一种高效获得葡萄藻单细胞的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种高效获得葡萄藻单细胞的方法及其应用，所述方法包括去除湿藻表面部分水分，使湿藻体含水量为60-80wt%。所述方法简单易行、低成本、高效的获得高活性的葡萄藻单细胞，而同时获得的胞外组织能比较容易的进行油脂提取。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及高效获得葡萄藻单细胞的方法及其应用。

背景技术

随着全球化石能源的短缺及由于使用化石能源带来的环境问题，寻找新型 可替代能源势在必行。微藻具有生物量大、生长周期短及含油脂类物质高等特 点，在CO₂减排和生物燃料开发上都有广阔的开发前景。

可利用微藻开发的生物燃料主要两种类型，一类是利用微藻合成的脂肪酸 通过酯化生产生物柴油，因大多数微藻通过脂肪酸合成途径可积累大量油脂， 故目前多采用此类研发思路来开发微藻生物柴油技术；另一类是利用微藻合成 的烷烃类物质生产生物航空煤油，在微藻中，葡萄藻合成的烃类物质与石油性 质非常相似，可代替石油用于航空煤油的生产。

航空煤油原本是石油产品之一，是由直馏馏分、加氢裂化和加氢精制等组 分及必要的添加剂调和而成的一种透明液体。主要由不同馏分的烃类化合物组 成。近些年来，我国航空燃料的需求不断增长。目前，国内航煤消费量保持每 年13%左右的增长速度，远高于国际5%的增长水平，2010年国内航煤消费已达 到1800万吨以上。现在我国已成为年消费量近2000万吨的航空燃料消费大国， 按照有关国际组织预测，2020年生物航煤将达到航油总量的30%。目前国外已 有商业化的生物航空煤油产品，而2012年2月我国的首个生物航空煤油产品的 适航审定申请也由中国民用航空局正式受理。但该生物航煤是以多种动植物油 脂为原料，采用自主研发的加氢技术、催化剂体系和工艺技术生产的。仍然存 在生产原料有限，生产工艺复杂，造价高等问题，而用藻类进行生物航空煤油 的生产则可以在很大程度上克服这些问题。

如上文所述，藻类中比较适于生物航空煤油生产的是葡萄藻。葡萄藻又名 丛粒藻，属绿藻门、四胞藻纲、葡萄藻科、葡萄藻属，显微镜下，葡萄藻呈串 状集落生长，细胞梨形，宽5-9μm，长9-13μm，具有明显细胞壁，细胞壁分内 外两层，内层由粘性多糖构成纤维状，外层由三层薄层形成鞘；藻体包埋于藻 丛中，在外围形成一层透明或半透明的油膜。在透射电子显微镜下可见，围绕 着细胞基部的厚基质结构是由连续的细胞分裂产生的外壁构成，借以将藻体细 胞的集落粘合起来。常为2个或4个细胞组成一组，各个胶质漏斗在中央互相 联合，所有的细胞或多或少地呈辐射状排列。葡萄藻以似亲孢子营无性生殖。 葡萄藻的产烃量25%-86%，大部分烃颗粒储存在细胞外壁和折射绍丝中，其分 布可能会随培养阶段发生变化。

葡萄藻虽产油率高，但其生长缓慢，室外养殖容易污染，故很难得到大规 模的推广应用，优良葡萄藻藻种的选育是克服葡萄藻推广应用的关键环节。而 在葡萄藻生长过程中多个细胞聚集成团，在藻种选育上，特别是在基因工程改 造上很难操作，这就需要能高效产生高活性葡萄藻单细胞的技术。传统的从细 胞群体中获得单细胞的方法主要有机械破碎，超声破碎，酶解等方法，但此类 方法多对细胞损伤较大，得到的细胞质量低，生产成本较高，生产效率低，往 往不能高效的获得单细胞，获得的单细胞往往是单细胞和原生质体混合物，其 中破碎组织占据大部分。另外，葡萄藻的结构特性表明，大部分烃颗粒储存在 细胞外壁中，故藻体细胞在油脂提取中成为障碍物，如何去除藻体细胞障碍物 成为提高油脂提取率的关键技术。

因此，本领域中需要可高效的获得高活性的葡萄藻单细胞以及葡萄藻胞外 组织的方法。

发明内容

本发明的目的在于提出一种获得葡萄藻单细胞以及葡萄藻胞外组织的方 法，通过所述方法可以高效地获得高活性的葡萄藻单细胞，同时获取除去了藻 细胞的葡萄藻胞外组织，以提高油脂提取率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种从细胞群体生长的葡萄藻中高效获得大量完整且具有高活 性的单细胞方法，其特征在于，所述方法包括去除湿藻藻体细胞表面的部分水 分。

本发明的方法可以包括：

（a）收集湿藻藻体；

（b）去除所述藻体细胞表面的部分水分；

（c）形成所述藻体的单细胞和胞外组织的混合物；

（d）任选地，还包括收集所述单细胞。

本发明提供的方法还可以包括：

（a）收集湿藻藻体；

（b）去除所述藻体细胞表面的部分水分；

（c）形成所述藻体的单细胞和胞外组织的混合物；（e）任选地，收集所述 胞外组织；和

（f）任选地，从所述胞外组织提取油脂。

在本发明的方法中，去除所述藻体细胞表面的部分水分的步骤可以在5-40 ℃，优选10-35℃，最优选20-30℃下进行。

在本发明的方法中，可用吸水材料去除藻体细胞表面的部分水分，优选地， 所述吸水材料是吸水纸或干燥剂。

在本发明的方法中，可采用通风干燥处或低温干燥设备去除藻体细胞表面 的部分水分。

在本发明的方法中，可通过200-400目，优选250-350目，更优选300目筛 绢过滤来分离所述单细胞和所述胞外组织。

在本发明的方法中，去除藻细胞表面的水分后，藻体的含水量可以为 60wt%-80wt%，优选65wt%-75wt%，最优选70wt%。

在本发明的方法中，去除藻体细胞的表面水分的步骤可在5℃、8℃、10℃、 12℃、15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃或40 ℃下进行。

在第二个方面，本发明提供了如第一方面所述的方法藻类培养、藻种基因 工程改造、藻种自然选育、藻种诱变育种、色素生产或藻类油脂提取中的应用。

在第三个方面，本发明提供了如第一方面所述的方法在生物航空煤油生产 中的应用。

在本文中，吸水材料是指可以大量吸收水分的材料，一般指吸水率超过50% 的材料。

本发明的有益效果：

1.简单易行、低成本、高效的获得高活性的葡萄藻单细胞。由于本发明的 方法不需要机械研磨和超声处理，因而整个过程不使用机械化、电气化等设备， 成本低、能耗低。

2.本发明完全依靠细胞表面失水而得到单细胞，细胞活性高，有利于后续 的再培养，转基因或选育工作。

3.获得的胞外组织能比较容易的进行油脂提取，因为葡萄藻合成的油脂大 部分分泌到胞外组织中，故剩余的胞外组织可以用于油脂提取。

4.葡萄藻细胞聚团生长、内部的细胞接受不到光，光能利用率低、产量低。 而通过本发明的方法获得的单细胞进行再培养时，可有效提高光能利用率，使 得葡萄藻产量明显增加。

附图说明

图1是采用本发明的方法将葡萄藻单细胞与胞外组织分离的流程示意图。

图2是采用本发明的方法处理后的葡萄藻显微镜图片。

图3是采用本发明的方法获取无菌葡萄藻单细胞的流程示意图。

图4是采用本发明的方法获取胞外组织并提取油脂的流程示意图。

图5是使用采用本发明的方法处理后的葡萄藻单细胞和未处理的藻体进行 培养的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1将葡萄藻单细胞与胞外组织分离

本实施例的技术方案如图1所示，其具体步骤为：

将培养的藻体收集，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或 40℃下，去除所述藻体的表面水分。当所处理的藻体较少时，可采用干净的吸 水纸、干燥剂或其它吸水材料将藻体细胞表面部分水分去除；而当处理大量藻 体时，可将收集的藻体放在通风干燥处或使用低温干燥设备将细胞表面的部分 水分去除。

将处理后的葡萄藻藻体放入已灭菌的培养基或蒸馏水中，葡萄藻单细胞与 胞外组织自然分离，成为单细胞和胞外组织的混合物（见图2）。其中胞外组织 可用较大孔径的滤膜或网筛过滤收集，留在液体中的为葡萄藻单细胞，或可通 过不同转速离心分离葡萄藻单细胞和胞外组织。

测定了十组去除细胞表面的水分藻体的含水量，其分别为60.1wt%、64.8wt %、68.7wt%、79.8wt%、75.2wt%、77.6wt%、69.9wt%、72.4wt%、71.6wt %和62.3wt%。

实施例2获取无菌葡萄藻单细胞

本实施例的技术方案如图3所示，其具体步骤如下：

1.将培养的100ml葡萄藻藻体，采用300目筛绢收集，在25℃下，采用已 灭菌的定性滤纸，将藻体细胞表面水分去除；

2.取上述表面已经干燥的葡萄藻藻体，放入已灭菌的装有50mlBG11培养基 的三角瓶中，放置15min，期间摇动三角瓶3次以上。15min后，大部分藻体细 胞已脱离群体，在无菌条件下用无菌300目筛绢过滤去除胞外组织，收集滤液， 即得到高活性的无菌葡萄藻单细胞藻液。

BG11培养基的组成如表1所示。

表1BG11培养基配方

NaNO₃1.5g/l K₂HPO₄·3H₂O 0.04g/l MgSO₄·7H₂O 0.075g/l CaCl₂·2H₂O 0.036g/l 柠檬酸 0.006g/l FeCl₃·6H₂O 0.00315g/l Na₂EDTA·2H₂O 0.00436g/l Na₂CO₃0.02g/l A₅微量元素* 1ml

*A₅微量元素的组成成分

加到1000ml去离子水中

H₃BO₃2.86g MnCl₂·H₂O 1.81g ZnSO₄·7H₂O 0.222g CuSO₄·5H₂O 0.079g Na₂MoO₄·2H₂O 0.390g Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494g

本实施例所获得的单细胞可用于基因工程改造、优良藻种的选育或者其它 需要使用葡萄藻单细胞的情况。

实施例3获取胞外组织并提取油脂

本实施例的技术方案如图4所示，其具体步骤如下：

1.将培养的葡萄藻藻体收集，在20℃下，采用干净已灭菌的吸水纸将藻体 细胞表面水分去除；

2.取表面已经干燥的葡萄藻藻体，放入已灭菌的培养基中进行再悬浮；此时 葡萄藻单细胞与胞外组织分离，为单细胞和胞外组织的混合物。

3.用300目网筛过滤收集葡萄藻胞外组织，将胞外组织冷冻干燥；

4.取一定量冻干的葡萄藻胞外组织放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为 15-20ml的小玻璃瓶中,加入5-10ml正己烷超声10-30min中，3500转离心，收 集正己烷提取液。将沉淀物重复上述过程2次以上，收集所有的正己烷提取液， 转移至预先称重的螺口试管中，然后在室温下用氮气将正己烷吹干，称重。螺 口试管前后质量之差即为总烃质量，用以下公式计算总烃百分含量：

总烃百分含量=(总烃质量/藻粉质量)×100%

对葡萄藻藻粉、葡萄藻胞外组织干粉和葡萄藻干藻体细胞的总烃含量进行 了比较，结果见表2。

表2

从表1中可以看出，葡萄藻胞外组织总烃含量达50%以上，高出葡萄藻藻 粉含烃量的60%以上，而葡萄藻干细胞含烃量仅为5%，说明葡萄藻烃类大部分 分泌到胞外组织中，故直接利用胞外组织提取油脂，油脂提取效率更高。

实施例4对获得的单细胞进行再培养

将生长在对数期的葡萄藻藻液通过过滤浓缩，并采用本发明的方法获得单 细胞，以未经处理的藻体作为对照，将获得的单细胞进行再培养实验：将藻体 接种于含BG11培养基的4cm内径的柱式光照反应器中，使OD750值达到0.1 以上，1-2%CO2通气量，24h光照，培养过程光照强度控制在50-500μmol/m2.s， pH值调节在7-9之间，温度调控在15-35℃范围内。培养16天后，未经处理的 藻体生物量仅达到3.83g/L，经处理过的藻体生物量可达到8.53g/L。使用葡萄藻 单细胞比使用群体显著提高了光能利用率，大幅度提高了产量（见图5）。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法， 但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述 详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的 任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、 具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。