基于生理特性解析的2-酮基-L-古龙酸发酵工艺研究

摘要

本论文以胞外大量积累2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的维生素C生产菌株普通生酮古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgaer)WSH-001和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)WSH-002组成的混菌体系为研究对象,以提高2-KLG生产效率为目标,研究了高渗条件下混合菌系细胞生长和代谢特征,氨基酸对2-KLG生产的作用以及关键氨基酸种类的确定,提出用廉价明胶代替L-甘氨酸和L-脯氨酸作用的策略,并进行1 m3搅拌罐和200 m3气升发酵罐放大实验,成功地实现了维生素C生产效率的提升。主要研究结果如下:
　　 (1)在详细考察了2-KLG工业化生产过程中渗透压变化规律的基础上,研究了高渗对混合菌系细胞生长和2-KLG合成的影响,提出蔗糖促进伴生菌巨大芽胞杆菌生长,进而促进普通生酮古龙酸菌生长和产酸的策略。结果表明,2-KLG的积累和碱性物质(Na2CO3)的流加使渗透压上升了832 mOsmol/kg;高渗抑制了巨大芽胞杆菌的生长(15.40％),从而抑制普通生酮古龙酸菌(31.7％)的生长,导致2-KLG产量和生产强度分别下降67.5％和69.3％(以1250 mOsmol/kg为例);蔗糖的添加则显著促进巨大芽胞杆菌的生长,使高渗条件下(摇瓶,1250 mOsmol/kg)2-KLG产量(40.6 g/L)提高87％;在3L发酵罐中,补加10 mmol/L蔗糖使2-KLG发酵周期缩短10.8％,2-KLG生产强度提高10.4％。
　　 (2)利用蛋白质组学、基因组学技术并结合不同批次玉米浆(CSL)对2-KLG生产的影响,确定了影响2-KLG生产的关键氨基酸种类。结果表明,巨大芽孢杆菌裂解液使普通生酮古龙酸菌L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸以及L-谷氨酰胺合成途径中相关的蛋白(酶)表达上调;普通生酮古龙酸菌L-组氨酸、L-甘氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸从头合成途径不完全;在摇瓶分批发酵添加关键氨基酸L-甘氨酸、L-脯氨酸和L-苏氨酸时,发酵周期分别缩短至58 h(缩短17.1％),62 h(缩短11.4％)和60 h(缩短16.7％),2-KLG生产强度分别达1.12±0.02 g/L/h(提高20.4％),1.04±0.01 g/L/h(提高11.80％)和1.09±0.02 g/L/h(提高17.2％)。
　　 (3)详细分析了明胶的组成成分,提出用廉价明胶代替L-甘氨酸和L-脯氨酸作用的策略,并将实验结果在1 m3和200 m3发酵罐上进行放大。结果表明,明胶中对2-KLG发酵有显著促进作用的关键氨基酸-L-甘氨酸和L-脯氨酸在明胶中的质量分数占34.21％;在1 m3搅拌罐上用明胶代替L-甘氨酸和L-脯氨酸的作用时,2-KLG发酵周期缩短至43 h(缩短15.6％),2-KLG产酸速率提高到1.89 g/L/h(增加25.2％);在200 m3气升发酵罐上进行明胶生产试验,发酵周期缩短至55 h(缩短8％),2-KLG产量达到102.28 g/L,2-KLG产酸速率提高到1.86 g/L/h(增加9.3％)。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 维生素C的性质及用途

1.2.1 维生素C的性质

1.2.2 维生素C的用途

1.3 维生素C的合成:“莱氏法”及相关微生物转化法

1.4 维生素C“二步发酵法”研究进展

1.4.1 维生素C“二步发酵法”产酸菌与伴生菌的相互关系

1.4.2 维生素C“二步发酵法”混菌发酵工艺研究

1.5 本论文主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 菌种

2.2 仪器

2.3 培养基

2.4 培养方法

2.5 测定方法

第三章 结果与讨论

3.1 高渗条件下利用蔗糖提升2-酮基-L-古龙酸生产效率

3.1.1 2-KLG积累是发酵体系中渗透压提升的主因

3.1.2 高渗对2-KLG发酵的影响

3.1.3 蔗糖促进高渗条件下2-KLG生产

3.1.4 蔗糖提升分批发酵2-KLG生产效率

3.1.5 讨论

3.1.6 结论

3.2 关键氨基酸提升2-KLG的生产强度

3.2.1 巨大芽孢杆菌裂解液促进普通生酮古龙酸菌氨基酸合成

3.2.2 普通生酮古龙酸菌氨基酸合成途径分析

3.2.3 CSL关键氨基酸的确定

3.2.4 关键氨基酸强化2-KLG生产效率

3.2.5 结论

3.3 明胶强化2-KLG生产强度及其工业化

3.3.1 明胶成分分析

3.3.2 明胶强化2-KLG生产强度

3.3.3 1 m3搅拌罐中试试验

3.3.4 200 m3气升罐生产试验

3.3.5 结论

3.4 本章结论

第四章 展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文