一种促进L-山梨糖转化生成2-酮基-L-古龙酸的方法

摘要

一种促进L-山梨糖转化生成2-酮基-L-古龙酸的方法，属微生物发酵技术领域，它包括种子培养和发酵培养二步骤，是通过在发酵培养基中以0.75～2.00g/L的添加量添加黄芪提取物，或以1.50～3.00g/L的添加量添加天麻提取物，或分别以1.00～1.50g/L、1.50～2.00g/L的添加量同时添加黄芪提取物和天麻提取物促进普通生酮基古龙酸菌（小菌）和巨大芽孢杆菌（大菌）协调生长实现2-酮基-L-古龙酸高效合成的，它通过协调两种菌的相互作用，不仅促进了小菌生长，提高了2-酮基-L-古龙酸的产量，而且还缩短了发酵周期。本发明经采用10L罐进行发酵试验，获得了预期的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进L-山梨糖转化生成2-酮基-L-古龙酸的方法，特别 是一种通过在发酵培养基中添加黄芪、天麻或黄芪和天麻的提取物促 进普通生酮基古龙酸菌（小菌）和巨大芽孢杆菌（大菌）协调生长实 现2-酮基-L-古龙酸高效合成的方法。属微生物发酵技术领域。

背景技术

维生素C(Vitamin C，简称Vc)又称L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)  ，是人体必需的维生素，生理作用广泛，在医药和食品工业中均占有 重要地位。目前国内普遍采用我国自主研发的“二步发酵法”生产， “二步发酵法”的第一步是单菌发酵，将D-山梨醇转化成L-山梨糖； 第二步是混合菌发酵，通过普通生酮基古龙酸菌Ketogulonogenium  vulgarum（俗称小菌）和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium（俗称 大菌）的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）；2- 酮基-L-古龙酸再经过提取和转化生成维生素C。

在“二步发酵法”生产维生素C的第二步混合菌发酵过程中，小菌是产 酸菌，但单独培养生长缓慢，产酸能力低，大菌自身不产酸，而作为 伴生菌与小菌共同培养时可促进其生长和产酸，因此，促进两菌株之 间的协调生长，对提高产酸能力是非常必要的。

黄芪作为中草药具有多种作用而应用广泛，其化学成分主要是黄酮类 、皂苷类和多糖类化合物，黄芪多糖和黄芪皂苷是黄芪含量较高的主 要成分，此外，黄芪还含单糖、氨基酸、蛋白质、核黄素、叶酸、尼 克酸、维生素P、亚油酸、亚麻酸、硒及硅等多种微量元素。目前，黄 芪在微生物发酵当中已有应用，它对微生物的生长在很大程度上能起 到促进或抑制作用。

天麻作为著名的中草药早在两千多年前就已闻名于世，其含量较高的 主要成分是天麻素，除此之外，天麻还含有香草醇、枸橼酸、枸橼酸 甲酯、琥 珀酸、棕榈酸、β-谷甾醇、胡萝卜甙、蔗糖、天麻多糖，以及铁、氟 、锰、锌、锶、碘、铜等多种微量元素。如今天麻的作用在食品和医 药中已得到开发和应用，它含有的多种成分在微生物培养中所发挥的 作用也被肯定。

黄芪和天麻的提取物对微生物的生长有一定影响，但至今尚未见两种 中草药提取物对2-酮基-L-古龙酸高效合成影响的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供“二步发酵法” 维生素C生产技术 一种促进L-山梨糖转化生成2-酮基-L-古龙酸的方法，即一种通过在发 酵培养基中添加黄芪、天麻或黄芪和天麻的提取物促进普通生酮基古 龙酸菌（小菌）和巨大芽孢杆菌（大菌）协调生长实现2-酮基-L-古龙 酸高效合成的方法。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案为：一种促进L-山梨糖转化 生成2-酮基-L-古龙酸的方法，即一种通过在发酵培养基中添加黄芪、 天麻或黄芪和天麻的提取物促进普通生酮基古龙酸菌（小菌）和巨大 芽孢杆菌（大菌）协调生长实现2-酮基-L-古龙酸高效合成的方法，它 是按如下步骤：

一、种子培养

制备普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌种液；

二、发酵培养

1、按配方称取发酵培养基各成分及拟在发酵培养基中以0.75～2.00g /L的添加量添加的黄芪提取物，或以1.50～3.00g/L的添加量添加的天 麻提取物，或分别以1.00～1.50g/L、1.50～2.00g/L的添加量同时添 加的黄芪提取物和天麻提取物；

2、制备发酵培养基；

3、将制备的混合菌种液以10％的接种量(v/v)接种于添加了黄芪提取 物，或天麻提取物，或同时添加了黄芪提取物和天麻提取物的发酵培 养基中，在温度28～32℃、pH6.0～7.2、搅拌转速150～500rpm/min、 通气量3～15L/min、罐压0.02～0.05MPa的条件下发酵，至终点，生产 2-酮基-L-古龙酸的。

本发明的有益效果：在发酵培养基中添加0.75～2.00g/L的黄芪提取物 、1.50～3.00g/L的天麻提取物或1.00～1.50g/L的黄芪提取物和1.50 ～ 2.00g/L的天麻提取物，通过协调两种菌的相互作用，不仅促进了小菌 生长，提高了2-酮基-L-古龙酸的产量，而且还缩短了发酵周期，实现 了高效合成2-酮基-L-古龙酸的目的。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，举出以下实例。但本发明的范围并不仅仅局 限于此，其要求保护的范围记载于权利要求的权项中。

实施例1～9，通过在发酵培养基中分别以0.00g/L 、0.50g/L、0.75 g/L、1.00g/L、1.25g/L、1.50g/L、1.75g/L、2.00g/L、2.50 g/L的 添加量M（g/L）添加黄芪提取物，用下述“促进L-山梨糖转化生成2- 酮基-L-古龙酸的方法”生产2-酮基-L-古龙酸，步骤如下：

一、种子培养

按配方称取种子培养基各成分，制备种子培养基 (g/L)：L-山梨糖2 0、酵母膏3、牛肉膏3、蛋白胨10、玉米浆1.5、尿素1、KH₂PO₄ 1、Mg SO₄ 0.2、CaCO₃ 1，调节pH为6.5～7.0，121℃灭菌20min；

刮取一环大小菌混合菌新鲜斜面上菌苔接种于制备的种子培养基中， 在温度28～30℃、搅拌转速200rmp/min的条件下培养20～22h，制备普 通生酮基古龙酸菌（小菌）和巨大芽孢杆菌（大菌）的混合菌种液；

二、发酵培养

1、按配方称取发酵培养基各成分及拟在发酵培养基中添加的黄芪提取 物；

2、制备发酵培养基(g/L)：L-山梨糖80、玉米浆10、尿素2、KH₂PO₄  1、MgSO₄ 0.2、黄芪提取物 M，调节pH为7.0～7.2，于10L发酵罐中 121℃灭菌20min，其中L-山梨糖、尿素单独灭菌；

3、将制备的混合菌种液以10％的接种量(v/v)接种于添加了黄芪提取 物的发酵培养基中，10L发酵罐中发酵培养基的装液量为7L，在温度2 8～32℃（自控）、pH6.0～7.2、搅拌转速200～500rpm/min、通气量 5～12L/min、罐压0.03～0.04MPa的条件下发酵，至终点，生产2-酮基 -L-古龙酸。

取得的效果如表1所示。

表1：

表1反映黄芪提取物对普通生酮基古龙酸菌（小菌）和巨大芽孢杆菌（ 大菌）的混合菌生长产酸有一定的促进作用，与对照相比，在发酵培 养基中分别以0.75g/L、1.00g/L、1.25g/L、1.50g/L、1.75g/L、2.0 0g/L的添加量添加黄芪提取物，至发酵终点：2-KGA积累量至少提高1 .15mg/mL、发酵周期至少缩短2h、2-KGA生成速率至少提高6.08%，而 其中又以在发酵培养基中以1.50g/L的添加量添加黄芪提取物效果最佳 ，至发酵终点：2-KGA积累量提高了3.08mg/mL、发酵周期缩短了4h、 2-KGA生成速率提高了13.26%。

实施例10～16，通过在发酵培养基中分别以0.00g/L、1.00g/L、1.50 g/L、2.00g/L、2.50g/L、3.00g/L、3.50g/L的添加量N（g/L）添加天 麻提取物，用下述“促进L-山梨糖转化生成2-酮基-L-古龙酸的方法” 生产2-酮基-L-古龙酸，步骤如下：

一、种子培养

同实施例1～9；

二、发酵培养

1、按配方称取发酵培养基各成分及拟在发酵培养基中添加的天麻提取 物；

2、制备发酵培养基(g/L)：L-山梨糖80、玉米浆10、尿素2、KH₂PO₄  1、 MgSO₄ 0.2、天麻提取物 N，调节pH为7.0～7.2，于10L发酵罐中12 1℃灭菌20min，其中L-山梨糖、尿素单独灭菌；

3、将制备的混合菌种液以10％的接种量(v/v)接种于添加了天麻提取 物的发酵培养基中，10L发酵罐中发酵培养基的装液量为7L，在温度2 8～32℃（自控）、pH6.0～7.2、搅拌转速200～500rpm/min、通气量 5～12L/min、罐压0.03～0.04MPa的条件下发酵，至终点，生产2-酮基 -L-古龙酸。

取得的效果如表2所示。

表2：

表2反映天麻提取物对普通生酮基古龙酸菌（小菌）和巨大芽孢杆菌（ 大菌）的混合菌生长产酸有一定的促进作用，与对照相比，在发酵培 养基中分别以1.50g/L、2.00g/L、2.50g/L、3.00g/L的添加量添加天 麻提取物，至发酵终点：2-KGA积累量至少提高1.93mg/mL、发酵周期 至少缩短1.5h、2-KGA生成速率至少提高5.49%，而其中又以在发酵培 养基中以2.50g/L的添加量添加天麻提取物效果最佳，至发酵终点：2 -KGA积累量提高了3.85mg/mL、发酵周期缩短了4.5h、2-KGA生成速率 提高了15.38%。

实施例17～26为正交试验设计，通过在发酵培养基中分别以0.00g/L、 1.00g/L、1.00g/L、1.00g/L、1.25g/L、1.25g/L、1.25g/L、1.50g/ L、1.50g/L、1.50g/L的添加量M（g/L）添加黄芪提取物＋在发酵培养 基中分别以0.00g/L、1.50g/L、1.75g/L、2.00g/L、1.50g/L、1.75g /L、2.00g/L、1.50g/L、1.75g/L、2.00g/L的添加量N（g/L）添加天 麻提取物，用下述“促进L-山梨糖转化生 成2-酮基-L-古龙酸的方法”生产2-酮基-L-古龙酸，步骤如下：

一、种子培养

同实施例1～9；

二、发酵培养

1、按配方称取发酵培养基各成分及拟在发酵培养基中同时添加的黄芪 提取物和天麻提取物；

2、制备发酵培养基(g/L)：L-山梨糖80、玉米浆10、尿素2、KH₂PO₄  1、MgSO₄ 0.2、黄芪提取物 M、天麻提取物 N，调节pH为7.0～7. 2，于10L发酵罐中121℃灭菌20min，其中L-山梨糖、尿素单独灭菌；

3、将制备的混合菌种液以10％的接种量(v/v)接种于同时添加了黄芪 提取物和天麻提取物的发酵培养基中，10L发酵罐中发酵培养基的装液 量为7L，在温度28～32℃（自控）、pH6.0～7.2、搅拌转速200～500 rpm/min、通气量5～12L/min、罐压0.03～0.04MPa的条件下发酵,至终 点,生产2-酮基-L-古龙酸。

取得的效果如表3所示。

表3：

1、表3反映了黄芪提取物＋天麻提取物对普通生酮基古龙酸菌（小菌 ）和巨大芽孢杆菌（大菌）的混合菌生长产酸的促进作用，与对照相 比，在发酵培养基中分别以1.00g/L、1.00g/L、1.00g/L、1.25g/L、 1.25g/L、1.25g/L、1.50g/L、1.50g/L、1.50g/L的添加量添加黄芪提 取物＋在发酵培养基中分别以1.50g/L、1.75g/L、2.00g/L、1.50g/L 、1.75g/L、2.00g/L、1.50g/L、1.75g/L、2.00g/L的添加量添加天麻 提取物，至发酵终点：2-KGA积累量至少提高2.31mg/mL、发酵周期至 少缩短1.5h、2-KGA生成速率至少提高6.04%；

2、表3还反映黄芪提取物和天麻提取物同时在发酵培养基中添加的最 佳搭配添加量为：黄芪提取物1.25g/L、天麻提取物1.75g/L，至发酵 终点：2-KGA积累量提高了4.24mg/mL、发酵周期缩短了5h、2-KGA生成 速率提高了17.58%。

附录：

2-KGA含量的测定方法

2-KGA采用改进的碘量法测定，具体方法如下：准确吸取样品2mL于试 管中，加入7mol/L硫酸2mL，摇匀后于沸水浴中加热25min，取出冷却 后用纯化水分次洗入250mL三角瓶中，加入0.5%淀粉溶液3mL，用0.1m ol/L碘液滴定至蓝色30s不褪去，即为滴定终点。

发酵液残糖含量的测定方法

采用蒽酮法测定发酵液中残糖，具体方法为：取发酵液样品1mL于100 mL容量瓶中加纯化水定容，再吸取1mL定容稀释液于洁净干燥的试管中 ，加入6mL蒽酮溶液摇匀静置10min；空白对照以纯化水替代发酵液样 品进行上述操作；利用分光光度计在波长620nm处比色测OD值，然后换 算为残糖含量。当发酵液残糖含量≤0.42mg/mL时，即为发酵终点。