3-羟基-孕甾-21-(2′,5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮、其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种结构式I所示的甾体类化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮、其制备方法、包含该化合物的药物组合物及其在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种结构式I所示的甾体类化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮、其制备方法、包含该化合物的药物组合物及其在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。 

结构式I 

背景技术

神经退行性疾病(neurodegenerative diseases，ND)是一组以原发性神经元变性为基础的慢性、退行性神经系统疾病。该类疾病主要包括阿尔采末症(早老性痴呆，Alzheimer’s disease，AD)、血管性痴呆(vascular dementia，VaD)、帕金森氏症(Parkinson’s，PD)等。随着当今世界人口老龄化日益严重，神经退行性疾病的发病率日趋增高，其中发病率最高的是AD。科学家指出，2025年全球预计将有2200万AD患者，到2050年患者人数将达4500万。AD已成为老年人群中继心血管病、癌症、中风之后的第四大“杀手”。我国痴呆发病率与欧美国家接近，神经退行性疾病的老年患者已经超过500万例，其中AD占到2/3之多。本病已发展成为医疗保健系统的主要负担，并且为社会、患者及家属带来了沉重的精神和经济压力，将成为21世纪人类要应对的一场“公共健康危机”。 

大量的研究数据表明，神经退行性疾病是多病因、多环节的复杂综合症，在流行病学、病因学、病理学、发病机制及临床表现上均存在较大差异，迄 今为止确切的分子作用机制尚不清楚，为寻找理想的防治药物带来了很大的困难。然而，这些疾病的发生和发展存在明显的共性，越来越多的研究提示，氧化应激、机体的物质和能量代谢及其相关的信号通路均出现异常改变，这些异常现象在神经退行性疾病的发病进程中发挥了非常重要的作用。 

在多数神经退行性疾病(包括早老性痴呆(Alzheimer’s disease)、血管性痴呆(Vascular dementia)和帕金森症(Parkinson’s disease)等)中都能观察到活性氧自由基、羟自由基、超氧阴离子以及过氧化氢的过量生成。机体内通常存在抗氧化系统对抗氧化应激，然而在神经退行性疾病患者的中枢神经系统对氧化应激非常敏感，其对防御氧化应激的抗氧化酶作用相比别的组织差。AD的典型病理学特征之一老年斑的主要成分是β-淀粉样蛋白(Aβ)，大量体内外的研究结果提示Aβ具有明显的神经细胞毒性，与氧化应激、物质能量代谢、线粒体功能的缺损有密切联系，最终导致细胞内活性氧自由基的聚积，神经元死亡。而另一方面，氧化应激也进一步导致Aβ的聚积，最终加速AD的发病进程。在整体动物实验中证实，大鼠脑内注射Aβ能诱发空间学习记忆障碍。同样，PD患者脑内氧化应激、线粒体功能缺损以及兴奋性毒性可能是引起PD发病的诱因并介导了其发病过程。PD患者脑内出现过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基等活性氧过量生成，线粒体电子呼吸链复合物酶Complex I活性下降，而Complex I活性的下降导致机体活性氧水平的升高，最终导致脑内神经元细胞死亡。 

影响神经退行性疾病发生发展的另一共同诱因是机体物质和能量供应不足或者失衡，最主要的表现之一是血管性病变导致的氧糖供应缺乏以及其它物质能量代谢的失衡。神经退行性疾病的发生发展与老年人群的高发疾病包括糖尿病、肥胖、高胆固醇等这些外周糖脂代谢异常疾病的发病具有明显正相关性。临床研究也发现在神经退行性疾病发病早期，大脑糖利用和脑血流均出现明显下降，导致患者关键部位的微循环血流状态发生变化，限制了脑血流的代偿，使供给脑的氧气、葡萄糖等不足，导致神经元内的能量系统链的破坏，严重影响细胞内的线粒体功能致使三磷酸腺苷(ATP)的生成下降，该脑区能量供应不足，其下游的需能信号通路和生物功能受损，这一恶性循环最终导致神经系统物质能量代谢紊乱，引发神经退行性病变；此外，相当一部份数据提示从源头上遏制线粒体功能异常，调节机体异常糖代谢、脂肪/ 胆固醇代谢的药物在神经退行性疾病的治疗过程中都起到了一定的改善作用，提示调节物质能量代谢可能是有效的干预策略。 

上述研究表明，氧化应激、物质能量缺乏/失衡以及β淀粉样蛋白毒性在在AD等神经退行性疾病的发病过程中发挥了重要作用。而事实上，针对氧化应激、氧糖缺乏、淀粉样蛋白毒性的化合物在治疗神经退行经疾病中也取得可喜的进展，其中包括靶向性作用于线粒体的药物MitoQ已经开始了II期临床研究。因此，从化合物的抗氧化以及改善机体物质能量供应缺乏或者失衡活性入手，有可能开发出新型、有针对性的治疗神经退行性疾病的药物或药物候选物。 

甾体类化合物是动物及植物体内一类重要的化合物，并且在医药化学中被广泛的应用。近年来研究发现甾体类化合物如孕烯醇酮、孕酮等对衰老、记忆和行为等活动具有调节作用，在中枢神经调剂中所起的作用越来越被人们所重视。天然或人工合成甾体如17β-烷氧基雌甾-1，3，5(10)-三烯-3-醇(J.Med.Chem.2001，44，110)、7α-[(4R，8R)-4，8，-12-三甲基十三烷基]雌甾-1，3，5-三烯-3，17β-二醇(J.Med.Chem.2007，50，4471)、22R-羟基胆固醇(SP222)、(22R，25R)-20α-螺甾-5-烯-3β-己酸酯(SP233)(Steroids 2004，69，1.；Steroids2006，72，725)及螺-环氧神经类固醇衍生物(J.Med.Chem.2009，52，6569)等都被证明具有神经保护作用。因而通过简单方法制备具有神经保护作用的甾体类化合物在制备预防和或治疗神经退行性疾病的药物方面具有广泛的前景。 

本发明人经过对大量的海洋天然产物及其结构修饰单体化合物的筛选，发现了一种结构相对简单、具有良好神经细胞保护作用和认知功能障碍改善作用的新化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮。 

迄今为止，未见关于3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮结构、制备方法及用途的报道。本发明涉及的3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮为一种新化合物，发现其具有显著的神经细胞保护作用和认知功能改善能力，由此可能对神经退行性疾病具有预防和/或治疗作用，从而在制药领域具有潜在的用途。 

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种如下结构式I所示的化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮： 

结构式I 

本发明的另一目的是提供本发明化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮的制备方法。所述制备方法主要通过如下的步骤实现： 

式II所示的化合物在碱的作用下与2，5-二甲氧基苯甲醛反应生成结构式I所示的化合物，其中，反应中所用的碱可为氢氧化钠、氢氧化钾、C1-C4的醇钾、C1-C4的醇钠或其混合物，反应中所用的溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、水或其混合物，该反应温度为0℃～100℃，反应时间为12～48小时。 

其反应式为： 

式II                          结构式I， 

其中，R¹为氢或C1-C4的酰基。 

本发明的再一目的是提供本发明化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。通过体外多个神经细胞损伤模型和体内学习记忆障碍模型测试实验中，本发明人首次发现该化合物能够显著改善β-淀粉样蛋白、过氧化氢、氧糖缺乏诱发神经细胞损伤，而且能显著改善东莨菪碱诱发的小鼠学习记忆障碍，显示该化合物可以为研究和开发新型神经退行性疾病药物提供先导化合物或者候选化合物。所述神经退行性疾病包括早老性痴呆(Alzheimer’s disease)，血管性痴呆(vascular dementia)，帕金森症(Parkinson’s disease)等。 

本发明还可以进一步提供一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的具有结构式I所示的3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮和药学上可接受的载体。 

本发明的包含3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮的药物组合物采用一般的药用片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液制剂配制方法制得。 

附图说明

图1为3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮对Aβ诱发细胞损伤的保护作用，图中数值为平均值±标准差，^##P＜0.01相比于正常对照组，^**P＜0.01相比于Aβ损伤组； 

图2为3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮对过氧化氢(H₂O₂)诱发SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，图中数值为平均值±标准差，^##P＜0.01相比于正常对照组，^*P＜0.05，^**P＜0.01相比于过氧化氢(H₂O₂)损伤组； 

图3为3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮对氧糖缺乏诱发SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，图中数值为平均值±标准差，^##P＜0.01相比于正常对照组，^**P＜0.01相比于氧糖缺乏损伤组； 

图4为3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮对东莨菪碱诱发小鼠学习记忆障碍的改善作用，^##P＜0.01相比于正常对照组，^*P＜0.05， ^**P＜0.01相比于东莨菪碱损伤组。 

具体实施方式

以下实施例有助于理解本发明，但本发明不限于实施例。 

实施例1结构式I所示化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮的制备 

式II-1                   结构式I 

将500mg式II-1的化合物溶于20ml甲醇中，0℃下加入1.2摩尔当量的2，5-二甲氧基苯甲醛和100mg氢氧化钾，搅拌24h，加80ml水后，加10％HCl中和至pH值～6，过滤，滤出物用水洗，晾干，得黄色固体化合物为结构式I所示的化合物，产率90％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.83(d，1H)，7.07(d，1H)，6.92-6.78(m，3H)，5.34(d，1H)，3.83(s，3H)，3.78(s，3H)，3.52(m，1H)，0.98(s，3H)，0.63(s，3H).ESI-MS：465.4[M+H⁺]。 

实施例2：体外药理试验1(化合物对Aβ诱导SH-SY5Y胞损伤的作用) 

实验目的： 

观察3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮对Aβ诱发SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 

实验方法： 

SH-SY5Y购自美国国立细胞库，采用含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的MEM/F12培养基，于37℃、5％ CO₂饱和湿度的培养箱中常规培养。以2×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。Aβ处理：换以无血清的MEM/F12，同时加入不同浓度的结构式I所示的化合物(1-10μM)，培养2小时后加入终浓度10μM的Aβ，继续培养24小时后，加入MTT(终浓度0.5mg/ml)，正常条件下培养3小时后，在490nm波长下检测吸光度值的变化。 

实验结果： 

研究结果显示，3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮在5和10μM时对Aβ诱发的SH-SY5Y细胞损伤具有显著改善作用(参见图1)。 

实施例3：体外药理试验2(受试化合物对H₂O₂诱导细胞损伤的作用) 

实验目的： 

观察3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮对H₂O₂诱发SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 

实验方法： 

将SH-SY5Y(ATCC)细胞置于5％ CO₂的37℃恒温培养箱中培养。培养液为MEM/F12(1∶1)，并添加10％FBS。每3-4天更换一次培养液。细胞融合率为80％左右时，用0.125％胰蛋白酶消化，按1∶2的比例传代。取稳定生长 的SH-SY5Y细胞，以1×10⁵个/ml密度接种于96孔板内，100μl/孔，于5％ CO₂的37℃恒温培养箱培养约24小时。更换新鲜的培养液，并将细胞分为正常对照组、H₂O₂损伤模型组、化合物预处理组。化合物预处理组分别应用0.1μM、1μM、5μM、10μM的结构式I所示的化合物预处理2小时，然后加入H₂O₂(终浓度100μM)，对照组在相同的培养基中加入相同浓度的H₂O₂培养24小时。然后根据MTT法评估每组的细胞存活率，即24小时后加入MTT(终浓度0.5mg/ml)，37℃继续培养4小时，弃液，加入DMSO(100％)，100μl/孔，振荡5min充分溶解结晶染料，酶标仪测定吸光度(测定波长490nm)。注：存活的细胞能与MTT发生氧化还原反应产生甲臢(蓝紫色结晶)，后者的生成量与活细胞的数量成正比，该结晶能为DMSO所溶解，在波长490nm处检测。 

实验结果： 

细胞存活率的结果如图2所示。通过图2研究发现3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮在0.1-10μM浓度时能明显改善过氧化氢导致的细胞活力损伤。 

实施例4：体外药理试验3(受试化合物对氧糖缺乏模型诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用) 

实验目的： 

观察3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮对氧糖缺乏诱发SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 

实验方法： 

将SH-SY5Y(ATCC)细胞置于5％ CO₂的37℃恒温培养箱中培养。培养液为MEM/F12(1∶1)，并添加10％FBS。每3-4天更换一次培养液。细胞融合率为80％左右时，用0.125％胰蛋白酶消化，按1∶2的比例传代。取稳定生长的SH-SY5Y细胞，以1×10⁵个/ml密度接种于96孔板内，100μl/孔，于5％ CO₂的37℃恒温培养箱培养约24小时。将细胞分为正常对照组、氧糖缺乏模型组、受试化合物组。正常对照组用EBSS(含糖)缓冲液洗一遍，换成DMEM(低糖)培养液；OGD(氧糖缺乏处理)损伤模型组和受试化合物组用EBSS(无糖)洗一遍，换成DMEM(无糖)培养液。加入受试化合物(终浓度1μM、5μM、10μM的结构式I所示的化合物)，放入OGD专用密闭盒内，通入95％N₂、5％CO₂的混合气体，37℃恒温培养箱内，缺氧缺糖1小时，之 后恢复正常的培养条件再培养24小时；期间，正常对照组细胞仍置于正常培养环境下培养。然后根据MTT法评估每组的细胞存活率，即24小时后加入MTT(终浓度0.5mg/ml)，37℃继续培养4小时，弃液，加入DMSO(100％)，振荡5分钟充分溶解结晶染料，酶标仪测定吸光度(测定波长490nm)。注：存活的细胞能与MTT发生氧化还原反应产生甲臢(蓝紫色结晶)，后者的生成量与活细胞的数量成正比，由此可以确定细胞活力。该结晶能为DMSO所溶解，在波长490nm处检测。 

实验结果： 

细胞存活率结果如图3所示，结果发现1μM和5μM的本发明化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮能够明显改善氧糖缺乏诱导的细胞损伤。 

实施例5：整体动物药理试验(3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮改善动物记忆障碍的作用) 

本试验采用胆碱能受体拮抗剂——东莨菪碱诱发小鼠学习记忆障碍，用通道式迷宫评价学习记忆能力，对3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮的促智药效学进行了评价。 

ICR小鼠(雌雄各半，体重18～22g，由中国科学院上海实验动物中心提供)随机分组。利用通道式水迷宫对小鼠进行学习记忆训练，水迷宫内设置有4个非出口通道(盲端)，终点设有平台。将小鼠从起始点面朝壁轻放入水中，同时开始记录小鼠游抵平台的时间及到达平台前进入盲端的次数。训练时若小鼠60秒内未游抵平台，则用直尺将其引入正确的路径至平台，并在平台上停留30秒。每天训练2次，连续训练4天，对学习较慢小鼠进行适当的强化训练.。第4天训练完毕后筛选出最后3次达到平台时间均低于30秒，进入盲端的次数均少于4次的小鼠，随机分组。第5天进行给药测试，口服给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg不同剂量化合物和模型组给予等量的溶剂对照，40分钟后，腹腔注射剂量为4.5mg/kg的东莨菪碱(对照组给予蒸馏水)，20分钟后测定水迷宫成绩，以其游抵平台的时间(即潜伏期，超过60秒的按60秒计算，如图4A所示)和错误次数(进入盲端的次数，以图4B所示)作为评价指标。 

实验结果： 

研究发现本发明的化合物3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮能明显减少小鼠找到平台的潜伏期(图4A)，并且减少记忆错误的次数(图4B)，具有明显的记忆改善作用。 

由此可见，本发明的3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮具有显著的神经细胞保护作用和学习记忆改善能力，并且毒性小(在0.5g/kg的时未出现毒性)，综合药理、化学、安全性的数据，提示3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮成药性好，通过进一步的药效学、安全性以及药代动力学评价，将有望成为新一代预防和/或治疗神经退行性疾病的候选药物。本发明涉及的3-羟基-孕甾-21-(2′，5′-二甲氧基)苯亚甲基-5-烯-20-酮及其上述药理活性未见报道，其优良的神经细胞保护活性更具有特殊重要的意义。 

以上以具体的实施例来举例说明本发明化合物的制备步骤、鉴定过程和药理实验过程，但对本领域的技术人员来说可以对此作出种种修改和变化，在不背离本发明的精神和范围的情况下，所附的权利要求书覆盖本发明范围内的所有这些修改。