiggyBac转座子转基因载体及其制备方法，包括供体载体和辅助载体；所述的供体载体包括PiggyBac转座子5’重复末端序列5’TR和3’重复末端序列3’TR，在5’TR和3’TR之间设有两个绝缘子，在绝缘子序列之间设有多克隆位点；所述的辅助载体包括PiggyBac转座酶编码基因Pbase，在Pbase的上游设有启动子，在其下游设有PloyA。将外源基因克隆至供体载体的多克隆位点中，然后再与辅助载体混合转染细胞，稳定筛选细胞单克隆，通过PB转座子元件将外源基因特异性整合到基因组中的TTAA位点。

说明书

技术领域

本发明属于转基因载体技术领域，涉及一种通用型PiggyBac转座子转基 因载体及其制备方法。

背景技术

转基因是将携带基因的DNA片段导入基因组中的方法。通过观察由转 基因产生的生物体的表型改变，可以获得相关基因的功能信息。另外，转基 因技术还可用于改良生物体的性状，有巨大的经济价值。

在哺乳动物细胞或动物体内最常用的转基因方法是将线性化的携带外源 基因的DNA通过脂质体、电穿孔或显微注射等手段导入细胞中，使DNA随 机整合入基因组中。这种方法有很多缺点：(1)整合效率低，因此在大多数哺 乳动物中用此法不能高效地培育转基因动物；(2)多数情况下线性化的DNA 会形成多拷贝的串联重复，即多联体(concatamer)，其很难模拟内源基因的正 常生理状况；(3)多联体在传代时不同转基因拷贝间易于发生重组而造成缺失 (deletion)，或由于甲基化修饰影响转基因的稳定表达；(4)由于利用此方法很 难确定转基因插入所在基因组中的位置，因此也无法对插入位点附近的染色 体环境作出评估。

与单纯的线性化DNA相比，病毒载体能使转基因更高效地整合入基因 组，但其主要不足在于：（1）负载容量小，即所能携带外源DNA片段的长 度有限；（2）宿主也会对病毒进行甲基化修饰，使转基因表达静默；（3）制 备病毒操作繁琐；（4）虽然用于转基因的大多是复制缺陷型病毒，但安全性 仍是一个需要警惕的问题。

转座子（transposon）是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗 传因子，其变更插入位置的过程被称为转座（transposition）。

piggyBac(PB)转座子是病毒遗传学家Malcolm J.Fraser最初发现并构建二 元转座系统证明其不仅仅在一个宿主中具有转座活性。PB转座子全长 2472bp，其中间饱含一个长2.1kb的转录区域，包含一个潜在的启动子和仅 含一个外显子的长1.8kb的ORF，它编码一个预测大小为64kDa的转座酶， 并且依据该转录酶的方向来区分其外侧的两个末端。其两端最外侧有各长 13bp的堆成的反向末端重复序列（inverted terminal repeat,ITR），其内侧各有 一段间隔区（spacer），分别长3bp和31bp，再靠内侧是各长19bp的对称亚 末端反向重复序列(sub-terminal inverted repeat,STR)。

PB转座子最初是由Handler将其用于昆虫生殖细胞转化，至2005年之 前PB转座子已经被证明能在5个目的20多种昆虫以及扁形动物、原生动物 体内进行转座，在这些非脊椎动物中的应用主要集中在两方面：生殖细胞转 化（即转基因）和基因插入诱变，这些为PB转座子在哺乳动物中的应用奠 定了基础。

2005年Cell杂志刊登封面文章，由复旦大学发育生物所改造的PB转座 系统能够证明在哺乳动物细胞和小鼠中进行高效转座，并成功培育出由PB 转座子介导的转基因小鼠，这为细胞转基因提供了一种新型模式，并且该研 究表明PB转座子具有安全、高效、负载容量大并相对于一般载体来说由于 其插入位点为TTAA而具有比较高的特异性等特点。

近几年，PB转座系统被应用到了更多的领域，例如利用PB转座子携带 某些因子诱导成纤维细胞重编程成为多能干细胞，RNA干扰，转基因动物的 生产以及基因捕获和基因治疗等。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种通用型PiggyBac转座子转基因载体及 其制备方法，该载体能够使目的基因稳定持续地表达。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种通用型PiggyBac转座子转基因载体，包括供体载体和辅助载体；

所述的供体载体包括PiggyBac转座子5’重复末端序列5’TR和3’重复末 端序列3’TR，在5’TR和3’TR之间设有两个绝缘子，在绝缘子序列之间设 有多克隆位点；

所述的辅助载体包括PiggyBac转座酶编码基因Pbase，在Pbase的上游 设有启动子，在其下游设有PloyA。

所述的5’TR的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；5’TR的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.2所示。

所述的绝缘子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

所述的多克隆位点的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述的Pbase的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；所述的启动子为PTK 启动子。

所述靠近5’TR的绝缘子与多克隆位点之间还设有相互连接的抗生素筛 选基因和荧光标记基因。

所述的抗生素筛选基因和荧光标记基因的两端分别设有两个同向的 Loxp序列：Loxp1和Loxp2；

在Loxp1与抗生素筛选基因之间还设有SV40 PloyA，抗生素筛选基因与 荧光标记基因通过2A序列连接，荧光标记基因与Loxp2之间还设有CMV 启动子。

所述的抗生素筛选基因为Neo基因，所述的荧光标记基因为EGFP。

一种通用型PiggyBac转座子转基因载体的制备方法，包括以下步骤：

1）分别合成如SEQ.ID.NO.1所示的PiggyBac转座子5’TR和如 SEQ.ID.NO.2所示的PiggyBac转座子3’TR序列，以及如SEQ.ID.NO.3所示 的鸡源绝缘子序列、如SEQ.ID.NO.4所示多克隆位点的序列，然后按照5’TR- 鸡源绝缘子-多克隆位点序列-鸡源绝缘子-PiggyBac转座子3’TR的元件顺序 连接，并将所构建的片段通过TA克隆的方式克隆至pMD18-T simple载体中， 得到质粒TP；

2）扩增上游连接有2A序列的NEO基因将其克隆到pEGFP-C1质粒中 EGFP的下游，得到质粒pNA；

3）以pNA为模板，以CEANF和CEANR为引物扩增CMV至PloyA之 间的片段，并将所扩增的片段克隆至TP质粒中的靠近5’端的绝缘子与多克 隆位点之间，得到pBNW-TP1载体；

所述的CEANF为：gagcagatct ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgtt  atcccctgat tctgt；

所述的CEANR为：tatcgtcgac ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgctta  caatttacgc cttaag；

4）扩增PTK启动子，并将其克隆至pEGFP-C1质粒中，得到pPTK质 粒；

5）扩增如SEQ.ID.NO.5所示的Pbase编码基因，并将其克隆至pPTK质 粒中PTK启动子的下游，得到质粒pPTK-Pbase；

6）以pPTK-PBase为模板，扩增PTK至PloyA之间的片段，并将所扩 增的片段通过TA克隆的方式连接克隆至pMD18-Tsimple载体中，得到 pBNW-TD2载体；

所构建的载体pBNW-TP1和pBNW-TD2共同组成通用型PiggyBac转座 子转基因载体。

所述的通用型PiggyBac转座子转基因载体在外源基因转染细胞中的应 用：将外源基因克隆至供体载体的多克隆位点中，然后再与辅助载体混合转 染细胞，稳定筛选细胞单克隆。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的通用型PiggyBac转座子转基因载体，包括供体载体和辅助 载体，将外源基因克隆至供体载体的多克隆位点中，然后再与辅助载体混合 转染细胞，稳定筛选细胞单克隆，通过PB转座子元件将外源基因特异性整 合到基因组中。供体质粒在辅助载体质粒表达的转座酶的作用下，在细胞中 发生转座整合，特异性插入TTAA位点。

本发明提供的通用型PiggyBac转座子转基因载体，由于两个鸡绝缘子核 心序列的存在，在转座子整合至基因组的情况下，能有效避免基因组表观遗 传修饰和位置效应对目的基因的影响，使目的基因稳定持续地表达；

多克隆位点可用的稀有酶切位点如下：Bstz17I，AccIII，AscI，BclI，EspI， FseI，NheI，PacI，Sse232I，SbfI，SpeI，大多数基因组中这些酶切位点出现 的频率很小，可满足外源基因克隆至本载体，同时在引入报告基因的同时在 多克隆位点5’端引入T3通用测序引物，便于对目的基因进行测序。

本发明提供的通用型PiggyBac转座子转基因载体，利用2A序列将EGFP 和NEO基因串联，共用CMV启动子启动表达，在不影响其功能的前提下， 减少了载体分子量，并且由于报告系统的两端存在两个同向Loxp序列，可 根据实验需要加入Cre酶去除报告系统。

本发明提供的通用型PiggyBac转座子转基因载体，鉴于PB转座子的特 点，该系统在转基因动物生产、永生化细胞系的建立、RNA干扰以及IPS细 胞的诱导等领域具备了很好的应用前景。且越来越多的文献对PB转座子具 体转座的某些机理也得到了进一步的阐明，这为转座子在哺乳动物转基因大 规模应用上奠定了基础。

附图说明

图1为通用型PiggyBac转座子转基因载体系统的构建流程图；

图2为载体TP的单酶切鉴定电泳图谱，其中标号M为DNA分子量 Marker,1为SpeI单酶切TP。

图3为载体pNA双酶切鉴定结果，标号为M为Marker，1为BspEI和 BamhI双酶切pNA结果。

图4为载体pBNW-TP1的酶切鉴定电泳图谱，标号M为Marker,1为SalI 单酶切结果，2为BglII和SalI双酶切结果。

图5为载体pPTK酶切鉴定结果，标号M为Marker,1和2均为HindIII 和SacII双酶切pPTK结果。

图6为载体pPTK-Pbase酶切鉴定结果，标号M为Marker，1和2均为 HindIII和BamHI双酶切pPTK-Pbase结果。

图7为载体pBNW-TD2单酶切鉴定结果，标号M为Marker，1为SacII 单酶切pBNW-TD2结果。

图8为通用型PiggyBac转座子转基因载体系统载体图谱，其中A为供 体质粒pBNW-TP1载体图谱，B为辅助质粒pBNW-TD2载体图谱。

图9为Loxp序列功能验证电泳图谱，标号M为Marker，1为SpeI单酶 切pBNW-TP1结果，2为SpeI单酶切pBNW-TPL结果。

图10为将通用型PiggyBac转座子转基因载体系统质粒转染293细胞， 利用G418药物持续筛选两星期所得单克隆细胞，其中A为40倍物镜下暗场 细胞生长图片，B为40倍物镜下明场细胞生长图片。

图11为筛选的293单细胞克隆扩大培养后图片，其中A为40倍物镜下 暗场细胞生长图片，B为40倍物镜下明场细胞生长图片。

图12为PiggyBac转座子转基因载体系统质粒转染293细胞后，利用染 色体步移对稳定筛选出单克隆细胞基因组中侧翼序列检测并分析的结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明 的解释而不是限定。

1、材料及试剂

载体：pMCIneo(stratagen)，pMD18-T simple(TAKARA)，pEGFP-N1和 pEGFP-C1购自Clotech公司，

phspBac载体（Handler and Harrell,2001a）由美国农业部农业昆虫病害南 大西洋中心Handler教授惠赠。

菌株：DH5α（天根）

试剂：各种内切酶（NEB，MBI），T4DNA连接酶（TAKARA）， CIAP(TAKARA)，Klenow（TAKARA）,质粒小提试剂盒（上海生工），质粒 大提试剂盒（Promega），凝胶回收试剂盒（Axygen），HP DNA转染试剂 （Roche），G418（Sigma），PCR相关试剂（TAKARA），染色体步移试剂盒 （TAKARA）T4核苷酸激酶（TAKARA）,血液、细胞、组织基因组提取试 剂盒（天根）。

所用到的引物如下（委托上海生工合成）：

NEOF:GGATCCGGAAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCAGGAGACGT TGAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTTCTCCGGCGTTAGGATGATTGAA CAAGATGGATTG；

NEOR:CGCGGATCCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG；

CEANF:GAGCAGATCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTT ATTGCGTTATCCCCTGATTCTGT；

CEANR:TATCGTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTT ATCGCTTACAATTTACGCCTTAAG；

PTKF:CTCAAGCTTTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTCG；

PTKR:GGACCGCGGATTGGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTT；

PbF:TCCCCGCGGATGGGTAGTTCTTTAGACGATGA；

PbR:CGCGGATCCTCAGAAACAACTTTGGCACATATC；

PPBF:TAAAACGACGGCCAGTGAAT；

PPBR:CGCTTACAATTTACGCGTTAAG；

SP1：TATGTCGACTACGTAGGGGAGCTCA；

SP2：ACGGGATCGCTTTCCTCTGAAC；

SP3：TGACTCACGCGGTCGTTATAGTTC。

2、参见图1所示的构建方法，分别构建pBNW-TP1和pBNW-TD2载体

pBNW-TP1载体的构建：

1）通过南京金斯瑞生物公司分别合成如SEQ.ID.NO.1所示的PiggyBac 转座子5’TR和如SEQ.ID.NO.2所示的PiggyBac转座子3’TR序列，以及如 SEQ.ID.NO.3所示的鸡源绝缘子序列、如SEQ.ID.NO.4所示多克隆位点的序 列，然后按照PiggyBac转座子5’TR-鸡源绝缘子-多克隆位点序列-鸡源绝缘 子-PiggyBac转座子3’TR的元件顺序连接，并将所构建的片段通过TA克隆 的方式克隆至pMD18-T simple载体中，该质粒命名为TP。

载体TP的单酶切鉴定电泳图谱如图2所示，可以看到载体TP构建成功。

2）以NEOF和NEOR作为引物，上下游引物5’端设计BspEI和BamHI 两个酶切位点，以pEGFP-N1质粒为模板扩增NEO基因，并在上游引物中 引入2A序列；

所述的2A序列为：cctaacgccg gagaagaaga agggcccagg gttggactca acgtctcctg  ccaacttgag aaggtcaaaa tt；

PCR扩增条件：95度变性5min，然后进行如下30个循环，95度30s， 59度30s，72度1min，最后一个循环结束后，进行72度延伸10min。

通过胶回收该片段，并将其与pEGFP-C1质粒分别用BspEⅠ和BamHⅠ 双酶切，然后将其克隆至pEGFP-C1质粒中，所得质粒命名为pNA。

载体pNA双酶切鉴定结果如图3所示，结果检测表明载体pNA构建成 功。

3）以pNA为模板，以CEANF和CEANR为引物扩增以下片段： CMV-EGFP-2A-NEO-PloyA；

其中，引物上下游5’端引入两个顺序相同的长度为34bp的Loxp回文序 列，上游引物Loxp外侧引入T3引物（T3primer），并分别在上下游引物5’ 末端设计BglII和SalI酶切位点，

PCR扩增条件：95度变性5min，然后进行如下32个循环，95度30s， 61度35s，72度3min，最后一个循环结束后，进行72度延伸10min。

扩增后的片段胶回收后，并将其与TP质粒分别用BglII和SalI双酶切， 然后将其克隆至TP质粒中，所得质粒命名为pBNW-TP1。

载体pBNW-TP1的酶切鉴定电泳图谱如图4所示，结果表明载体 pBNW-TP1构建成功。

pBNW-TD2载体的构建：

4）以PTKF和PTKR分别为上下游引物（引入HindIII和SacII酶切位 点），以pMC1neo载体为模板，扩增PTK启动子；

PCR扩增条件：95度变性5min，然后进行如下35个循环，95度30s， 58度30s，72度30s，最后一个循环结束后，进行72度延伸10min。

目的片段胶回收后，并将其与pEGFP-C1质粒分别用HindIII和SacII双 酶切，然后将其克隆至pEGFP-C1质粒中，所得质粒命名为pPTK。

5）以PbF和PbR分别为上下游引物（引入SacII和BamHI酶切位点）， 以phspBac载体为模板，扩增PiggyBac转座酶(Pbase)编码基因序列；

PCR扩增条件：95度变性5min，然后进行如下33个循环，95度35s， 60度35s，72度2min，最后一个循环结束后，进行72度延伸10min。

所扩增的Pbase编码基因的序列如SEQ.ID.NO.5所示；

扩增后的片段胶回收后，并将其与pPTK质粒分别用SacII和BamHI双 酶切，然后将其克隆至pPTK质粒中，所得质粒命名为pPTK-Pbase。

载体pPTK-Pbase酶切鉴定结果如图6所示，结果表明载体构建成功。

6）以PPBF和PPBR分别为上下游引物，以pPTK-PBase为模板，扩增 PTK-Pbase-PloyA片段，PCR扩增条件：95度变性5min，然后进行如下32 个循环，95度35s，61度35s，72度2.5min，最后一个循环结束后，进行72 度延伸10min。

片段胶回收，通过TA克隆的方式连接克隆至pMD18-T simple载体中， 构建的质粒载体命名为pBNW-TD2。

载体pBNW-TD2单酶切鉴定结果如图7所示，结果检测表明载体构建成 功。

参见图8所示的通用型PiggyBac转座子转基因载体系统载体图谱，所构 建的载体pBNW-TP1和pBNW-TD2共同组成通用型PiggyBac转座子转基因 载体系统，使用时，将外源基因克隆至pBNW-TP1的多克隆位点（MCS）中， 和pBNW-TD2按常用的1:1的比例混合转染细胞，稳定筛选细胞单克隆后， 检测整合位点侧翼序列，确定其功能。

3、载体相关元件的检测

1）将载体pBNW-TP1转化入组成型表达Cre酶的大肠杆菌BM2.5 (Clontech)中验证Loxp序列的功能

Cre酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个同向34bp的Loxp位点之 间的序列发生特异性重组，使Loxp位点间的序列被删除。该实验方法具体 操作如下：将BM2.5大肠杆菌参照《分子克隆实验指南》第三版中的Inoue 法制备成为感受态细胞，利用传统质粒转化方法将载体pBNW-TP1转化进入 该感受态细胞内，并筛选重组子扩大培养，提取扩大培养后的重组子中质粒 并命名为pBNW-TPL，利用speI分别单酶切pBNW-TP 1和pBNW-TPL，0.8% 凝胶电泳结果显示pBNW-TPL比pBNW-TP短2500bp左右，结果如图9所 示；这说明报告系统已被删除，送测序后结果与电泳结果相符，证明Loxp 序列功能正常，在转座成功后，可利用Cre酶去除报告系统。

2）EGFP和NEO基因功能

将质粒pBNW-TP1和pBNW-TD2分别转化DH 5α大肠杆菌经氨苄青霉 素（Amp）筛选扩大培养之后，大批量提取质粒后，利用HPDNA转染试剂 将上述质粒按照1:1的比例转染293细胞，24h后绿色荧光表达正常；

细胞换液后加入500ug/ml浓度的G418并持续筛选一星期，对照组全部 死亡，阳性对照和实验组均正常生长，证明通过2A序列连接的EGFP和NEO 基因功能正常。

图10所示为利用G418药物持续筛选两星期所得单克隆细胞，其中A为 40倍物镜下暗场细胞生长图片，B为40倍物镜下明场细胞生长图片。结果 表明筛选到阳性克隆的细胞。

3）转座功能

将所筛选的阳性293细胞单克隆扩大培养后（如图11所示，其中A为 40倍物镜下暗场细胞生长图片，B为40倍物镜下明场细胞生长图片），提取 基因组，以基因组为模板利用染色体步移的方法（热不对称PCR）检测PB 转座子整合位点，在已知转座子序列中设计三条特异性引物SP1、SP2、SP3， 具体实验原理及步骤参照TAKARA染色体步移试剂盒说明书（货号：D316）， 将扩增的条带克隆至pMD19-T载体，测序表明PB转座子元件特异性整合到 人类基因组TTAA位点，证明本系统转座功能正常，具体的检测结果如图12 所示：

其中A图为1号克隆检测结果，图A 1是转座子5’TR和检测的侧翼序 列比对结果，图A 2将侧翼序列输入NCBI数据库进行BLAST比对结果，证 实1号克隆插入TTAA位点，并整合到人基因组8号染色体。

图B为2号克隆检测结果，其中图B 1为转座子5’TR和检测的侧翼序 列比对结果，图B 2将侧翼序列输入NCBI数据库进行BLAST比对结果，证 实2号克隆插入TTAA位点，并整合到人基因组9号染色体。