抗肿瘤多肽及其在抗肿瘤领域的应用

摘要

本发明公开了抗肿瘤多肽及其在抗肿瘤领域的应用。本发明提供了一种多肽，为如下1)‑4)中任一种：1)包括氨基酸序列是序列表中序列1所示多肽；2)氨基酸序列是序列表中序列1所示的多肽；3)在1)或2)的N端或/和C端连接标签得到的融合多肽；4)将1)或2)所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抗肿瘤功能的多肽。本发明提供了一种能有效杀伤细胞的多肽片段，具有很低的IC

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及抗肿瘤多肽及其在抗肿瘤领域的应用。

背景技术

抗肿瘤多肽(Anticancer Peptides,ACPs)是一类由几十个氨基酸残基组成，具有两亲性(亲水性与疏水性)并带正电荷的短肽，具有杀伤肿瘤细胞的活性。因其具有毒副作用小、不易产生耐药和免疫反应低等显著优点，已成为抗肿瘤药物研究的热点之一。抗肿瘤多肽数据库CancerPPD(http://crdd.osdd.net/raghava/cancerppd/)上收集的具有抗肿瘤活性的多肽已有3491种，涉及21种组织和249种肿瘤细胞系，部分ACPs已经进入临床试验。

抗肿瘤多肽作用于细胞的最主要方式是裂解细胞膜。天然抗肿瘤肽Polybia-MPI、铃蟾肽、合成肽BTM-P1等都是以膜裂解的方式作用于多种肿瘤细胞。以膜裂解的方式杀死细胞作用时间短，且多肽不需要进入到细胞内，不易产生耐药。另一种作用方式是破坏线粒体膜从而引发线粒体途径诱导的细胞凋亡。Eliassen等人发现牛乳铁蛋白肽LFcinB通过破坏线粒体膜诱导神经胶质瘤细胞凋亡，并在异体移植的小鼠体内得到验证。豹毒素则通过作用于线粒体，激活caspase3而诱导鳞状细胞癌细胞凋亡。还有一种有趣的作用方式是激活细胞的免疫反应，多肽LTX-315能使细胞发生免疫原性死亡，并能产生一种持续的长久效应可防止再次发生同一种肿瘤的恶化。

天然抗肿瘤肽存在一些明显的缺陷，比如溶血性高，肿瘤细胞特异性识别能力不强，所以天然抗肿瘤肽的应用受到很大的限制。基因治疗的概念在1972年由Frideman和Roblin首先提出，它以改变生物遗传物质为基础，目前被广泛应用于多种疾病的治疗。

基因治疗的生物靶向主要包括病毒载体靶向、受体结合型靶向和阳离子脂质体载体等几种方法。病毒载体靶向是利用具有双亲性的桥连分子协助腺病毒和逆转录病毒载体靶向转导，也可以通过编码病毒衣壳蛋白或包膜蛋白的操纵子进而实现其基因序列的改变，产生带有结构不同的表面蛋白的病毒微粒，来实现靶向基因转移；受体介导基因转移常见于非病毒基因的转移，是利用细胞膜表面存在的受体特异性识别其相应的配体，待二者结合后通过内吞作用，将结合于配体的目的基因或载基因质粒定向导入肿瘤细胞内；阳离子脂质体对带负电荷的DNA有很好的结合能力，可以很好地结合目的基因，并且在其包裹目的基因后，可以保护目的基因免受溶酶体等的降解。由于这些生物靶向载体的靶向性并不是根据肿瘤细胞的特性设计的，所以在肿瘤治疗上并没有明显优势，而利用肿瘤特异性启动子设计的靶向载体可以很好地弥补这一不足。端粒是位于真核生物染色体线性DNA分子末端的结构，在染色体末端呈膨大颗粒状，由一段重复的非转录序列与多种蛋白结合共同组成，其作用是保持染色体完整性及控制细胞周期。端粒的延长或缩短受端粒酶调节，端粒酶的活性随细胞分化而被抑制。近年来，端粒酶在细胞永生化和癌症发生中所起的作用引起了广泛关注，在永生化细胞系和85％以上的人肿瘤组织中都呈现高表达，而在大多数正常体细胞中未见表达，从而使得端粒酶作为肿瘤特异性标记物成为肿瘤基因治疗的新靶点。

发明内容

为了能够有效杀伤细胞，且构建能在肿瘤细胞中特异表达并杀死肿瘤细胞、对机体安全的非病毒的重组质粒，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种多肽，为如下1)-4)中任一种：

1)包括氨基酸序列是序列表中序列1所示多肽；

2)氨基酸序列是序列表中序列1所示的多肽；

3)在1)或2)的N端或/和C端连接标签得到的融合多肽；

4)将1)或2)所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有抗肿瘤功能的多肽。

编码上述多肽的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下(a1)-(a6)中任一种所示的DNA分子：

(a1)编码区包括序列表中序列2的DNA分子；

(a2)编码区包括序列表中序列3的DNA分子；

(a3)编码区为序列表中序列2的DNA分子；

(a4)编码区为序列表中序列3的DNA分子；

(a5)与(a1)-(a4)中任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述多肽的DNA分子；

(a6)在严格条件下与(a1)-(a4)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码上述多肽的DNA分子。

含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述核酸分子插入表达载体，得到的载体。

上述重组载体中，所述表达载体中含有肿瘤特异启动子；

或所述肿瘤特异hTERT启动子为hTERT启动子；

或所述重组载体中驱动上述的核酸分子的表达的启动子为肿瘤特异启动子。

上述多肽或上述核酸分子，或，上述表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在如下1)-6)至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)制备治疗、抑制和/或抗肿瘤产品；

2)制备杀伤或致死肿瘤细胞产品；

3)制备使肿瘤细胞释放LDH产品；

4)制备破坏肿瘤细胞的细胞膜结构产品；

5)制备提高肿瘤细胞中Caspase8、Caspase9、剪切的PARP和/或Bax的表达量产品；

6)制备降低肿瘤细胞中总PARP的表达量产品。

本发明另一个目的是提供一种制备治疗、抑制和/或抗肿瘤产品的方法。

本发明提供的方法，为单独包装上述多肽或上述重组载体。

上述中，所述肿瘤为肝癌、食管癌、乳腺癌和/或神经母细胞瘤。

上述中，所述产品为药品或试剂盒。

本发明的实验证明，本发明提供了一种能有效杀伤细胞的多肽片段，具有很低的IC₅₀值，同时与含有hTERT启动子的肿瘤特异表达载体连接，使多肽片段能在肿瘤细胞特异高效表达并杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有影响，解决了很多多肽类药物不具有细胞选择性的问题。因此本发明构建的重组质粒将成为一种潜在的颇具前景的基因治疗药物。

附图说明

图1为多肽KK-63的生物信息学分析结果；图1A是使用NPS@(Network proteinSequence@nalysis)系统中基于神经网络算法的HNN法，预测多肽KK-63的α-螺旋、β-折叠等基本二级结构的含量；图1B是利用在线工具ProtScale评估多肽KK-63氨基酸序列的疏水性/亲水性。

图2为用3.5μM多肽处理MCF-7，TE-1，HepG2，HL-7702等细胞5小时细胞形态变化。

图3为用0，0.5，1，2，4，6，8，10μM KK-63处理MCF-7，TE-1，HepG2，HL-7702等细胞24小时细胞活性变化。

图4为用3.5μM多肽处理MCF-7，TE-1，HepG2，HL-7702等细胞0，0.5，1，2，4，6小时细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)相对含量。

图5为重组质粒pcTERT-KK-63-1/KK-63-2重要结构元件及其位置。

图6为在MCF-7，TE1，HepG2，HL-7702等细胞中瞬时转染pc-hTERT-KK-63-1/KK-63-2质粒72小时，细胞形态变化。

图7为在MCF-7，TE1，HepG2，HL-7702等细胞中瞬时转染pc-hTERT-KK-63-1/KK-63-2质粒72小时，细胞活性变化。

图8为在MCF-7，TE1，HepG2，HL-7702等细胞中瞬时转染pc-hTERT-KK-63-1/KK-63-2质粒72小时，凋亡相关蛋白的表达及活性变化。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、多肽KK-63的筛选

1、计算机模拟合成多肽并检测相关参数选择合适的多肽片段

以已知细胞穿孔肽的特点为设计依据，通过计算机模拟设计，选取得分最优的8条多肽，通过化学法合成获得纯化的多肽后，进行生物活性筛选，即使用不同浓度的杂合肽作用于肝癌细胞系HepG2(HB-8065^TM，ATCC，美国)，食管癌细胞系TE-1(TCHu>HTB-22D^TM，美国模式培养物保藏所，美国)，及肝细胞系HL-7702(GNHu>50值都很低。同时通过乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(Roche，美国)检测LDH释放量，对细胞膜的完整性进行评估发现，KK-63破坏细胞膜完整性的作用最强。因此，筛选得到一段64个氨基酸残基构成的多肽KK-63为目的肽，其氨基酸序列为序列表中序列1。

2、生物信息学技术分析

通过ProtParam在线计算蛋白质物理化学性质参数，如相对分子质量、等电点、GRAVAY(Grand average of hydronathicity)疏水性指数，不稳定指数等(表1)。

表1

结果显示多肽KK-63相对分子质量为7503.14，等电点为12.85，疏水性指数为-0.232，说明该多肽具有亲水性，不稳定指数为34.19，脂溶性指数为120.63。

使用NPS@(Network protein Sequence@nalysis)系统中基于神经网络算法的HNN法，预测α-螺旋、β-折叠等基本二级结构(图1)，分析可知，α-螺旋率为73.02％，无规则卷曲占二级结构构象的26.98％，说明KK-63的二级结构主要是α-螺旋。

利用在线工具ProtScale评估多肽KK-63氨基酸序列的疏水性/亲水性(图1)，结果显示，KK-63存在很明显的两极性，即两端分别富含亲水性与疏水性氨基酸，符合阳离子抗肿瘤肽的结构特点。

多肽KK-63通过化学合成制备。

实施例2、构建含hTERT启动子和kk-63多肽编码核酸的重组质粒

将KK-63多肽得氨基酸序列以人源优先密码子反翻译成192nt的DNA序列kk-63-1(序列2，序列2不带有HindIII和XbaI酶切位点)，并参照Kozak序列特点，在起始密码子ATG后添加甘氨酸密码子GGC，得到一个195nt的DNA序列kk-63-2(序列3，序列3上不带有HindIII和XbaI酶切位点)，在kk-63-1和kk-63-2DNA 5’端加上HindIII酶切位点，3’端加上XbaI酶切位点后，在生工生物工程(上海)股份有限公司(上海，中国)合成。

肿瘤特异表达重组载体pcTERT含有增强子和hTERT启动子(序列4；序列4是hTERT启动子)。

用限制性内切酶HindIII和XbaI(Takara，中国)分别对载体pcTERT(制备方法记载在CN201810543497.X，公开号为108715368A)、kk-63-1,kk-63-2序列进行双酶切，分别纯化回收后，用T4DNA连接酶(Takara，中国)将酶切后的kk-63-1和酶切后的kk-63-2连入载体pcTERT的HindIII和XbaI间中，得到pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2重组质粒(图5)。

重组质粒pcTERT-KK-63-1为用序列表中序列2所示的kk-63-1DNA分子替换载体pcTERT中HindIII和XbaI酶切位点间的DNA分子得到的质粒，且由hTERT启动子驱动kk-63-1的表达；

重组质粒pcTERT-KK-63-2为用序列表中序列3所示的kk-63-2DNA分子替换载体pcTERT的HindIII和XbaI酶切位点间的DNA分子得到的质粒，且由hTERT启动子驱动kk-63-2的表达。

上述双酶切体系及反应参数：

酶连体系及反应参数：

实施例3、多肽KK-63对细胞的毒性作用检测

1、多肽KK-63对细胞形态变化的影响

(1)取对数生长期MCF-7，TE-1，HepG2，和HL-7702细胞，胰酶消化后，用高糖细胞培养基(Corning，美国)将HepG2，TE-1，MCF-7稀释成125000个/ml的细胞悬液，将HL-7702稀释成150000个/ml的细胞悬液，以2ml/孔接种于6孔板，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养12小时，让细胞贴壁；

(2)多肽处理细胞

实验组：将合成的多肽KK-63粉末用DMSO(Sigma，美国)溶解配制成10mM的储存液，并用培养基稀释成3.5μM的浓度，替换细胞原有的培养基。

对照组(正常状态)：给以等量的DMSO。

处理5小时后，观察细胞形态变化并拍照。

结果如图2所示，可以看出，KK-63处理以上4种细胞5小时，细胞形态明显改变，细胞结构不完整，出现很多细胞碎片，大量细胞死亡。

2、多肽KK-63对细胞活性作用检测

(1)取对数生长期HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞，胰酶消化后，HepG2，TE-1，MCF-7稀释成50000个/ml的细胞悬液，HL-7702稀释成80000个/ml的细胞悬液，以100μl/孔接种于96孔板，每组4复孔，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养12小时，让细胞贴壁；

(2)多肽KK-63处理

实验组：将合成的多肽KK-63粉末用DMSO溶解配制成10mM的储存液，并用培养基稀释成0.5μM，1μM，2μM，4μM，6μM，8μM和10μM的7个不同浓度，用含多肽的培养基替换原有的培养基；

对照组：给以与最高浓度组等量的DMSO；

(3)不同浓度KK-63处理细胞24小时后，弃掉原培养基，每孔加入含20μl细胞活性检测试剂(Promega，美国)的培养基，37℃避光孵育2小时，酶标仪(Biotek，美国)检测490nm波长处的吸光值；

用以下公式计算细胞存活率：细胞的存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％，并用SPSS软件计算KK-63对不同细胞的IC₅₀值。

结果如图3所示，KK-63作用24小时能明显抑制多种恶性肿瘤细胞活性，IC₅₀值均低于6，说明多肽KK-63具有很强的肿瘤细胞杀伤作用。

3、多肽KK-63对细胞毒性作用检测

(1)取对数生长期HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞，胰酶消化后，用细胞培养基将HepG2，TE-1，MCF-7稀释成50000个/ml的细胞悬液，HL-7702稀释成80000个/ml的细胞悬液，以100μl/孔接种于96孔板，每组4复孔，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养12小时，让细胞贴壁；

(2)处理

实验组：以含1％血清(Gibco，美国)的高糖培养基将KK-63稀释成3.5μM并处理5种细胞，

阳性对照组：用含1％Triton X-100(Genview，美国)的高糖培养基处理5种细胞；

阴性对照组：给与KK-63等量的DMSO处理5种细胞；

(3)检测

分别在0.5，1，2，4，6小时收取100μl上清，用LDH检测试剂盒检测不同时间点细胞培养上清中乳酸脱氢酶的含量，每个样品加入100μl检测试剂后，常温避光孵育30分钟，酶标仪检测450nm和560nm波长处的吸光值；

用以下公式计算KK-63对细胞的相对毒性：阳性对照吸光值-阴性对照吸光值/实验组吸光值-阴性对照吸光值×100％。

结果如图4所示，可以看出，KK-63对多种恶性肿瘤细胞的相对毒性作用在1小时内就达到了最大值(100％)，LDH的释放可指示细胞膜破裂，KK-63能在短时间内使细胞释放大量LDH，说明KK-63能快速破坏细胞膜结构。

实施例4、重组质粒pcTERT-KK63-1和pcTERT-KK-63-2在肿瘤细胞及正常细胞中的活性作用检测

1、重组质粒pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2对肿瘤细胞及正常细胞的形态变化影响

(1)取对数生长期MCF-7，TE-1，HepG2，和HL-7702细胞，胰酶消化后，HepG2，TE-1，MCF-7稀释成125000个/ml的细胞悬液，HL-7702稀释成150000个/ml的细胞悬液，以2ml/孔接种于6孔板，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养12小时，让细胞贴壁；

(2)重组质粒作用细胞

实验组：将重组质粒pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2分别用脂质体转染试剂(Invitrogen，美国)瞬转入上述(1)培养的HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞中；

对照组：将空载体pcTERT用脂质体转染试剂瞬转入上述(1)培养的HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞中；

转染72小时后，观察细胞形态变化，并拍照。

结果如图6所示，转染pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2质粒72小时可明显改变HepG2，TE-1和MCF-7等肿瘤细胞的形态，细胞形态皱缩，出现死亡，而转染对照组质粒对细胞形态没有明显影响，重要的是，转染重组质粒对正常细胞HL-7702的形态也没有明显影响。

2、重组质粒pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2对肿瘤细胞及正常细胞的活性抑制作用检测

(1)取对数生长期HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞，胰酶消化后，HepG2，TE-1，MCF-7以1×10⁵个/孔的密度，HL-7702以1.5×10⁵个/孔的密度接种于12孔板，以1ml/孔的培养基在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养12小时让细胞贴壁；

(2)重组质粒作用细胞

实验组：将重组质粒pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2用脂质体转染试剂瞬转入HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞中；

对照组：转染空载体pcTERT用脂质体转染试剂瞬转入HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞中；

转染72小时后，吸弃培养基，每个孔加入含20μl细胞活性检测试剂的100ml培养基，37℃避光孵育2小时，酶标仪检测490nm波长处吸光值；

(3)用以下公式计算细胞存活率：细胞的存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％。

结果如图7所示，可以看出，重组质粒pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2瞬转肿瘤细胞72小时后，与对照组相比，细胞活性明显被抑制，说明kk-63序列在肿瘤细胞中能表达，并且其表达产物具有杀伤肿瘤细胞的活性。而在正常肝细胞系HL-7702中，并没有检测到kk-63对其活性的作用。

说明重组质粒能在肿瘤细胞中特异性启动kk-63序列表达，并杀伤肿瘤细胞。

3、重组质粒pcTERT-KK-63-1和pcTERT-KK-63-2对肿瘤细胞及正常细胞凋亡的影响

(1)取对数生长期HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞，胰酶消化后，HepG2，TE-1，MCF-7以1×105个/孔的密度，HL-7702以1.5×105个/孔的密度接种于12孔板，以1ml/孔的培养基在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养12小时让细胞贴壁；

(2)重组质粒处理

实验组：将重组质粒pc-hTERT-KK-63-1和pc-hTERT-KK-63-2用脂质体转染试剂瞬转入HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞中，

对照组：将转染空载体pc-hTERT用脂质体转染试剂瞬转入HepG2，TE-1，MCF-7和HL-7702细胞中。

转染72小时后，吸弃培养基，用细胞裂解液刮下细胞并反复冻融三次，离心，提取上清中的蛋白；

(3)通过蛋白免疫印迹法检测凋亡相关Caspase家族蛋白活化情况，及PARP，Bcl2，Bax等蛋白的表达。

结果如图8所示，从蛋白免疫印迹结果可知，kk-63-1和kk-63-2序列在肿瘤细胞内表达后，Caspase8,9(Abclonal，中国)都明显被活化，总的PARP(ThermoFisherScientific，美国)表达量下调，剪切的PARP表达量上升，Bax(Cell SignalingTechnologies，美国)的表达量也上调，但是在正常细胞HL-7702中，这些蛋白的活化和表达并没有明显改变。

这些结果说明，肿瘤细胞能特异性启动hTERT启动子并表达kk-63-1和kk-63-2序列，表达的多肽在肿瘤细胞内可促进细胞发生凋亡。

以上所述为本发明相关实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>吉林大学

<120>抗肿瘤多肽及其在抗肿瘤领域的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Lys Lys Arg Leu Leu Arg Gly Arg Leu Leu Arg Ile Lys Lys Ile

1 5 1015

Leu Ser Leu Ile Gly Gly Leu Leu Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile

202530

Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Trp Lys Lys Phe Gly Gly Arg Trp

354045

Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys Lys

505560

<210> 2

<211> 198

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

accatgaaga agagactgct gagaggcaga ttgctgagaa tcaagaagat cctgagcctg 60

atcggcggcc tgctgaagtg gaagctgttc aagaagatcg gcatcggcaa gttcctgcac 120

agctggaaga agttcggcgg cagatggggc ctgcagttcc ccgtgggcag agtgcacaga 180

ctgctgagaa agaagtaa 198

<210> 3

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

accatgggca agaagagact gctgagaggc agattgctga gaatcaagaa gatcctgagc 60

ctgatcggcg gcctgctgaa gtggaagctg ttcaagaaga tcggcatcgg caagttcctg 120

cacagctgga agaagttcgg cggcagatgg ggcctgcagt tccccgtggg cagagtgcac 180

agactgctga gaaagaagta a 201

<210> 4

<211> 378

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc 60

cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg ggctcccagt ggattcgcgg gcacagacgc 120

ccaggaccgc gcttcccacg tggcggaggg actggggacc cgggcacccg tcctgcccct 180

tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc gtcccgaccc ctcccgggtc 240

cccggcccag ccccctccgg gccctcccag cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc 300

tctcctcgcg gcgcgagttt caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg 360

gccccggcca cccccgcg 378