用于口服胰岛素递送的包含阳离子纳米粒子的肠溶包衣胶囊

摘要

本发明涉及用于口服胰岛素递送的包含阳离子纳米粒子的肠溶包衣胶囊，具体地涉及阳离子纳米粒子，其包含聚阳离子的粘膜粘附聚合物以及可生物降解的聚合物，其中纳米粒子具有正表面电荷和增强的通透性用于胰岛素旁细胞递送；所述肠溶包衣胶囊还包含作为包衣的pH-敏感的聚合物。所述含有阳离子纳米粒子的肠溶包衣胶囊用于口服胰岛素给药，胰岛素在肠道释放并加强吸收，防止胰岛素在胃部被降解。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年8月4日提交的美国临时申请序列号61/573,014的优 先权，该申请的公开内容通过引用结合于本文中。

技术领域

本发明涉及用于口服胰岛素递送的包含阳离子纳米粒子的肠溶包衣胶囊， 并且更具体地，涉及包含载有胰岛素的阳离子纳米粒子的肠溶包衣胶囊，所述 阳离子纳米粒子的每个纳米粒子中包含一类能够控制释放胰岛素的聚阳离子聚 合物。本发明还涉及制备阳离子纳米粒子和制备包含所述阳离子纳米粒子的肠 溶包衣胶囊的方法。

背景技术

每天多次注射胰岛素仍然是用于治疗胰岛素依赖性糖尿病患者的传统方式 (Drug Discovery Today 2001，6：1056-1061)。然而，与该治疗相关的缺点是血 液葡萄糖水平的次优控制和患者依从性差(Drug Dev Res 2004，63：151-160)。 口服胰岛素递送是将胰岛素施用于糖尿病患者的较便利方式，因为其是生理学 上最舒适的方式(Pharm Technol 2001，10：76-90；Journal of Drug Targeting 2010， 18：79-92)。尽管如此，形成口服制剂对于所有生物活性大分子来说都是一件 令人怯步的工作，其原因是大分子在胃肠(GI)道中所遇到的不同障碍，诸如 快速的酶降解和不良的肠吸收(J Controlled Release 2000，64：217-228)。另外， 具有窄吸收窗的蛋白质药物经常在肠胃不同部位暴露，导致它们在GI道中药物 转运效果差(J Pharmacol Exp Ther 2001，297：638)。许多年来，已经开发了多 种策略以增强胰岛素的口服递送(Advanced Drug Delivery Reviews 2007，59： 1521-1546；Diabetes Obesity & Metabolism 2010，12：179-185)。纳米粒子聚合物 由于其制药方面的优势而特别受到关注，诸如能够调节纳米粒表面的物理化学 特性(Critical reviews in therapeutic drug carrier systems(治疗性药物载体系统 方面的评论综述)2005，22：419-463)。此外，与较大的载体相比，它们的亚 微米尺寸和它们的大比表面积有助于它们的吸收(International journal of  pharmaceutics 2004，285：135-146；Advanced drug delivery reviews 2007，59： 631-644)。

为了克服上面提到的障碍，口服胰岛素纳米粒子已经被广泛研究以增加它 们在实验动物中的生物利用度(Expert Opinion on Drug Delivery 2008，5：45-68； Biodrugs 2008，22：223-237；J Controlled Release 2006，116：1-27)。口服递送胰 岛素的第一个障碍在介于肠和外界环境之间的胃中。纳米粒子的特殊pH-敏感 性通过防止胰岛素接触胃中高度酸性的介质而为通过第一屏障时提供保护作用 (Amino Acids 2009，37：97-97；J Controlled Release 2008，132：141-149；J Pharm  Sci 2007，96：421-427；Journal of Biomedical Materials Research Part B：Applied  Biomaterials 2006，76：298-305；Eur J Pharm Sci 2007，30：392-397；Biomaterials 2009，30：2329-2339)。口服递送胰岛素的第二个障碍是较差的肠吸收。为了克 服此障碍，开发了特殊的粘膜粘附性纳米粒子以延长胰岛素纳米粒子的肠停留 时间并且增加粘膜上皮细胞的通透性，由此最终促进胰岛素进入至全身循环中 (Biomaterials 2009，30：2329-2339；Biomaterials 2009，30：5691-5700；J Pharm  Sci 2009，98：4818-4830；Biomacromolecules 2008，9：278-285；Int J Pharm 2007， 342：240-249；U.S.Pat.No.7,871,988 B1)。具有pH-敏感性和粘膜粘附性的双 功能纳米粒子可以克服上面提及的所有障碍(Biomaterials 2010，31： 6849-6858)。将双功能纳米粒子插入至肠溶包衣胶囊中可以避免在胃中纳米粒 子的pH不稳定(Biomaterials 2010，31：3384-3394)。已经提出胰岛素纳米粒子 的正电荷是胰岛素吸收的积极因素(Int J Pharm 2000，194：1-13)。具有较多正 电荷的纳米粒子更有效地打开紧密连接，导致旁细胞通透性增加 (Nanotechnology 2007，18：1-11)。然而，具有粘膜粘附性和pH-敏感性的聚阳 离子纳米粒子可能是胰岛素的非协同载体，因为在这些纳米粒子中的聚合物的 正电荷可能降低纳米粒子在胃中的稳定性，并且这些纳米粒子中的聚合物的 pH-敏感性可能减少肠中的纳米粒子的正电荷特性(Biomaterials 2009，30： 2329-2339)。

幸运地是，GI障碍实际上是连续的；因此，达到治疗目的的可能性归因于 按顺序克服每个障碍(Current opinion in chemical biology 2005，9：343-346)。 多级递送系统具有不同功能的独立系统，其可以有效地克服各个障碍 (Proceedings of the National Academy of Sciences 2011，108：2426；Biochimica et  Biophysica Acta 2011；Nature nanotechnology 2008，3：151-157；美国专利公布号 2008/0311182 A1)。

因此，需要包括第一阶段中肠溶包衣胶囊和第二阶段中阳离子纳米粒子的 双阶段递送系统来实现不同阶段的高度选择性。这种双阶段递送系统将具有优 异的pH-敏感性和粘膜粘附性的协同效应。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于口服递送胰岛素的包含阳离子纳米粒子 的肠溶包衣胶囊。该肠溶包衣胶囊对pH值敏感，并且因此可以在小肠的上段 中快速溶解，并且连续地释放阳离子纳米粒子。本发明的阳离子纳米粒子用于 打开小肠中的紧密连接并且增强释放的胰岛素的吸收。

在示例性实施方案中，每个阳离子纳米粒子包含聚阳离子聚合物、可生物 降解的聚合物、胰岛素分子和稳定剂。在一个实施方案中，采用的聚阳离子聚 合物是分子量范围为150至200kDa的Eurdragit RS(RS)；所述可生物降解 的聚合物是分子量范围为20至40kDa的聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)；所 述稳定剂是聚乙烯醇；并且所述胰岛素分子选自由常规胰岛素和胰岛素类似 物。在一个实施方案中，所述肠溶包衣胶囊包含硬明胶胶囊、pH-敏感的包衣层 和阳离子纳米粒子，其中所述pH-敏感的包衣层选自由HP55和RL100。

本发明的第二个目的涉及制备肠溶包衣胶囊中包含的阳离子纳米粒子的方 法。在一个实施方案中，制备阳离子纳米粒子的方法包括形成内水相，所述内 水相包含浓度范围为5至10mg/mL的胰岛素溶液；形成油相，所述油相包含浓 度范围为20至50mg/mL的RS和PLGA的二氯甲烷溶液；形成外水相，所述 外水相包含作为稳定剂的浓度范围为1至10mg/mL的聚乙烯醇(PVA)溶液； 形成初乳液，所述初乳液包含体积为0.5至1mL的内部水相和体积为3至5mL 的油相，其中所述初乳液通过超声波以40至60w的功率范围处理30至60s 的时间范围来形成；形成复乳液，所述复乳液包含体积为3.5至6mL的初乳液 和体积为20至40mL的外水相，其中所述复乳液通过超声波以40至60w的 功率范围处理60至120s的时间范围而形成；通过将二氯甲烷从所述复乳液中 蒸发形成载有胰岛素的PLGA/RS纳米粒子；通过将PLGA/RS纳米粒子离心和 水洗三次形成纯化的载有胰岛素的PLGA/RS纳米粒子；通过冻干纯化的载有 胰岛素的PLGA/RS纳米粒子形成阳离子纳米粒子。所述冻干的纳米粒子准备 用于包封在肠溶包衣胶囊中或任何药学可接受的载体中用于以控释的方式口服 递送胰岛素。

本发明的第三个方面涉及制备用于口服胰岛素递送的包含本发明的阳离子 纳米粒子的肠溶包衣胶囊的方法。在一个实施方案中，所述方法包括提供空胶 囊；提供阳离子纳米粒子，其中每个纳米粒子包含RS、PLGA、和至少一种生 物活性剂；将所述阳离子纳米粒子填充至空胶囊中，其中阳离子纳米粒子的量 按一只大鼠、剂量为50IU/kg方式填充；将HP55(或任选地RL100)聚合物 包覆在胶囊的表面上，其中形成HP55层还包括制备浓度范围为40至80mg/mL 的HP55的二氯甲烷和丙酮溶液。

附图说明

图1显示载有胰岛素的阳离子纳米粒子的SEM图像。

图2显示在不使用胶囊的情况下在模拟的胃肠介质中阳离子纳米粒子的 胰岛素药物体外释放研究。

图3显示在使用胶囊的情况下在模拟的胃肠介质中阳离子纳米粒子的胰 岛素药物体外释放研究。

图4显示经口服给药的载有胰岛素的阳离子纳米粒子的肠溶胶囊对糖尿 病大鼠降血糖作用。

定义

I.胰岛素

术语“胰岛素”当在本文中使用时是指任何天然存在的或重组的胰岛素， 例如，胰岛素类似物和衍生物。可以使用来自任何合适物种的胰岛素，诸如人、 猪、牛、狗、羊。在优选的实施方案中，胰岛素是猪胰岛素。“常规胰岛素” 当在本文中被披露时可以指天然存在的胰岛素或合成的胰岛素分子。天然存在 的胰岛素或合成的胰岛素分子可以包括，但不限于，单体的、聚合的和/或纤丝 状胰岛素，并且胰岛素分子的不同形式取决于不同的pH值。

猪胰岛素是两条链的含有51个氨基酸的糖基化多肽链，其分子量为5,777 道尔顿。α和β链通过两个链间二硫键连接。α链含有链内二硫键。胰岛素调节 细胞对葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的摄取、利用和储存并且抑制糖原、蛋白质和 脂肪的分解。具有不同程度的生物活性的胰岛素可购买得到。例如，能够购买 低、中和速效形式的胰岛素。在优选的实施方案中，猪胰岛素的生物活性范围 为27至28IU/mg。

II.阳离子纳米粒子

当在本文中使用时，术语“阳离子纳米粒子”是指具有优选约250-400纳米， 典型地约250-300纳米的直径，且具有约+30mV～40mV的正表面电位的粒子。 阳离子纳米粒子具有许多性质包括但不限于粘膜粘附性和当作为胶囊或在包含 所述阳离子纳米粒子的另一种药学可接受的载体中施用于受试者时以控释方式 释放胰岛素的能力。

阳离子纳米粒子可以使用各种生物相容性聚合物制备，所述生物相容性聚 合物包括本领域中熟知的那些。合适的聚阳离子聚合物包括，但不限于，具有 季铵阳离子的Eurdragit RS聚合物，其永久带电荷，不依赖于其溶液的pH。术 语“阳离子”或“聚阳离子”当在本文中使用时，是指纳米粒子当悬浮在水溶 液中时的正ζ电位，其在pH＝7.0介质中典型地小于+8mV，并且在模拟的肠介 质中是可接受的。阳离子纳米粒子可以包含不同分子量和/或重量比的聚阳离子 聚合物和可生物降解的聚合物的共混物。优选的共混聚合物包括聚(羟酸)， 其包括聚乳酸、聚羟基乙酸和共聚物，尤其是聚乳酸羟基酸共聚物(PLGA)， PLGA可以在暴露于身体的环境后通过水解而被降解。

纳米粒子的制剂可以通过复乳溶剂挥发法来获得。超声乳化用来将聚合物/ 胰岛素乳液的大小减小到小于500纳米，优选低于300纳米。

III.肠溶包衣胶囊

当在本文中使用时，术语“肠溶包衣胶囊”是指包覆有允许在胰岛素被释 放前通过胃转移到达小肠的材料的胶囊。肠溶包衣聚合物的实例包括羟丙基甲 基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯 (HPMCAS)和RL100，且尤其是HP-55，它们可以容易地包覆在胶囊上并在肠 道上段的条件下溶解。

具体实施方式

实施例1

载有胰岛素的阳离子纳米粒子的制备

通过多重乳化技术进行纳米粒子的制备。简言之，首先将1mL胰岛素水溶 液(1mg/mL)在包含100mg聚合物(PLGA/Eudragit RS，50/50)的二氯甲烷(5 mL)中通过以40W的功率超声作用30s被乳化。得到的第一乳液然后倒入至40 mL聚乙烯醇水溶液(1％)中并以60W的功率超声作用1min，使得形成多重乳 液。在减压蒸发二氯甲烷后，通过以20,000rpm离心10分钟收集纳米粒子并洗 涤三次。在将得到的分散液在-20℃预冷冻过夜(纳米粒子和冷冻保护剂的浓度 分别为1％和1.5％)后，将此混合物然后进行真空冻干。

表1

△：观察到纳米粒子的沉淀/聚集。

研究并比较在不同浓度的海藻糖的存在下测试纳米粒子在冻干前/后的尺 寸和ζ电位，如表1中所示。在冻干前，每个纳米粒子的平均粒度为374.6±3.8 nm，ζ电位为37.9±2.2mV。在冻干后，不添加海藻糖的纳米粒子形成肉眼可见 的聚集体，导致Zetasizer无法测量到尺寸和ζ电位。在较低的海藻糖浓度范围 (＜1.0％)，随着浓度增加，纳米粒子的尺寸和多分散性由于冻结应力的减小 而显著减小。另外，当海藻糖浓度等于或大于1.5％时观察到尺寸和多分散性没 有显著变化。另一方面，已经发现在冻干前将海藻糖添加至PLGA/RS纳米粒 子悬浮液将正表面电荷从+37.9mV减小至大约+30mV。这可能是由于海藻糖 的羟基和纳米粒子的表面之间的氢键键合造成的。在低于0.25％的海藻糖浓度 下，大聚集体和ζ电位减小的原因是没有形成保持悬浮液的无定形基质。已经 证明在冻干期间1.5％或以上浓度的海藻糖更有效地用于稳定PLGA/RS纳米粒 子。

实施例2

载有胰岛素的阳离子纳米粒子的表征

通常，与微粒相比，纳米粒子具有较大的细胞摄取，并且由于其较小的尺 寸和较大流动性而更容易被较大范围的吸收利用。减小纳米粒子尺寸导致胰岛 素被肠细胞的吸收增加。在本发明中在多重乳液溶剂挥发法中研究了影响纳米 粒子尺寸的许多制剂和工艺参数，诸如超声作用时间、聚合物量、表面活性剂 浓度以及油相和外部含水相的体积，等。认为改变外部含水相的体积是调节本 发明的纳米粒子的尺寸的最简单方式。如表2中所示，减小外部含水相的体积 可以减小纳米粒子的尺寸并增加纳米粒子的ζ电位值。外部含水相的体积越小， 施加的超声作用的功率密度越大，导致较小的平均纳米粒子尺寸。另外，纳米 粒子的多分散性指数(PDI)的增加可能是由于在较大体积的外部含水相中超 声作用的不均匀的功率密度分布造成的。

表2

每个制备的PLGA/RS纳米粒子具有285.6±4.5nm的平均粒度，42.9±1.4 mV的正ζ电位。它们的胰岛素负载效率和负载含量为73.9％和6.7％，如表2 中所示。通过SEM和TEM分析的PLGA/RS纳米粒子的形态学显示在图1中。 优化的纳米粒子具有球体形状和均一的尺寸。

实施例3

在不同的pH条件下PLGA/RS纳米粒子的ζ电位

ζ电位值是重要的粒子特性，因为其可以影响GI条件下的纳米粒子稳定性 和粘膜粘附性两者。正ζ电位值可以促进粘膜粘附性。粘膜层本身处于中性pH 值，具有阴离子聚电解质。因此，纳米粒子上正电荷基团的存在可以引起粘膜 和粒子之间的电荷相互作用。如表3中所示，PLGA/RS纳米粒子的ζ电位值和 尺寸已经在1.2-7.2的pH范围内进行了研究，该pH范围模拟GI生理条件。显 然介质的pH值对纳米粒子的ζ电位值具有重要的作用。通常，RS聚合物中的 季铵阳离子是永久带电荷的，不依赖于其溶液的pH。胰岛素(PI＝5.4)在pH 1.2 下变成带正电荷的分子。理论上，载有胰岛素的PLGA/RS纳米粒子由于随着 酸性增加胰岛素的正电荷增加而具有较高的ζ电位值。尽管如此，PLGA/RS纳 米粒子的ζ电位从pH 2.5至1.2其正值将减小。此较小的正ζ电位可能归因于 在那些正电荷较多的纳米粒子上吸收的太多游离的PVA的存在，以及在强酸条 件下PVA层的屏蔽效应。纳米粒子的表面上的PVA层阻止纳米粒子的自聚集， 并且具有空间稳定效应。这通过酸性条件下(例如，pH＜6.0)纳米粒子的平均 粒度显示没有明显的改变来确认。在pH＞6.0的模拟肠介质的情况下，PLGA/RS 纳米粒子的ζ电位由于带负电荷的胰岛素以及增加的反离子的中和而减小，导 致纳米粒子的聚集。

对于PLGA/RS纳米粒子，粘膜粘附将导致纳米粒子由于表面正电荷而留 在胃中。另外，从与在pH＞6.6中相比在pH＝6.0-6.6介质中较高的ζ电位来看， PLGA/RS纳米粒子的粘膜粘附性在十二指肠的腔表面(pH 6.0-6.6)中可能要 好于在空肠(pH＝7.0)和回肠(pH＝7.4)中，因此粘附于十二指肠的纳米粒子 应该多于空肠和回肠。因此，为了减少PLGA/RS纳米粒子在胃中的存留，引 入肠溶包衣胶囊以填充实施例1中的冻干纳米粒子。另外，具有HP55 (pKa＝5.5)作为肠溶聚合物的胶囊可以保护粘附在肠上段中的PLGA/RS纳米 粒子，允许长时间地吸收胰岛素。

表3

实施例4

体外胰岛素释放研究

应用肠溶聚合物HP55以包覆硬明胶胶囊用于PLGA/RS纳米粒子在小肠中 的pH-依赖性靶向递送。具有HP55的肠溶包衣能够避免胰岛素与酸性胃液的接 触，但在小肠的中性环境中容易溶解。

在酸性和碱性pH环境下评价具有和没有HP55包衣胶囊的PLGA/RS纳米 粒子的体外胰岛素释放特性。如图2中所示，没有HP55包衣胶囊的PLGA/RS 纳米粒子显示不佳的pH-敏感性释放。在pH 1.2介质下在第一个1h内超过90％ 的胰岛素释放，而在pH 7.4介质下在1h内50％的胰岛素释放。胰岛素从 PLGA/RS纳米粒子的释放可以由溶胀-扩散过程调节。在较低的pH下，RS聚合 物由于排斥性静电相互作用而彼此排斥，产生溶胀的和可通透的聚合物基质。 这样，胰岛素(PI＝5.4)在pH 1.2下变成带正电荷的分子，并且与带正电荷的 RS聚合物之间形成排斥性静电相互作用，导致促进胰岛素的释放。相比，胰岛 素在肠介质中主要是带负电荷的，引起与带正电荷的聚阳离子聚合物的静电相 互作用。因此，在pH 7.4条件(例如PBS)下胰岛素从PLGA/RS纳米粒子的 部分不完全释放是由于通过静电相互作用而保留和吸收在纳米粒子中的部分胰 岛素引起的。

如图3中所示，在填充有PLGA/RS纳米粒子的HP55-包衣胶囊的情况下， 在pH 1.2中纳米粒子几乎保留在胶囊中，并且胰岛素的初始释放大幅度减少。 在pH 7.4下胰岛素从包含在胶囊中的PLGA/RS纳米粒子的释放与从PLGA/RS 纳米粒子直接释放相似，表明HP55-包衣胶囊对在口服施用本发明的肠溶包衣 胶囊的受试者的肠生理环境中胰岛素从纳米粒子的释放没有影响。

实施例5

在糖尿病大鼠中口服给药后包含阳离子纳米粒子的肠溶包衣胶囊的体内研究

图4显示在向糖尿病大鼠施用具有胶囊的胰岛素PLGA/RS纳米粒子后的 血糖水平-时间曲线。载有胰岛素的纳米粒子对血糖水平的作用通过与胰岛素的 皮下注射比较来显示。如期望的那样，在未治疗的对照组中观察不到降血糖作 用，表明在STZ-诱导的动物中稳定的糖尿病水平。

表4

数据表示为均值±SD，每组n＝3

T_max＝血液中最小相对葡萄糖浓度时的时间

C_min＝血液中最小相对葡萄糖浓度

如图4中所示，填充以PLGA/RS纳米粒子的胶囊(NP)的口服给药和胰 岛素溶液的皮下(SC)注射两者均显示在糖尿病大鼠中的显著降血糖作用。胰 岛素溶液的SC注射产生血糖水平的急剧下降(2h内90％)，在10h时逐渐恢 复至基础水平，而在口服施用肠溶包衣胶囊后降血糖作用较不显著，其产生较 慢且延长的血液葡萄糖水平的降低。糖尿病大鼠的血液葡萄糖水平在实验的前 4个小时期间稍有增加，可能是由于操作和采血期间的机体应激引起的。相对 于SC游离形式胰岛素，通过剂量校正的24h内AAC_0-24h测定，肠溶包衣胶囊 的降血糖作用和药理学利用度(PA)分别为32.9％和9.2％，如表4中所示。

如果需要，本文讨论的不同功能可以以不同的次序和/或彼此同时实施。此 外，如果需要，上述功能中的一种或多种可以是任选的或可以组合。

尽管在独立权利要求中展示了本发明的各个方面，但本发明的其他方面包 括来自所述实施方案和/或从属权利要求的特征与独立权利要求的特征的其他 组合，并且不仅仅是权利要求中明确描述的组合。

在本文中还需注意的是尽管上面描述了本发明的示例性实施方案，但这些 描述不应当被视做限制性的含义。而是，在不偏离所附权利要求中所限定的本 发明的范围的前提下可以做出数种变化和改动。