一种用于早期检测下颌前突的血清/血浆miRNA标志物及应用

摘要

一种用于早期检测下颌前突的血清/血浆miRNA标志物及应用，该标志物为let-7i-3p或miR-595中的一种或者两种组合物。本发明所述的血清/血浆miRNA标志物研制出的检测试剂或工具，为下颌前突的发生和进展机制的研究提供数据支持；通过血清/血浆miRNA标志物诊断试剂盒的研制和应用，使得下颌前突的早期检测方便易行，为口腔正畸临床医生及早发现骨性下颌前突并采取有效恰当的治疗方案提供有力的支持，从而有效地减少了治疗时间并避免了不必要的往返治疗，还能够对病例进行治疗动态评估及预后监测，从而有助于减少下颌前突的复发。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于早期检测下颌前突患者的血清/血浆miRNA标 志物及其应用。

背景技术

下颌前突导致的前牙反合是口腔正畸临床的常见畸形。前牙反合，俗称“地包天”，表现 为正中咬合时上前牙位于下前牙内侧，可影响牙齿和面型的美观、降低咀嚼效率，甚至导致 颞下颌关节病并影响心理健康。由于复杂的颅颌面结构及不可预测的下颌生长方向，下颌前 突所致的骨性反合治疗难度很大，且治疗后易复发，部分患者在治疗5-8年后仍需要正畸和 正颌手术联合治疗。骨性反合是逐渐发育形成的，下颌前突的早期检测诊断有利于治疗方案 的制定，也有利于疗效的评估和复发机率的预测。

下颌前突无论是对患者本身的生活还是心理都有较大的危害，但是目前的体检方法无法 准确地判断前牙反合到底是由骨性的下颌前突还是单纯的功能性错合导致。因此，要有效地 治疗下颌前突，获得更好的治疗效果和预后情况，就需要获得更为灵敏、特异、易于检测的 标志物。

microRNA（miRNA）是一类非编码的单链小分子RNA,广泛存在于各生物物种中，目 前发现有8000余种。它可与信使RNA(mRNA)上任意与之互补的序列相结合而抑制基因转录， 或者使mRNA降解从而抑制基因表达。在各类小RNA中，miRNA具有最广泛的调节功能， 它能对基因活动(生长、分化、凋亡等)的各个层面进行调节，它在细胞中担当“刹车”的功能， 保障基因表达的准确性，在疾病的发生发展中发挥重要作用。miRNA虽然只占人类基因总数 的2％，却调控着人类30％以上的基因的表达。它被Science杂志评为2002年度“十大科学突 破”之首，超过物理学界的中微子等重大发现，Nature、Science等杂志曾连续四年强调其重要 性；miRNA研究的突破性进展，被称为可与HGP（人类基因组计划）相提并论，是生物医 学领域近20年来重大成果之一。目前，围绕miRNA的研究在国内外正如火如荼地进行着， 我们不难推测miRNA将是未来几年内研究的焦点之一。

miRNA不仅具有高度的组织特异性，以往研究还表明血清/血浆在室温24小时后再反复 冻融8次，其中miRNA含量仍保持不变，它们的稳定性使得其实际值与在病人身上得到的 测试值吻合得很好，从而在判断血清/血浆异常表达miRNA的功能时有其可行性。

寻找疾病的生物学标志一直是一个重要的研究领域。从患病部位（如肿瘤组织等）取组 织测定蛋白或核酸表达，寻找该病的生物学标志，有利于了解该疾病的形成机制，以及早期 诊断和治疗、疗效检测等，但该操作创伤较大，不利于临床广泛开展。血清/血浆样本采集方 便、创伤性小，易于实施，10ul便足够分析数十种miRNA的表达水平。

近来研究表明血清/血浆miRNA标志物在骨骼和颅颌面发育过程中发挥着重要调控作用， 并可用于多种疾病的前期诊断和治疗指导，但还没有关于血清/血浆miRNA用于检测下颌前 突方面的报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明的首要目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种用于早期 检测下颌前突的血清/血浆miRNA标志物。

本发明的另一目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物在制备上颌前突早期诊断、预后 检测的试剂盒中的应用。

本发明的又一目的是提供用于下颌前突早期检测的试剂盒。

申请人通过分离和研究下颌前突及年龄匹配的正常对照血清/血浆中的miRNAs，寻找与 下颌前突高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，为下颌前突的早期检测、筛查和诊断提 供数据支持，为下颌前突的预后及临床治疗效果的评价提供数据支持。

技术方案：

一种用于早期检测下颌前突的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为let-7i-3p或miR-595 中的一种或者两种组合物。

上述用于早期检测下颌前突的血清/血浆miRNA标志物在制备早期检测下颌前突的试剂 盒中的应用。

一种下颌前突早期检测诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中let-7i-3p或miR-595 中的一种或者两种组合物。

一种下颌前突早期诊断试剂盒，该试剂盒含有一种或者两种血清/血浆miRNA标志物的 引物：let-7i-3p的引物（Taqman引物探针货号002172）和miR-595的引物（Taqman引物探 针货号001987），可由Applied Biosystems公司（美国）购得。

所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲 液，dNTPs，MgCl₂和DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。

本发明所述的血清/血浆miRNA标志物的筛选方法包括以下步骤（图1）：

（1）建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序（SOP）从医院采集的血液样本， 系统收集完整的人口学资料和临床资料。

（2）血清/血浆miRNA差异表达谱分析：采用microarray生物芯片，对下颌前突患者和 正常对照者的血清/血浆中已知的人全部成熟miRNAs进行检测，筛选出差异表达的miRNAs： let-7i-3p（SEQ ID No.1），miR-595（SEQ ID No.2），miR-16-2-3p（SEQ ID No.3）和miR-367-5p （SEQ ID No.4）（表1）。

（3）用实时定量PCR方法（Taqman探针法）筛选可用作检测标志物的血清/血浆miRNA: 对下颌前突患者和正常对照者的血清/血浆进行miRNA的提取,逆转录，并进行大样本实时定 量分析验证，确定能够用于区分下颌前突患者和正常对照组的miRNAs：let-7i-3p（SEQ ID No.1） 和miR-595（SEQ ID No.2）。

（4）血清/血浆miRNA诊断试剂盒的研制：根据实时定量PCR最终筛选出的差异表达 的血清/血浆miRNAs，开发特异miRNAs（let-7i-3p、miR-595中的一种或者两种）诊断试剂 盒，实现临床上对下颌前突的早期检测和预后监测的目的。诊断试剂盒包括let-7i-3p、miR-595 的Taqman引物探针，逆转录酶，Taq酶，缓冲液，dNTPs等试剂。

本发明使用的检测方法可以选自：microarray生物芯片、miRNA提取、逆转录、实时定 量PCR方法中的一种或几种。

以下是本发明进一步的说明：

在microarray生物芯片测序结果，本发明人检测到18例下颌前突和18例正常对照血清/ 血浆中存在差异表达且有统计学意义（P<0.05）的miRNAs包括：miR-16-2-3p，miR-369-3p， miR-24-2-5p，miR-450a，miR-500a-3p，miR-595，miR-502-3p，miR-18a-3p，miR-367-5p， miR-3142，let-7i-3p。

根据上述结果，选择满足下列条件的miRNAs并用实时定量PCR进一步验证：1）两组 的差异倍数达2倍及2倍以上（P<0.05）的miRNA作为本发明中初步筛选出的血清/血浆marker； 2）这些miRNAs在两组研究对象中的芯片拷贝数都要大于50，以提高检测效率。

满足上述条件的miRNAs包括：miR-16-2-3p，miR-595，miR-367-5p，let-7i-3p（图2）。 实时定量PCR结果发现在剩下的42例下颌前突和50例正常对照样本中，有2种miRNAs在 下颌前突组和正常对照组中的表达情况存在显著性差异：let-7i-3p在下颌前突病例中高表达， miR-595在下颌前突病例中低表达。

多因素logistic回归分析及ROC曲线分析结果表明，这2种miRNAs的表达水平均与下 颌前突存在着显著关联。let-7i-3p的曲线下面积（AUC）达到0.896（95%可信区间为 0.817-0.976）,miR-595的AUC达到0.923（95%可信区间为0.860-0.986）（图3）。在截断 点设为0.65时,let-7i-3p达到敏感度83.3％，特异性92.9%；miR-595达到敏感度85.7%,特异 性95.2%，显示了let-7i-3p和miR-595对下颌前突诊断具有较高的特异性和敏感性

本说明书中血清/血浆是指血清和（或）血浆。

有益效果：

1、血清/血浆miRNA标志物是一种新型生物标志物，与传统生物标志物相比具有很多优 势：1）血清/血浆采集方便、创伤性小，易于实施；2）miRNA在血清/血浆中表达稳定，测 试值与在病人身上得到的实际值吻合；3）定量准确，对疾病诊断的敏感性和特异性很高；4） 血清/血浆miRNA检测能在分子水平上反映疾病发生过程的基因转录后调控状态，通过 TargetScan官方网站及基因功能分析软件（Gene Ontology）可以为下颌前突发病机制的分子 研究与治疗提供潜在的靶基因与信号通路。因此，血清/血浆miRNA标志物的成功开发是对 以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为下颌前突提供分子治疗的可能性，并为其它疾病 的生物标志物研制提供借鉴。

2、本发明所述的血清/血浆miRNA标志物研制出的检测试剂或工具，为下颌前突的发生 和进展机制的研究提供数据支持；通过血清/血浆miRNA标志物诊断试剂盒的研制和应用， 使得下颌前突的早期检测方便易行，为口腔正畸临床医生及早发现骨性下颌前突并采取有效 恰当的治疗方案提供有力的支持，从而有效地减少了治疗时间并避免了不必要的往返治疗， 还能够对病例进行治疗动态评估及预后监测，从而有助于减少下颌前突的复发。

附图说明

图1是血清/血浆miRNA标志物的筛选及试剂盒的主要流程。

图2是初筛的血清/血浆miRNA标志物在实时定量PCR中的表达水平。

图3显示多因素logistic回归分析let-7i-3p、miR-595诊断下颌前突的ROC曲线。

具体实施方式

实施例1

样本的收集与整理：

发明人于2011年7月至2012年8月间从南京医科大学附属口腔医院正畸科收集了128 例（60例下颌前突的血清样本和68例正常对照的血清样本）符合标准的样本进行研究。

研究样本的选择标准：

（1）临床患者的侧貌面型为凹面型；

（2）口腔内及模型检查为前牙反合；

（3）X片测量为上颌正常，下颌前突；

（4）与病例年龄匹配的生长期正常对照。

microarray芯片测序：

利用microarray生物芯片检测收集的样本中随机选取的18例生长期下颌前突患者和18 例正常对照的血清样本。芯片检测由康辰生物科技有限公司（上海，中国）完成。从芯片结 果中筛选表达差异超过2倍（P<0.05）的miRNAs。

miRNAs的提取：

运用NucleoSpin试剂盒（MACHEREY-NAGEL公司，德国）对剩余的42例下颌前突样 本和50例正常对照样本的血清进行miRNAs提取，具体步骤如下：

1)样本准备

血清样本于-80℃储存，4℃融化，摇晃均匀。取2mL RNase-free EP管,吸入300μL血 清，加入2μLcel-miR-238对照探针（SEQ ID No.5）（表1）作为各个样本之间的统一参照， 加入90μL MPL裂解液。震荡5s。室温静置3min。

2)沉淀蛋白质

加入30μLMPP蛋白沉淀缓冲液，震荡5s，室温静置1min。11,000g/min转速（下同） 离心30s，沉淀蛋白质。

3)调整DNA及RNA结合环境

将上清液转移至2mL收集管（带盖），加入400μL异丙醇以调整DNA及RNA结合 环境，震荡5s。

4)结合DNA及RNA

将样本加在分离柱套管上，室温静置2min，离心30s。

5)洗涤、干燥

加入100μL MW1冲洗缓冲液，离心30s,弃去过滤液。。

加入700μLMW2冲洗缓冲液，离心30s,弃去过滤液。

加入700μLMW2冲洗缓冲液，离心2min,以干燥miRNA分离柱膜。弃去过滤液。

6)洗脱RNA

加入50μLRNase-free水，室温孵育1min，离心1min。-80℃保存。

miRNAs的逆转录：

运用miRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems公司，美国）合成cDNA。具体步骤如 下：

1)配置反应体系

5μL的逆转录（RT）反应系统由1μL探针，0.05μL的dNTPs，0.33μL的RTase酶，0.5 μL逆转录缓冲液，0.063μLRNA酶抑制剂，1.387μLRNase-free水和1.67μL的RNA样品 组成，轻轻摇晃均匀。

2)逆转录

反应在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟，在85℃下孵育5分钟，然后保持 在4℃。

实时定量PCR：

运用TaqMan PCR试剂盒（Applied Biosystems公司，美国）进行实时定量PCR反应。 具体步骤如下：

1)稀释cDNA

反转录完成的5μL cDNA产物中加入28.9μLRNase-free水，稍震荡，离心。

2)配置反应体系

于超净工作台冰板上配置反应体系：5μL的PCR反应体系包括0.25μLPCR探针，2.5μL TaqMan通用PCR Master Mix，2.25μL稀释的cDNA，稍震荡，离心。

3)设置空白对照

5μL的空白对照包括0.25μL PCR探针，2.5μL TaqMan通用PCR Master Mix，2.25μL RNase-free水。

4)定量PCR：

设定开始，在50℃下2min，95℃下10min，然后进行40个热循环：95℃下15s及60℃ 下1min。每一组设置空白对照，以检测过程中是否有污染。

数据的分析：

采用miRNA的表达量的2^-ΔΔCT算术公式计算，并采用Mann-Whitney U检验测试。P <0.05视为差异有统计学意义。为了提高诊断的准确性，对实时定量PCR的结果利用多因素 logistic回归分析及ROC曲线验证。通过曲线下面积（AUC）和95％可信区间的计算，确定 目标miRNA诊断下颌前突的特异性和敏感性。

用于下颌前突早期检测的诊断试剂盒的制作：

miRNA诊断试剂盒的制作和操作流程是基于microarray生物芯片，实时定量PCR，Taqman 探针法等技术。

试剂盒包括两种miRNA的Taqman引物探针（let-7i-3p的引物探针货号为002172,miR-595 的引物探针货号为001987），可由Applied Biosystems公司购得；还可以有相应PCR技术所 需的常用试剂，如：Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂和DEPC水等，这些都是本 领域技术人员熟知的；另外还可以含有标准品和/或对照品。此试剂盒的价值在于只需要血清 /血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的Taqman探针法检测miRNAs的变化趋势，再通 过趋势判断是否骨性下颌前突，不仅稳定，检测方便，且定量准确，大大提高疾病诊断的敏 感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助口腔正畸临床医生指导诊断，并且更有 效的制定治疗方案和实行预后监测。

表1miRNA序列及探针信息

序列表

 

<110>  南京医科大学

 

<120>  一种用于早期检测下颌前突的血清/血浆miRNA标志物及应用

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cugcgcaagc uacugccuug cu                                              22

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gaagugugcc gugguguguc u                                               21

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ccaauauuac ugugcugcuu ua                                              22

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

acuguugcua auaugcaacu cu                                              22

 

 

<210>  5

<211>  23

<212>  RNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

uuuguacucc gaugccauuc aga                                             23